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装载蟾蜍灵的聚乙二醇化脂质体:抗肿瘤功效、急性毒性和组织分布

摘要

蟾蜍灵,源自蟾蜍属植物 , 发挥抗肿瘤作用,但作为单一药物给药时生物利用度和副作用低。本研究的目的是评估在先前研究中制备的蟾蜍灵聚乙二醇化脂质体 (BF/PEG-LP) 的理化性质、抗肿瘤功效、一般药理学、急性毒性和组织分布特征。为评价制剂的安全性,进行了红细胞溶血试验,结果表明BF/PEG-LP的溶血率明显低于蟾蜍灵单独使用的溶血率。细胞活力测定表明空白脂质体是无毒的。在体外实验中,BF/PEG-LP 剂量依赖性地诱导 HepG2、HCT116、A549 和 U251 癌细胞的凋亡,半数抑制浓度 (IC50) 值为 21.40 ± 2.39、21.00 ± 3.39、21.00 ± 3.34、在 24 h 时分别为 6.43 和 31.14 ± 2.58 ng/mL。裸鼠肿瘤异种移植实验表明,BF/PEG-LP 显着抑制 U251 细胞的生长。药理学评价显示,与对照组小鼠相比,BF/PEG-LP 在给药一周后影响了小鼠的一般行为、独立活动和协调性。在急性毒性试验中,BF 和 BF/PEG-LP 在小鼠体内的中位致死浓度 (LD50) 分别为 0.156 和 3.03 mg/kg。组织分布图显示,与 BF 相比,给小鼠施用 BF/PEG-LP 时,脑组织中的 BF 浓度高 20%,而心脏组织中的 BF 浓度低 30%。因此,与单独使用蟾蜍灵相比,BF/PEG-LP 表现出较低的溶血和细胞毒性以及改善的药代动力学和抗肿瘤特性,表明其在未来的药理学应用中具有潜力,特别是用于治疗胶质瘤。

介绍

Bufalin (BF; 3β,14-dihydroxy-5β,20(22)-bufadienolide, 5β,20(22)-bufadienolide-3β, 14-diol),从蟾酥中提取 , 具有抗炎、强心、抗病毒、止痛和抗肿瘤活性 [1, 2]。本课题组还揭示了BF对肝癌、黑色素瘤、结肠癌、胶质瘤、卵巢上皮癌具有治疗作用,这可能与其抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡有关[3,4,5,6,7] .

兰等人。 [8] 先前在裸鼠中建立了神经胶质瘤异种移植模型,每天通过腹腔注射 BF (i.p. ) 注射。 BF处理组几乎没有观察到双核仁和有丝分裂;此外,与对照组相比,核仁更小,细胞形态更规则。尽管BF具有许多潜在的药理作用,迄今为止取得的结果是有希望的,但BF作为单一药物离临床应用还有很长的路要走。此外,BF 治疗与不良反应和副作用有关,如免疫反应、正常组织损伤和高毒性[9]。

几种药物递送系统,例如脂质乳剂、纳米颗粒和脂质体,已被用于提高 BF 的溶解度、药理活性和生物利用度 [10, 11]。此外,聚集诱导发射 (AIE) 活性功能聚合物自组装体在各种生物医学应用中显示出巨大的潜力,包括生物成像和细胞内药物递送 [12, 13]。在这些药物递送系统中,脂质体制剂在用作静脉内 (i.v.) 递送系统时具有几个优点。脂质体制剂不仅可以提高水溶性,降低负载药物的副作用[14],还可以携带药物穿越血脑屏障(BBB),从而更有效地治疗脑肿瘤[15] . BBB由脑毛细血管内皮细胞和它们之间的紧密连接、星形细胞、神经胶质细胞和基底膜组成,只有高脂溶性药物才能在脑组织中通过和分散[16]。尽管如此,脂质体制剂有一些缺点。血浆蛋白的吸收和单核吞噬系统的识别导致加载的药物从血液中快速清除。而PEG对脂质体的表面修饰可以解决这些问题[17]。

在之前的研究中,我们制备了负载蟾蜍灵 (BF/PEG-LP) 的 PEG 化脂质体,并对其进行了表征,包括其细胞毒性和药代动力学特征,以试图克服上述挑战,提高药物递送效率并降低毒性。为了扩展该研究,我们进一步评估了 BF/PEG-LP 的理化性质、抗肿瘤功效、急性毒性和组织分布特征。

