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有机磷源和钙源诱导合成具有高比表面积的磷酸钙卵黄壳结构微球:在 HEL 吸附中的应用

摘要

蛋黄壳结构的磷酸钙微球由于其优异的理化性质和生物相容性,在医学应用方面具有巨大的潜力。然而,开发具有高吸附能力的蛋黄壳结构磷酸钙仍然是一个挑战。在此,具有高比表面积的磷酸钙多孔蛋黄壳结构微球 (ATP-CG) [S 投注 =143 米 2 g −1 以腺苷 5'-三磷酸二钠盐 (ATP) 为磷源,成功合成了用五水 L-乳酸钙 (CL) 代替钙源合成的 ATP-CL 微球的三倍。通过自模板方法将葡萄糖酸钙一水合物 (CG) 作为钙源。还研究了 Ca 与 P 的摩尔比 (Ca/P)、水热温度和时间对 ATP-CG 微球形态的影响。发现有机钙源和有机磷源在蛋黄-壳结构的形成中起着至关重要的作用。此外,还研究了一批吸附实验,以阐明用不同钙源合成的两种蛋黄壳结构微球的吸附机理。结果表明,ATP-CG微球的吸附量(332±36mg/g)比ATP-CL微球的吸附量(176±33mg/g)高约2倍。此外,由钙源引起的更高比表面积和 ATP-CG 微球独特的表面化学性质在提高 HEL 吸附能力方面起着重要作用。研究表明,所制备的蛋黄壳结构微球在药物递送领域的应用前景广阔,为提高药物吸附能力提供了有效途径。

介绍

由于其优异的生物相容性[1]、高负载能力和输送效率,磷酸钙在过去几年中受到了相当大的关注。磷酸钙相关生物材料已广泛应用于各种生物医学领域,如组织工程[2]、骨修复[3]和药物递送[4]。为了扩大磷酸钙基材料的应用范围和提高其性能,各种形态和微观结构的磷酸钙材料包括碳酸羟基磷灰石(HAp)微球[5]、HAp微管[6]、空心HAp微球[7] ],已经报道了无定形磷酸钙(ACP)的介孔yolk@cage-shell纳米球[8]。

在各种形态中,蛋黄壳结构微球不仅是前沿的材料科学,而且表现出独特的形态特征,因此越来越受到人们的关注。在蛋黄壳结构微球中,蛋黄核壳之间的空隙空间可以作为各种货物的储存库,多孔结构的壳层可以为客体分子提供扩散途径,这使得它们具有巨大的应用潜力,包括催化 [9]、锂离子电池 [10]、光催化剂 [11] 和生物医学 [12]。传统上,牺牲模板方法是制备蛋黄壳结构微球的主要方法 [13, 14]。这些模板策略在调整结构和性能方面取得了巨大成功。然而,这些方法存在一些缺点。例如,繁琐的加工步骤和表面活性剂或结构导向试剂,可能对人类健康有害。目前,自模板方法已广泛应用于蛋黄壳结构微球的研究[15, 16]。与传统的模板方法不同,自模板方法中使用的模板不仅是形成空隙的模板,而且还是蛋黄壳结构微球的前体。因此,自模板方法是制备蛋黄壳结构微球的便捷方法。然而,引入自模板方法合成蛋黄壳结构的磷酸钙微球仍然是一个有趣的挑战。

此外,磷酸钙材料已被用于携带不同类型的货物,如蛋白质 [17]、DNA [18] 和 siRNA [19]。然而,磷酸钙药物吸附能力差的问题亟待解决。通常,药物分子固定在载体表面的方法取决于表面性质,包括表面电位[20]、疏水性/亲水性[21]、氢键[22]和比表面积[23]。因此,改善表面性质和比表面积是提高载体对药物吸附能力的有效途径。

在此,我们以腺苷5'-三磷酸二钠(ATP)为磷源,一水葡萄糖酸钙(CG)为钙源,通过自模板法制备了一种多孔蛋黄壳结构的磷酸钙微球。在不添加任何模板剂的情况下,所制备的蛋黄-壳结构磷酸钙微球显示出特别高的比表面积。此外,与通过用五水乳酸钙 (CL) 代替钙源制备的 ATP-CL 微球相比,研究了 ATP-CG 微球的鸡蛋溶菌酶 (HEL) 吸附行为。结果表明,钙源和表面化学性质引起的比表面积差异对HEL吸附能力的提高起着至关重要的作用。

方法

材料

腺苷 5'-三磷酸二钠盐 (ATP) 购自 Macklin Biochemical Co., Ltd(中国上海)。葡萄糖酸钙一水合物(CG)和(l)-乳酸钙五水合物(CL)购自生工生物科技有限公司(中国上海)。鸡蛋溶菌酶(HEL,~70000 U/mg)购自Sigma-Aldrich(德国Taufkirchen)。

