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基于紫杉醇的靶向脂质纳米颗粒的抗增殖和细胞凋亡触发潜力,通过转铁蛋白受体增强细胞内化——白血病细胞研究

摘要

白血病是一种典型的血癌,其特征是白细胞大量复制和增殖。本研究的主要目的是开发负载 PTX 的多功能纳米颗粒并靶向白血病细胞。在本研究中,制备了转铁蛋白修饰的紫杉醇脂质纳米颗粒 (TPLN),旨在提高白血病细胞的化疗疗效。结果清楚地表明,与载有紫杉醇的纳米颗粒 (PLN) 相比,TPLN 对 HL-60 癌细胞具有更好的靶向潜力。具体而言,与 PLN 相比,TPLN 在癌细胞中显示出显着更高的细胞毒作用,表明 Tf 修饰的纳米颗粒系统具有卓越的靶向效率。 TPLN 的 IC50 值为 0.45 μg/ml,而 PLN 的 IC50 值为 2.8 μg/ml。 TPLN 诱导了癌细胞的最显着的细胞凋亡,并且大部分细胞因大量的凋亡小体形成而扭曲。重要的是,TPLN 显示活细胞比例显着降低至~ 65%,大约~ 30% 的凋亡细胞(早期和晚期凋亡)。总的来说,结果清楚地表明了配体偶联脂质纳米颗粒系统对白血病细胞的靶向潜力,可能为成功治疗癌症铺平道路。

背景

白血病是一种典型的以白细胞大量复制和增殖为特征的血癌[1]。因此,白血病严重影响淋巴系统和骨髓并导致一些患者的高死亡率。异常的造血干细胞会导致骨髓中不受控制的增殖,并导致产生未成熟的 WBC [2, 3]。化疗是本病最优选的治疗选择;然而,大多数化疗药物并没有产生治疗效果,并且对正常组织造成严重的毒性[4, 5]。因此,立即治疗白血病对于癌症患者的生存至关重要。一种既能提高药效又能降低毒副作用的给药新策略是时代的需要[6]。

紫杉醇(PTX)被认为是治疗包括白血病在内的多种癌症的有效药物之一[7]。 PTX 的潜在临床效果受到其全身性副作用的严重阻碍,例如对健康组织的骨髓抑制。此外,据报道,游离药物会迅速从体循环中消除,而不会引起其治疗效果 [8]。因此,设计合适的递送系统以提高抗癌药物的稳定性和治疗效果非常重要。在多载体系统中,据报道脂质纳米颗粒具有优异的全身稳定性 [9, 10]。具体而言,固体脂质纳米颗粒 (SLN) 是一类独特的有吸引力的纳米载体系统,可防止封装药物的化学降解并提高生物利用度 [11]。 SLN 的显着特点包括优异的稳定性、药物控释、室温稳定、使用生物相容性和可生物降解的脂质系统,以及对紫杉醇等亲脂性药物的高包封率。由于增强的渗透和保留 (EPR) 效应,预计药物的纳米颗粒包封以优先方式在肿瘤中积累 [12,13,14]。虽然纳米颗粒可以提高包封药物的药效;然而,对肿瘤的靶向特异性仍然是一个问题。为了解决这个问题,纳米颗粒可以用靶向配体装饰,该配体可以特异性靶向癌细胞中过度表达的受体,并增加药物积累和疗效 [15, 16]。在这项研究中,我们使用了转铁蛋白,它会与白血病细胞中过度表达的转铁蛋白受体特异性结合。众所周知,白血病会过度表达大量的转铁蛋白受体。转铁蛋白偶联的纳米颗粒将以受体介导的方式在癌细胞中积累[17]。

在这项研究中,我们开发了一种多功能纳米颗粒,由包裹有紫杉醇的转铁蛋白修饰的固体脂质纳米颗粒组成。为了将转铁蛋白结合到 SLN,我们通过 PEG 和油酸的共轭合成了 Tf-PEG-油酸共轭物,然后与转铁蛋白共轭。 PEG 的存在将增加纳米载体在体外和全身环境中的稳定性。此外,载体外表面PEG的存在会增强载体系统的循环潜能,从而提高治疗效果。

总体而言,本研究的主要目的是开发负载 PTX 的多功能纳米颗粒并靶向白血病细胞。研究了纳米颗粒的物理化学方面。在白血病癌细胞中测试了游离药物和载药制剂的细胞毒性作用。进行细胞摄取实验以描绘转铁蛋白配体的靶标特异性。通过Hoechst 33342细胞凋亡实验进一步研究靶向纳米颗粒的优越抗癌作用,然后用Annexin V和PI染色后用流式细胞仪进行定量研究。