材料和方法

化学品和试剂

BF 和华蟾素(CBG)购自宝鸡晨光科技发展有限公司(中国宝鸡;纯度为 98%,经 HPLC 鉴定)并溶解在 DMSO 中,作为储备液在 - 20 °C 下储存。 CBG 用作内标 (IS)。多柔比星(DOX)购自北京阳光生物科技有限公司(中国北京;纯度为 98%,经 HPLC 鉴定)并溶解在 DMSO 中,作为储备溶液在 - 20 °C 下储存。 BF/PEG-LP 在我们的实验室中制备(粒径,155.0 ± 8.46 nm;zeta 电位,–18.5 ± 4.49 mV;截留效率,76.31% ± 4.23%,通过 HPLC 检测)[6] HPLC 级甲酸购自 Tedia Company Inc.(美国俄亥俄州费尔菲尔德)。细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 购自 Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan)。 HPLC 级乙酸乙酯购自天津凯美尔化学试剂开发中心(中国天津)。 HPLC 级乙腈购自 Merck(德国达姆施塔特)。其他试剂均为分析纯。

动物

雄性 Sprague-Dawley 大鼠,体重约 230–250 g;昆明小鼠,体重18-22 g;和 6 周龄裸 Balb/c 小鼠由第四军医大学实验动物研究中心(中国西安)提供。将动物单独饲养在单独通风的笼子 (IVC) 系统中,并随意喂食标准实验室食物和水 5 天。所有动物在实验前禁食(除水外)过夜。涉及动物的实验程序经第四军医大学动物护理和使用机构委员会审查批准(批准号2017-0603-R)。

标准样品的制备

通过向 100 μL 的组织匀浆中加入 20 μL 的每种工作溶液来制备校准曲线,以产生含有 20、50、200、500 和 2000 ng/mL BF 的样品。预先制备加标标准匀浆样品,并与每批未知样品进行评估。

脂质体的安全性

红细胞溶血试验

从大鼠身上采集 8 毫升血液,随后肝素化并用 10 mL 0.9% 生理盐水稀释。然后将全血样品与 100 μL BF 溶液或 1 mL BF/PEG-LP 悬浮液混合。在保持在 37 °C 的水浴中浸泡 40 分钟后,将样品以 750g 离心 5 分钟去除红细胞及其碎片。上清液在 2 mL 乙醇/盐酸溶液(39:1;99% 乙醇(v/v ):37% 盐酸 (w/v ))。上清液以 750g 离心 5 分钟,然后用紫外分光光度计在398 nm处测量吸光度。同法制备蒸馏水阳性对照和0.9%生理盐水阴性对照。

纳米颗粒悬浮液的溶血率(HR%)计算如下:

$$ \mathrm{HR}\%=\left({\mathrm{A}}_{\mathrm{sample}}-{\mathrm{A}}_{\mathrm{negative}}\right)/\left ({\mathrm{A}}_{\mathrm{positive}}-{\mathrm{A}}_{\mathrm{negative}}\right)\times 100\% $$

其中 A 样品是样品的吸光度,A 阴性是阴性对照的吸光度,A 阳性为阳性对照的吸光度。

空白脂质体的细胞毒性

CCK-8用于检测空白脂质体对人肝细胞癌HepG2细胞和人结肠癌HCT116细胞的细胞毒性。悬浮的HepG2细胞和HCT116细胞(1 × 10 4 个/孔)接种于 96 孔板,用 RPMI-1640 培养基培养至对数期。将不同浓度的空白脂质体加入培养基中。每个浓度制备 6 个复孔。孵育24 h后弃去培养基,加入100 μL的CCK-8工作液(CCK-8:RPMI-1640培养基,10:100)。孵育2 小时后,通过酶标仪(Bio-Rad 680,Hercules,CA,USA)在450 nm处检测和定量吸光度。

环境 pH 值对脂质体稳定性的影响

BF/PEG-LP 分别通过在 pH 7.4 和 pH 5.0 下与磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 水合制备。脂质体在黑暗条件下储存在 4 °C。在0、5、15、30、60和120 min测量样品在296 nm处的吸光度。