ATP-CG 和 ATP-CL 蛋黄-壳结构微球的合成和表征

ATP-CG蛋黄壳结构磷酸钙微球的制备如下:简而言之,将0.9 g CG溶于20 mL超纯水中,在60°C下形成溶液C,0.11 g ATP溶于5 mL超纯水形成溶液 P。然后,将溶液 C 冷却至室温并在剧烈搅拌下与溶液 P 混合,并通过 2 M NaOH 溶液将溶液的 pH 值调节至 5。溶液的最终体积为 30 mL,额外添加超纯水,Ca 与 P 的摩尔比 (Ca/P) 为 3.3。将最终溶液转移到微波消解系统中进行微波水热反应,并在 120°C 下处理 15 分钟。通过离心(4500 rpm,10 分钟)收集所得沉淀,用超纯水冲洗并冻干48小时。按照文献[24]的方法制备ATP-CL微球。

微球的晶相通过X射线衍射(XRD,Cu Kα源,λ =0.154)。通过扫描电子显微镜 (SEM)、透射电子显微镜 (TEM) 和高分辨率 TEM (HRTEM) 观察微球的形貌。采用傅里叶变换红外分光光度计(FTIR)研究微球的组成。微球的比表面积由 Brunauer-Emmett-Teller (BET) 确定。采用热重分析法(TGA)研究样品在氮气气氛中升温速率为10 °C/min时的热性能。

HEL 吸附和表征

两种微球的HEL吸附实验如下:一定量的蛋黄-壳微球(ATP-CG,Ca/P=3.3,120℃,15min,ATP-CL,Ca/P=2.5, 120 °C,30 分钟)分散在水中,持续超声处理 10 分钟,形成 1.5 mg/mL 的微球悬浮液。然后,立即将含有不同浓度 HEL 的 0.5 mL 水溶液加入 1 mL 以上悬浮液中,药物的最终浓度为 1-7.5 mg/mL。每种溶液在 37°C 下振荡 (200 rpm) 6 小时。随后,将溶液离心,并通过紫外-可见分光光度计在 280 nm 处测量上清液中 HEL 的量。通过zeta电位分析仪、FTIR光谱仪和热重分析仪(TGA,升温速率10 °C min -1 )表征了载药前后微球的zeta电位和组成。 , 氮气气氛).

吸附等温线

为了研究吸附行为,在我们的研究中进行了 Dubinin-Radushkevic 等温线 (D-R) 模型。 D-R模型基于微孔填充理论,用于描述异质表面的非理想吸附以及区分吸附机制(物理吸附或化学吸附)。该模型由以下等式表示: 其中 Q eq 是吸附剂在平衡时的吸附容量 (mg/g),C eq 是平衡时水相中的吸附物浓度 (mL/L)。 m 为最大吸附容量。 R 是气体常数,8.314 J/(mol ∙ k)。 T 是绝对温度。 E 表示用于估计吸附类型的平均自由能。如果 E 8 kJ/mol以下为吸附型,8~16 kJ/mol为离子交换吸附型,大于16 kJ/mol为吸附型.

$$ {Q}_{\mathrm{eq}}={Q}_m\exp \left(-{K}_{\mathrm{DR}}\ {\varepsilon}^2\right) $$ (1) $$ \varepsilon =\text{RT1n}(1+\frac{1}{{C}_\text{eq}}) $$ (2) $$ \mathrm{E}=\frac{1}{\ sqrt{K_{\mathrm{DR}}}} $$ (3)

药物吸附统计分析

数据表示为平均值 ± 标准偏差 (SD) 值。显着差异 (p <0.05) 使用单向方差分析在不同组之间进行统计计算。所有实验一式三份进行,数据使用DPS软件进行分析。

结果与讨论

微球的形态和化学特征

ATP-CG 蛋黄-壳结构微球

图 1 中的 SEM 图像显示了在不同反应条件下获得的各种样品的形貌。在 t =5 分钟或 15 分钟,所有产品均由均匀的微球组成。然而,当水热时间进一步增加到 30 min 时,形成了纳米片自组装微球(如图 1 f、i、l 所示)。同时,在t也观察到Ca/P对产物形貌的影响。 =30 分钟。随着Ca/P的增加,纳米片自组装微球逐渐形成(如图1f,i,l所示)。纳米片自组装微球的形成可以由以下原因解释。首先,在微波水热过程中,ATP分子可以水解形成腺苷基分子,包括二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)和腺苷,同时释放磷酸根离子(PO4 3− )。同时,CG分子可以水解形成葡萄糖酸和钙离子(Ca 2+ )。然后,磷酸根离子将与钙离子反应形成初级 ACP 核 [25]。然后,初始 ACP 核生长并组装形成 ACP 微球。因此,当水热时间进一步延长时,溶液中的ATP和CG分子进一步水解,释放出更多的PO4 3− 和 Ca 2+ 离子,通过提高体系的过饱和度和成核率,形成纳米片自组装微球。此外,通过增加 Ca/P,局部高浓度 Ca 2+ 也以与上述相同的方式加速产品的形态转变。以上分析表明,水热时间和Ca/P对产物的形貌有重要影响。