方法

材料

Compritol 888 ATO (Glycerol behanate) 由 Gattefosse (China) 友情提供。胆固醇、油酸和紫杉醇购自 Sigma-Aldrich, China。人转铁蛋白 (Tf) 购自 Sigma-Aldrich, China。所有其他化学品均为试剂级并按原样使用。

载有紫杉醇的转铁蛋白偶联固体脂质纳米颗粒的制备

基于酰胺键相互作用合成转铁蛋白-PEG-油酸 (Tf-PEG-OA) 缀合物 [18]。简而言之,将摩尔比为 1:2:2 的油酸、NHS 和 DCC 溶解在有机溶剂中并搅拌 16 小时。反应在室温下进行。单独地,将NH 2 -PEG-COOH溶解在DMSO中并加入三乙胺并在惰性气氛下进行反应直至12小时。通过透析和冷冻干燥过程收集如此形成的PEG-OA。现在,将摩尔比为 1:2:2 的 PEG-OA、DCC 和 NHS 溶解在 DMSO 中,并将转铁蛋白(连同 TEA)加入到反应混合物中,并在惰性气氛中进行反应 12 小时。将如此形成的含有 Tf-PEG-OA 的制剂透析 48 小时,然后冻干并储存在进一步的实验处理下。

SLN 是通过溶剂蒸发法制备的[19]。简而言之,将 PTX、Compritol 888 ATO、胆固醇和 Tf-PEG-OA 溶解在由乙醇/氯仿 (1:5) 组成的有机混合物中并搅拌 30 分钟。将所得有机溶液缓慢加入含有 1% 聚乙烯醇的水相中,并立即使用 T25 匀浆器(IKA,班加罗尔,印度)以 12,000 rpm 的速度匀浆。然后将溶液探针超声处理 3 分钟。将分散体搅拌 12 小时直到所有有机溶剂蒸发。使用 Amicon Ultra-4 离心过滤器(Millipore Corporation,Bedford,USA)用水将未包埋的游离药物与载药纳米颗粒分离 3 次。包封率(EE)和加载效率(LE)通过HPLC法测定。载药纳米颗粒是甲醇,搅拌 30 分钟,然后用等体积的水稀释。通过在 HPLC 柱中注射来计算装载的药物量。载药脂质纳米颗粒在 4°C 下储存直至进一步使用。

纳米粒子的物理表征

使用英国 Zetasizer ZS Nano Malvern Instruments 通过动态光散射 (DLS) 方法评估不同纳米颗粒的粒径和分布。用蒸馏水稀释颗粒并用于分析。该研究在室温下进行,一式三份。

使用 JEM-2000EX (JEOL, Japan) 使用透射电子显微镜 (TEM) 观察纳米颗粒的形态。纳米颗粒用磷钨酸染色并放置 15 分钟。然后将颗粒从水中排出并在红外光下干燥 5 分钟。使用TEM对颗粒进行成像。

体外药物释放研究

采用透析法研究了两种纳米粒的体外释药特性。简而言之,将 1 ml 纳米颗粒分散体装入透析膜袋(MWCO:3500)中,膜的两端都适当密封。释放实验通过将末端密封的透析袋置于速度为 100 rpm 的自动振荡器中的 10 毫升释放介质中开始。在特定时间点,收集 1 ml 样品并使用 HPLC 分析药物释放。 Perkin Elmer HPLC 系统(美国诺沃克),配备泵(200 系列)、在线真空脱气机(200 系列)、自动进样器(200 系列)、柱温箱(200 系列)、UV/VIS 检测器(200 系列) ) 被使用。使用由柱前保护柱 RP18(30 × 4.6 毫米,10 微米;美国诺沃克)保护的 C18 色谱柱(250 毫米 × 4.6 毫米,5 微米)。应用了线性梯度; 0 分钟,10% 乙腈; 30 分钟,90% 乙腈,在 214 nm 处分析。