体外实验

通过CCK-8增殖测定评估细胞增殖。 HepG2、HCT116、A549和U251细胞分别以1 × 10 4 的密度接种 37 °C 下 96 孔板中的细胞/孔,5% (v/v ) 二氧化碳。 24 h后,将不同浓度的BF/PEG-LP加入孔中。再孵育24 h后弃去细胞培养基,加入100 μL的CCK-8工作液。孵育 2 小时后,通过酶标仪(Bio-Rad 680)在 450 nm 处检测和定量吸光度。从剂量反应曲线估计活细胞的百分比和 IC50 值。每个样品和对照的值由6个重复孔的平均值确定。

肿瘤异种移植实验

U251细胞(1 × 10 7 ) 在 0.15 mL PBS 中接种裸鼠皮下,并使其生长 7 天,达到肿瘤大小超过 50 mm 3 .然后,将小鼠随机分为两组,每组六只。在治疗组中,0.5、1.0 或 2.0 mg/kg/天的 BF 或 BF/PEG-LP 是腹腔注射。连续注射 21 天。载体对照组注射含0.1%DMSO的PBS,阳性对照组注射2 mg/kg顺铂(DPP)。

每2 天测量一次小鼠的体重。仔细观察所有用 BF 和 BF/PEG-LP 治疗的小鼠的皮肤和头发状况、食物和水摄入量、粪便特征和行为变化。实验结束时,处死小鼠,取出移植瘤并称重。然后将移植的肿瘤固定在 4% 多聚甲醛溶液中并包埋在石蜡中。制备五微米厚的切片并用苏木精和伊红 (H&E) 染色。光镜下观察肿瘤细胞生长、坏死及周围组织浸润。

药理评价

一般行为和独立活动

50只昆明小鼠随机分为5组(n =每组 10),即 i.p.单次给药如下:对照组给予生理盐水,20 mg/kg戊巴比妥钠作为阳性对照组,1.0、1.5和2.0 mg/kg作为低、中、高-dose BF/PEG-LP 组。然后观察小鼠的一般行为、姿势、步态、流涎、肌纤颤、眼球震颤和分泌物。给药1 h后,将小鼠置于空地箱中。待小鼠适应1 min后,计数10 min在箱内移动的小鼠数。

协调练习测试

将小鼠随机分为五组(n =10 每组,一半男性和一半女性)是 i.p.给药如下:空白对照组给予生理盐水,2.5 mg/kg盐酸氯丙嗪为阳性对照组。和1.0、1.5和2.0 mg/kg BF/PEG-LP分别作为低、中、高剂量BF/PEG-LP组。

一根光滑的金属棒(直径1.27 cm,长度80 cm)垂直于地面放置并固定在底部以保持直立。治疗1 周后,分别进行30、60、120 分钟的攀爬试验。老鼠被放置在金属棒的顶部,让它们自然爬下。观察小鼠爬下金属棒时的协调性并进行评分。评分标准如下:0分,逐级下降; 1分,滑动下降; 2分,不能下降;和3分,没有观察到反射。

急性毒性

计算 BF 和 BF/PEG-LP 的中位致死浓度 (LD50) 以评估急性毒性。 110只昆明小鼠(半雄半雌)随机分为11组(n =10)。五组接受了一次静脉注射。 BF 剂量为 1.0、0.37、0.14、0.05 或 0.02 mg/kg,五组接受单次 i.v BF/PEG-LP 的剂量为 4.0、2.83、2.0、1.41 或 1.0 mg/kg。进样体积为 0.2 mL。 BF先用含1%DMSO的生理盐水溶解;然后用生理盐水稀释BF和BF/PEG-LP以获得所需浓度。对照组给予含1% DMSO的生理盐水。治疗后14 天观察小鼠一般行为,记录死亡率。 i.v.后小鼠的病理变化 光学显微镜(NIKON Eclipse ci,Tokyo,Japan)观察给药情况。

使用 HPLC 进行组织分布研究

Sprague-Dawley 大鼠随机分为两个组(每组四组,n =6 每组)。这两个部分是 i.p. 分别给予 0.5 mg/kg BF 和 BF/PEG-LP。在给药后 5、15、45 和 90 分钟收集主要组织样品,包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和大脑。组织样品用盐水溶液 (0.9%) 快速冲洗,适当去除血液和内容物。清洗后,用滤纸吸干样品。将样品称重,然后在 0.9% 盐水溶液中匀浆(组织样品与盐水溶液,1:2,w/w )。将获得的匀浆储存在 – 80 °C 直至分析。