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微波水热法制备的ATP-CG微球120℃SEM图

接下来,研究了用各种 Ca/P 合成的微球在 120°C 下 15 分钟的 FTIR 光谱(图 2)。 1620 cm −1 处的峰 , 1383 厘米 −1 , 和 912 cm −1 分别归因于 C=O、CG 的 C-O 和 ATP 的 P-O 基团的特征峰 [26],这意味着未水解的 CG 和 ATP 分子或其衍生物被吸收在微球表面。 PO4 3− 的微弱特征峰 从 HAp 位于 1035 cm −1 [27] 1122 cm -1 处的吸收峰 和 567 厘米 −1 分配给 PO4 3− ACP [28] 的离子,表明产物由 ACP 和 HAp 组成。 FTIR结果表明,以ATP为磷源,CG为钙源,成功制备了磷酸钙。

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不同Ca/P合成的ATP-CG微球在120 °C下15 min的FTIR光谱

此外,通过微波水热法在 120°C 下 15 分钟合成各种 Ca/P 的样品的 SEM 和 TEM 图像如图 3 所示。当 Ca/P 为 0.8 或 1.67 时,样品由多孔微球组成(图 3b、d)。当 Ca/P 为 2.5 时,产物的形态开始转变为蛋黄壳结构的微球(图 3f)。随着 Ca/P 进一步增加到 3.3,产品完全由蛋黄壳结构的微球组成(图 3h)。除此之外,在机械压裂后观察到一些破碎的球体和蛋黄-壳微球体的暴露核心(图 3g 中的插入),提供了蛋黄和壳之间中空结构的证据。基于上述观察,我们初步提出了多种Ca/P合成的蛋黄壳结构微球的形成机制。当Ca/P较低时,首先形成多孔ACP微球,这是由于吸附在微球表面的ATP和CG分子或其衍生物的抑制作用。然后,随着 Ca/P 的进一步增加,亚稳态 ACP 将进一步增长,这是由系统的高过饱和度驱动的。最后,晶体 HAps 在外表面上形成,这由图 3i 中微球的高分辨率 TEM(HRTEM)图像证实(0.308 nm 的面间距可以索引为 HAp 的(210))。因此,由于 HAp 和 ACP 之间的体积或密度差异,在蛋黄和壳之间产生了中空结构 [24]。相应的 EDS 映射表明 Ca、P 和 O 元素均匀分布在整个微球中。图3k中的EDS光谱和图3l中的XPS光谱表明微球的化学元素主要包括Ca、P和O,这与FTIR的结果一致(图2)。

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用各种 Ca/P 合成的 ATP-CG 微球的 SEM 和 TEM 图像。 , b Ca/P =0.8。 c , d Ca/P =1.67。 e , f Ca/P =2.5。 g , h Ca/P =3.3。 HRTEM,j EDS 映射,k EDS 光谱,l Ca/P=3.3时ATP-CG微球的XPS光谱

进一步研究了微波辅助水热时间和温度对 Ca/P =3.3 合成的微球形态的影响。如图 4a-b 所示,当水热时间为 5 min 时,样品由多孔微球组成。如上所述,当 t =15 分钟,产品也由蛋黄壳结构的微球组成(图 4c-d)。当水热时间延长到 60 分钟或温度增加到 160 o C,观察到片材或棒材边界(图 4e-l)。从多孔到蛋黄壳再到片状或棒状的形态转变归因于 ACP 的进一步生长以及溶液中 ATP 和 CG 分子的连续水解。此外,吸附在ACP微球表面的ATP和CG分子或其衍生物的水解也加速了ACP的生长。一个有趣的现象出现在 60 分钟或 160 o C,这些片或棒也是由 ACP 纳米粒子开发的(如红色框所示),图 S1 中的 DTA 分析证实了这一点。在 DTA 曲线中观察到 650 °C 的放热峰 [29, 30],这归因于 ACP 结晶。随着水热时间或温度的增加,放热峰逐渐变弱,表明产物中的ACP向结晶磷酸钙转变。