细胞毒性分析

游离药物和载药纳米颗粒的细胞毒性通过 4,5-(二甲基噻唑-2-基) 2,5-二苯基-四唑溴化物 (MTT) 测定进行评估。将 HL-60 细胞以每孔 8000 个细胞的接种密度接种在 96 孔板中并孵育 24 小时。然后用不同浓度的游离药物和载药制剂处理细胞,并在 37°C 下在加湿的 CO2 (5%) 培养箱中进一步培养 24 小时。然后用 10 μl MTT 溶液 (5 mg/ml) 处理细胞 4 小时。然后将细胞暴露于 DMSO 并孵育 20 分钟。然后使用酶标仪(Multiskan GO,USA)在 570 nm 处研究甲臜晶体的吸光度。甲臜吸光度与每孔中活细胞的数量成正比。

纳米颗粒的细胞摄取

通过体外水平的细胞摄取实验评估纳米颗粒对白血病细胞的靶向效率。简而言之,将HL-60细胞以3 × 10 5 的接种密度接种于6孔板中。 每孔细胞。在处理前将细胞温育 24 小时。为了观察荧光和纳米粒子的跟踪,纳米粒子加载罗丹明 B 作为荧光染料。将载有染料的纳米颗粒暴露于癌细胞并孵育 3 小时。然后洗涤细胞并固定在载玻片上。然后使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM,Nikon,Japan)观察细胞。

Hoechst 33342 检测

使用 Hoechst 33342 染色进行定性细胞凋亡测定。简而言之,将HL-60细胞以3 × 10 5 的接种密度接种于6孔板中。 每孔细胞。在处理前将细胞温育 24 小时。细胞用各自的制剂处理并温育24小时。然后将细胞用 PBS 洗涤两次并用 4% 多聚甲醛溶液固定 10 分钟。荧光显微镜观察细胞凋亡。

基于流式细胞仪的细胞凋亡检测

通过用膜联蛋白 V 和 PI 染色通过流式细胞仪评估定量细胞凋亡。简而言之,将HL-60细胞以3 × 10 5 的接种密度接种于6孔板中。 每孔细胞。在处理前将细胞温育 24 小时。然后用不同浓度的游离药物和载药制剂处理细胞,并在 37°C 下在加湿的 CO2 (5%) 培养箱中进一步培养 24 小时。第二天,正确洗涤细胞并小心提取细胞。将细胞离心并分别用 2.5 μl 膜联蛋白 V 和 2.5 μl PI 处理沉淀并孵育 15 分钟。然后将体积补至 1 ml,并使用流式细胞仪(BD FACS,Biosciences,USA)进行细胞分选。

菌落形成分析

将 1000 个细胞/孔接种在 6 孔板中,培养基体积调整为 2 ml。使细胞形成集落 2 天。用具有相当于 0.1 μg/ml 剂量的 PTX 的不同制剂处理细胞并孵育 10 天。用PBS洗涤板并在甲醇中固定并用苏木精染色并洗涤并风干。在AlphaEaseFCTM软件的帮助下,使用MultimageTM灯箱(Alpha Innotech Corporation,San Leandro,CA)计算菌落密度。

统计分析

使用双尾学生的 t 评估差异的显着性 测试或单向方差分析。差异被认为在 p 的水平上是显着的 <0.05.

结果与讨论

白血病是一种典型的血癌,其特征是白细胞大量复制和增殖。在这项研究中,我们开发了一种多功能纳米颗粒,由包裹有紫杉醇的转铁蛋白修饰的固体脂质纳米颗粒组成。为了将转铁蛋白结合到 SLN,我们通过 PEG 和油酸的偶联合成了 Tf-PEG-油酸偶联物,然后将其与转铁蛋白偶联(图 1)。 PEG-油酸-Tf 在颗粒制备中具有多种用途。颗粒表面 Tf 配体的存在将增强颗粒对受体过度表达的癌细胞的靶标特异性。外表面 PEG 的存在将提供非常需要的空间平衡,这将赋予单个颗粒稳定性。我们已将此注释添加到手稿中。

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载PTX转铁蛋白修饰固体脂质纳米粒的制备示意图

纳米粒子的物理化学表征

载药纳米颗粒通过溶剂蒸发法制备,然后均质化。负载 PTX 的脂质纳米粒子 (PLN) 的平均粒径为 ~ 140 nm,而转铁蛋白修饰的负载 PTX 脂质纳米粒子 (TPLN) 的最终粒径为 ~ 160 nm(图 2a)。粒径的轻微增加归因于转铁蛋白与纳米颗粒表面的结合。据报道,颗粒特性包括尺寸和电荷是其系统性能的重要因素。大小和电荷在细胞摄取和对细胞的毒性作用中起重要作用。据报道,在本研究中观察到的小于 200 nm 的粒径最有利于癌症靶向,因为它会由于增强的渗透和保留 (EPR) 效应而允许粒子在癌症组织中的特定积累。 9, 20, 21]。同样,纳米粒子的表面电荷决定了胶体稳定性粒子与细胞表面的相互作用。 TPLN 的平均表面电荷为 - 22.5 ± 1.56 mV,表明其具有靶向癌症的潜力。依次通过 TEM 研究粒子的形态(图 2b)。颗粒在形状上是完美的球形并均匀分布在 TEM 网格中。颗粒分布均匀表明制备方法成功。