提取目标化合物,采用液-液制备法排除内源性蛋白质的干扰[18]。我们发现乙酸乙酯提高了提取回收率并最大限度地减少了内源性干扰,从而提高了 BF 检测的灵敏度和选择性。因此,乙酸乙酯被用作样品制备的最佳溶剂。将 20 微升 IS 工作溶液添加到 100 μL 组织匀浆等分试样中。然后,将样品涡旋混合 30 s,并用 2.5 mL 乙酸乙酯萃取 2 分钟。以 3500 g 离心 10 分钟后,将上层有机层转移到另一个管中,并在 45 °C 和温和的氮气流下蒸发。残留物用 100 μL 流动相(乙腈:0.1% 甲酸/水溶液,65:35,v/v ) 涡旋混合 5 分钟,然后以 12000 g 离心 10 分钟。然后,将 10 μL 等分的上清液注入 HPLC 系统(Waters 2995/2996,Waters Corporation,Milford,MA,USA)。 BF和IS检测的优化色谱条件已在先前提出[6]。

统计分析

所有结果均表示为平均值 ± SD (n =3),并且使用 GraphPad Prism 5 软件通过单向方差分析 (ANOVA) 比较配方之间的差异。 P <0.05 表示在所有情况下均显着。

结果与讨论

BF/PEG-LP 的理化性质

透射电子显微镜 (TEM) 显示 BF/PEG-LP 具有均匀的球形,如附加文件 1:图 S1A 所示。 BF/PEG-LP的结构通过FT-IR鉴定。如附加文件 1:图 S1B 所示,特征峰位于 3495 cm −1 和 3436 cm −1 代表酰胺键的 N-H 伸缩振动,而峰值在 1079 cm -1 代表了 BF/PEG-LP 中醚键的 C-O-C 伸缩振动。为了评价制剂的体外安全性,通过RBC溶血试验测定空白脂质体、BF和BF/PEG-LP的溶血率,并通过CCK测定用空白脂质体处理的HepG2和HCT116细胞的细胞活力-8 测定。 BF组出现明显溶血;而BF/PEG-LP组的溶血率在相同浓度下显着降低(P <0.01)。当BF/PEG-LP浓度增加至200 μg/mL时,溶血率明显高于空白脂质体(P <0.01,图 1a)。 CCK-8实验结果表明空白脂质体对HepG2和HCT116细胞无毒(图1b)。

<图片>

BF/PEG-LP 的理化性质。 空白脂质体、BF 和 BF/PEG-LP 的红细胞溶血率。数据表示为 \( \overline{x} \)± s (n =3)。 **P <0.01 vs. BF/PEG-LP 组在相同的浓度。 b 空白脂质体在 HepG2 和 HCT116 细胞中的细胞毒性。数据表示为 \( \overline{x} \) ± s (n =6)。 c BF/PEG-LP 在不同 pH 条件下的稳定性。数据表示为 \( \overline{x} \) ± s (n =6)。 **P <0.01 vs. pH 7.4组在同一时间点。缩写:BF,蟾蜍灵; BF/PEG-LP, 蟾毒灵聚乙二醇化脂质体

通过紫外分光光度法评估环境 pH 值对 BF/PEG-LP 稳定性的影响。图 1c 显示 pH 5.0 组样品的吸光度随储存时间增加而增加,表明 BF/PEG-LP 在 pH 7.4 的 PBS 中更稳定(P <0.01).

体外肿瘤细胞凋亡

通过CCK-8测定法测定BF/PEG-LP诱导的HepG2、HCT116、A549和U251细胞中的细胞凋亡。所有测试细胞的 BF/PEG-LP 的 IC50 值列于表 1。BF/PEG-LP 以剂量依赖性方式显着降低所有细胞类型的活力(图 2)。当浓度超过40 ng/mL时,BF/PEG-LP的抑制作用与DOX(阳性对照,50 μg/mL)相似。此外,基于IC50值,细胞对BF/PEG-LP的敏感性排序如下:HCT116> HepG2> U251> A549。

<图片>

BF/PEG-LP 在 HepG2 (a ), HCT116 (b ), A549 (c ) 和 U251 (d ) 细胞。数据表示为\( \overline{x} \) ± s (n =6)。 *P <0.05, **P <0.01 vs. 每个细胞系的对照组。缩写:BF/PEG-LP,负载蟾蜍灵的聚乙二醇化脂质体; DOX、阿霉素

一般药理学评价

BF/PEG-LP给药后,小鼠的一般行为与空白组不同。特别是高剂量 BF/PEG-LP 组的小鼠表现出震颤和流涎。给药后,小鼠在空地箱内静置10 min,记录活动网格数。在阳性对照(戊巴比妥)组中,活跃网格数仅为342 ± 35,显着低于对照组(725 ± 127,P <0.05)。如图 3a 所示,中高剂量 BF/PEG-LP 组的活性网格数与对照组有显着差异。爬杆试验表明,与对照组相比,BF/PEG-LP在给药1周后对小鼠的协调运动有一定的促进作用(P <0.01),而氯丙嗪对阳性对照组有显着促进作用(P <0.05),如图 3b 所示。

<图片>

BF/PEG-LP 对运动活性的药理作用 (a ) 和协调练习 (b ) 在老鼠身上。数据表示为 \( \overline{x} \) ± s (n =10)。 *P <0.05, * * P <0.01 vs. 每个时间点的对照组; # P <0.05 与低剂量 BF/PEG-LP 组相比。简称:BF/PEG-LP,蟾蜍灵聚乙二醇化脂质体

肿瘤异种移植实验

随着给药时间延长,阳性对照组、BF组和BF/PEG-LP组小鼠表现出智力低下、摄食量减少、反应迟缓、皮毛暗淡。 BF 和 BF/PEG-LP 组均发生小鼠死亡。阳性对照组抗肿瘤率为36.5%;高剂量BF组为27.6%;低、中、高剂量 BF/PEG-LP 组分别为 11.4%、28.9% 和 38.7%。除低剂量BF组外,药物治疗组与阴性对照组的抗肿瘤率均存在显着差异(P <0.05),如图 4a 所示。与低剂量BF组相比,高剂量BF/PEG-LP组的抑瘤率显着升高(P <0.01),如图 4b 所示。

<图片>

BF 和 BF/PEG-LP 对裸鼠胶质瘤异种移植物生长的抑制作用。肿瘤重量比较 (a ) 和抑瘤率 (b ) 在每个组中。数据表示为 \( \overline{x} \) ± s (n =10)。 *P <0.05, **P <0.01 对比 控制组; # P <0.05, ## P <0.01 vs. 高剂量 BF/PEG-LP 组。 c 荷瘤小鼠肿瘤组织的 H&E 染色。缩写:BF,蟾蜍灵; BF/PEG-LP,负载蟾蜍灵的聚乙二醇化脂质体; DPP,顺铂; H&E、苏木精和伊红

荷瘤小鼠的异种移植物呈结节状。 H&E染色显示,对照组肿瘤细胞核大,胞质小,细胞生长旺盛;高剂量BF/PEG-LP组肿瘤组织出现大面积坏死,坏死程度呈剂量依赖性,如图4c所示。

急性毒性

单次静脉注射的急性毒性. 确定制剂在昆明小鼠中的剂量。 BF 和 BF/PEG-LP 的 LD50 值分别为 0.156 和 3.03 mg/kg。与BF相比,BF/PEG-LP的急性毒性显着降低(P <0.01);这种效果归因于脂质体配方,其控制了BF释放到血液中。

i.v.后小鼠的病理变化 通过光学显微镜观察给药(图 5)。在心脏、肝脏和肾脏等多个器官中观察到病理变化。心脏心肌纤维溶解、断裂伴出血明显。肝细胞和肺内皮细胞均出现坏死。

<图片>

静脉注射 1.0 mg/kg BF 和 4.0 mg/kg BF/PEG-LP 后,在死小鼠中观察到病理变化。组织切片用 H&E 染色并通过光学显微镜观察。备注:光学显微镜:NIKON Eclipse ci;成像系统:NIKON Digital Sight DS-FI2(日本东京);放大倍数:×200。缩写:BF,蟾蜍灵; BF/PEG-LP,负载蟾蜍灵的聚乙二醇化脂质体; H&E、苏木精和伊红