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通过动态光散射 (DLS) 分析测量的 TPLN 的粒度分布。 b 通过透射电子显微镜 (TEM) 测量颗粒形状。 DLS 实验一式三份进行 (n =3)

药物加载和体外药物释放

观察到 PTX 在纳米颗粒中的包埋效率为 92.5 ± 1.35%,活性负载效率为 8.6% w /w .采用透析法研究了PLN和TPLN的体外释药特性。 PLN 和 TPLN 显示药物从载体系统中持续释放,表明其适用于癌症靶向应用。例如,在 24 小时研究期结束时,约 30% 的药物从两种纳米颗粒中释放出来(图 3)。类似地,药物释放持续到 75 小时结束,观察到平均释放约为 65%。应该指出的是,与 PLN 相比,TPLN 显示出更持久的药物释放。药物释放略低主要归因于转铁蛋白配体与纳米颗粒表面的结合。转铁蛋白的高分子量可能在很大程度上抑制药物的释放。总的来说,药物从纳米颗粒的持续和延长释放表明药物与脂质基质分散良好,避免了最初的突释或双相释放模式。总体而言,从载体系统中控制释放药物可能会加强癌症治疗。

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来自 PLN 的 PTX 和来自磷酸盐缓冲盐水 (pH 7.4) 的 TPLN 的体外药物释放特性。药物释放通过透析法研究,药物通过HPLC法定量。测量执行 n =3

纳米颗粒的细胞摄取

通过共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 测试了纳米颗粒对白血病癌细胞的靶向潜力。将纳米颗粒暴露于癌细胞并孵育 3 小时。罗丹明 B 被用作荧光染料来追踪纳米粒子在癌细胞中的分布。如图 4 所示,与 TPLN 相比,PLN 中的红色荧光强度相对较小。结果清楚地表明,与 PLN 相比,细胞质中的荧光显着更高,表明 TPLN 对癌细胞具有优越的靶向潜力。显着更高的荧光强度主要归因于转铁蛋白与纳米颗粒表面的结合。 Tf优选与癌细胞中过表达的Tf受体结合,导致纳米颗粒在癌细胞中的更多积累[22]。

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使用共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 在 37°C 下对 TPLN 和 PLN 进行细胞摄取分析。罗丹明 B 用作荧光染料并孵育 3 小时。将纳米颗粒在 37°C 下在培养箱中培养 3 小时后进行细胞摄取分析。比例尺为 20 μm

体外细胞毒性试验

通过 MTT 测定评估游离 PTX、PLN 和 TPLN 在 HL-60 细胞中的体外细胞毒作用。如图 5 所示,所有制剂在白血病癌细胞中都表现出典型的剂量依赖性细胞毒作用。可以看出,虽然 PTX 表现出剂量依赖性作用,但 PLN 表现出相对较高的细胞毒作用,这可能是由于较高的细胞内吸收和药物从纳米颗粒的持续释放。具体而言,与 PLN 相比,TPLN 在癌细胞中显示出显着更高的细胞毒作用,表明 Tf 修饰的纳米颗粒系统具有卓越的靶向效率。 TPLN 的 IC50 值为 0.45 μg/ml,而 PLN 的 IC50 值为 2.8 μg/ml。 IC50 值降低六倍主要归因于 Tf 受体过表达的癌细胞中更高的 TPLN 细胞内摄取。与 PLN 相比,TPLN 的更高递送潜力和药物向核靶标的持续释放可能是癌细胞中更高细胞毒性作用的主要原因。 Tf修饰的纳米载体已被探索作为将抗癌药物输送到癌细胞中的靶点,从而降低给药的有效浓度并克服多药耐药(MDR)相关因素[23]。

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MTT法对游离药物和载药纳米颗粒的细胞毒性分析。在用不同浓度的药物处理细胞并孵育 24 小时后,通过 MTT 分析和使用酶标仪分析细胞。测量执行 n =6.*p <0.05为TPLN与PTX的统计差异

Hoechst 33342 细胞凋亡分析

通过 Hoechst 33342 细胞凋亡试验进一步评估了纳米颗粒的细胞毒性潜力。用相应制剂处理后的细胞用 Hoechst 33342 染色并孵育 15 分钟。从图 6 中可以看出,未处理的对照细胞是球形的,具有健康细胞的典型特征。然而,经 PTX 处理的细胞显示出细胞形状的不规则性。在 PLN 治疗组中可以看到典型的细胞损伤和凋亡,这可能是由于癌细胞摄取增加所致。 TPLN 诱导了癌细胞的最显着的细胞凋亡,并且大部分细胞因大量的凋亡小体形成而扭曲。显着的细胞裂解和凋亡诱导与前段所述的细胞活力专利一致。

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基于 Hoechst 33342 的细胞凋亡测定。细胞用Hoechst 33342染色,荧光显微镜分析细胞凋亡。将细胞与各自的制剂孵育 24 小时。比例尺为 50 μm

基于流式细胞仪的细胞凋亡检测

用Annexin V和PI染色试剂盒染色后,用流式细胞仪进行细胞凋亡定量分析。细胞用各自的制剂处理并温育24小时。然后将细胞用膜联蛋白 V 和 PI 染色。如图 7 所示,未处理的对照细胞是活的,活室中存在超过 99% 的细胞。 PTX 处理将活细胞的比例降低到 90%,细胞凋亡率约为 9%。 PLN 显示约 10% 的凋亡细胞和~ 7% 的坏死细胞。重要的是,TPLN 显示出显着的 (p <0.05) 活细胞比例减少至~ 65%,细胞凋亡约~ 30%(早期和晚期细胞凋亡)。 TPLN显着的凋亡潜能归因于受体介导的细胞摄取和癌细胞中抗癌药物的较高积累,可能增强肿瘤细胞的抗癌作用[24, 25]。

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基于流式细胞仪的细胞凋亡测定。细胞用各自的制剂处理,24 小时后,细胞用膜联蛋白 V 和 PI 染色 15。然后使用流式细胞仪对细胞进行分选。将细胞与各自的制剂孵育 24 小时。测量执行 n =3.*p <0.05为TPLN与PTX的统计差异

菌落形成分析

通过集落形成试验测试了在各自制剂存在下的集落形成能力图 8。如图所示,PTX 和 PLN 具有轻微的抑制癌细胞集落形成能力的潜力。重要的是,TPLN 显示出显着的控制癌细胞集落形成能力的能力。与 PTX 的~ 70% 集落形成相比,TPLN 显示~ 20% 集落形成,表明 TPLN 具有优越的抗癌作用。急性髓性白血病的维持依赖于具有形成集落能力的较少数量的白血病干细胞和祖细胞;重要的是测试 TPLN 是否能够针对集落形成细胞池。结果表明,它可以显着降低患白血病的风险,表明它具有预防癌症发展和/或消除早期恶性细胞的能力。因此,集落形成试验为该制剂的潜在抗癌功效提供了重要信息。

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集落形成试验。细胞在各自处理后进行集落形成测定方案。将细胞与各自的制剂孵育 24 小时。 **p <0.001 为 PTX 与 PTLN 的统计差异

结论

总的来说,制备了转铁蛋白修饰的紫杉醇脂质纳米颗粒,旨在提高白血病细胞的化疗效果。结果清楚地表明,与 PLN 相比,TPLN 对癌细胞具有更好的靶向潜力。具体而言,与 PLN 相比,TPLN 在癌细胞中显示出显着更高的细胞毒作用,表明 Tf 修饰的纳米颗粒系统具有卓越的靶向效率。重要的是,TPLN 显示出显着的癌细胞凋亡,并对两种 HL-60 细胞显示出强大的抗肿瘤能力。总的来说,结果清楚地表明了配体偶联的脂质纳米颗粒系统对白血病细胞的靶向潜力,这可能为成功的癌症治疗铺平道路。制剂在临床动物模型中的治疗效果及其生物分布将是我们下一步工作的一部分。

缩写

EPR:

增强渗透和滞留效果

OA:

油酸

PEG:

聚乙二醇

PLN:

负载PTX的脂质纳米粒

PTX:

紫杉醇

SLN:

固体脂质纳米粒

Tf:

转铁蛋白

TPLN:

Tf-共轭PLN


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