组织分布研究

比较空白组织匀浆和加标匀浆的色谱图,表明 BF 和 CBG (IS) 的保留时间没有显着干扰,用于测定方法的选择性,如附加文件 1 所示:图 S2。校准曲线由 BF 与 IS (Y) 的峰面积比与 20 至 2000 ng/mL 的组织匀浆浓度构成,相关系数为 R 2 > 0.9977(表 2)。 BF在生物样品中的精密度、准确度和回收率实验见附加文件1:表S1,稳定性实验结果见附加文件1:表S2。

组织分布实验的原始数据显示在附加文件 1:表 S3 中。在 i.v. 之后 在注射 BF/PEG-LP 时,其组织分布受几个变量的影响,例如成分、粒径和 zeta 电位 [19]。在 5、15、45 和 90 min 时对包括心、肝、脾、肺、肾和脑在内的各种组织中的 BF 浓度进行定量,如图 6 所示。在 iv. 给药后,两组 BF 在心、肝、脾、肺、肾等部分组织中的浓度很低,说明 BF 的分布和消除发生较快。静脉注射后90 分钟,尽管不是其他组织,仍可检测到脑中BF的浓度 两组均给药,说明BF在脑内的分布和消除较其他组织相对较慢。

<图片>

BF 在大鼠器官中的组织分布。 A 蟾蜍灵的分子式(a ) 和华蟾素 (b , 是)。 B 单次静脉注射 BF/PEG-LP 或 0.5 mg/kg BF 后大鼠 BF 的组织分布图。数据表示为 \( \overline{x} \) ± s (n =6)。缩写:BF,蟾蜍灵; BF/PEG-LP,负载蟾蜍灵的聚乙二醇化脂质体; IS,内标

同时,与BF组相比,在BF/PEG-LP组的脑组织中检测到高1.20倍的BF(333 ± 92.5 ng/g,5 分钟)。此外,在 BF/PEG-LP 组的肝脏、脾脏和脑组织中发现了更高浓度的 BF。在肝脏中检测到显着的 BF 积累,BF/PEG-LP 组的浓度为 187 ± 31.0 ng/g,BF 组的浓度为 163 ± 35.0 ng/g(P <0.01)。类似的现象主要是由于血液中BF在代谢和排泄前急剧增加所致[20, 21]。

根据组织分布实验结果,BF本身可以穿越血脑屏障,可能是由于其脂溶性高,分子量低(386.52 g/mol),化学结构与胆固醇相似,与胆固醇相似。具有相同的母核结构。但BF的脂溶性高、水溶性差,限制了其临床应用。如果不以替代形式给药,BF 的生物利用度很低。在之前的研究[6]中,我们表明BF/PEG-LP制剂可以提高水溶性,延长血液循环时间,延长半衰期,扩大BF的应用范围,包括静脉注射。化疗。在目前的研究中,BF/PEG-LP 给药导致大脑中 BF 浓度增加,并持续更长的时间(90 分钟)。此外,在 45 min 时,BF 组和 BF/PEG-LP 组之间的 BF 浓度存在显着差异(167.59 ± 54.52 vs. 71.52 ± 48.35 ng/g,P <0.01).

在之前的一项研究中,BF 被证明对心脏产生类似洋地黄的作用,增加大鼠的心率和心肌收缩力 [22]。因此,大剂量BF的心脏毒性可能是由于其在心脏内蓄积所致。本研究的生物分布实验表明,BF/PEG-LP组BF在心脏中的积累低于BF组(95.0 ± 18.5vs . 134 ± 17.8 ng/g,5 分钟,P <0.01; 15.32 ± 5.56 vs. 63.79 ± 28.21 ng/g,15 分钟,P <0.01)。较低剂量的 BF 是否可以减轻心脏毒性需要进一步验证。尽管如此,BF 的抗肿瘤作用在本研究中足够强(神经胶质瘤细胞的 IC50 值为纳摩尔)。 For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章及其补充信息文件中。

缩写

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB:

Blood-brain barrier

BF:

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8:

细胞计数试剂盒-8

IC50 :

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

Internal standard

i.v.

Intravenously

LD50 :

Median lethal concentration

PBS:

磷酸盐缓冲盐水

RBC:

Red blood cell


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