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不同实验条件下Ca/P=3.3合成的ATP-CG微球的SEM和TEM图像。 , b T =120 °C,t =5 分钟。 c , d T =120 °C,t =15 分钟。 e–h T =120 °C,t =60 分钟。 i–l T =160 °C,t =15 分钟

通过FTIR和XRD研究了不同水热时间或温度下Ca/P=3.3合成样品的化学组成和结构。如图 5a 所示,PO4 3− 的特征峰 HAp 的离子位于 1037 cm −1 和 603 厘米 −1 [27]。 1122 cm −1 处的峰 分配给 PO4 3− 的特征峰 来自 ACP 的离子。 1620 cm -1 处有吸收峰 和 1383 厘米 −1 分别归因于来自 CG 的 C=O 和 C-O 基团的特征峰。 912 cm -1 处的吸收峰 指 ATP 的不对称 P-O 伸缩振动。随着水热时间或温度的增加,CG和ATP的特征峰强度逐渐降低,表明吸附在微球表面的ATP和CG分子或其衍生物进一步水解。同时,PO4 3− 的特征峰强度 随着ACP特征峰强度的降低,HAp中的离子呈逐渐增加的趋势,说明产物晶相向HAp相转变。

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FTIR 光谱和 b Ca/P=3.3合成的ATP-CG微球在不同实验条件下的XRD图

图 5b 显示了不同样品的 XRD 谱。 2θ 附近的非晶相特征峰 =观察到在 5 或 15 分钟合成的微球的 30°。然而,当水热时间延长到 60 分钟或温度增加到 160°C 时,微球的晶相完全转变为 HAp,这可以作为标准数据(JDCPS 编号 09-0432)进行索引。 (211)、(300)和(002)晶面相对强度的提高可以进一步解释产品结晶度的增加。因此,XRD和FTIR结果进一步证实了产物随着水热温度或时间的增加发生晶相转变。

ATP-CL 蛋黄-壳结构微球

为了比较药物的吸附行为,以CL为有机钙源,通过微波水热法制备了其他蛋黄壳结构的微球[24]。在形态方面,样品仍由蛋黄壳结构的微球组成,这通过破碎的球体(图 6a 中的插入)和 TEM 图像(图 6b、c)验证。结果表明钙源的变化对产品的形貌没有显着影响。此外,选区电子衍射(SAED)显示了离散的 SAED 点(图 6d),表明获得了结晶良好的微球。此外,EDS 映射显示出微球中 Ca、P 和 O 元素的均匀分布(图 6e)。相应的 EDS 光谱也证实了微球中存在 Ca、P 和 O 元素(图 6f),表明所制备的微球是磷酸钙。

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SEM. b , c TEM 图像 d S 选区电子衍射 (SAED). e EDS 映射和 f ATP-CL微球的EDS光谱

微球的HEL吸附及吸附机理

如图 7 所示,两种微球的吸附能力随着 HEL 初始浓度的增加而增加。当 HEL 的初始浓度增加到 6.5 mg/mL 时,ATP-CG 微球的吸附容量达到一个平台,微球的最大吸附容量约为 332±36 mg/g(图 7a),约为 2 倍高于 ATP-CL 微球(176 ± 33 mg/g,6 mg/mL,图 7b)。

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不同HEL初始浓度下微球的吸附曲线。 ATP-CG 微球。 b ATP-CL微球

FTIR 光谱和 TG 曲线进一步支持了 HEL 吸附结果。如图8a​​、b所示,吸收峰位于1134 cm -1 (1139 厘米 −1 ) 和 563 cm −1 (568 厘米 −1 ) 分配给特征峰 PO4 3− ACP 和 1039 cm −1 的离子 (1040 厘米 −1 ) 分配给 PO4 3− 的特征峰 在 HEL 吸附的微球中观察到 HAp 离子,这表明在微球中引入 HEL 不会引起微球结构的任何显着变化。吸附峰位于 1542 cm -1 和 1545 厘米 −1 在吸附 HEL 的微球中观察到归因于 HEL 酰胺基团的现象,证实 HEL 成功吸附在微球上。同时,在 2966、2962、2935 和 2927 cm -1 处的吸附带 在吸附HEL的微球中也检测到源自-CH3和-CH2基团的HEL,这进一步验证了微球上HEL的存在。 TGA 曲线显示,HEL 吸附前后 ATP-CG 微球的重量损失分别为 11.3% 和 36.7%(图 8c)。因此,ATP-CG 微球的 HEL 吸附容量约为 340 mg/g。然而,在 HEL 吸附之前获得了 21.1% 的 ATP-CL 重量损失,37% 出现在 HEL 吸附微球上(图 8d)。因此,ATP-CL 微球的 HEL 吸附容量为 189 mg/g。 TGA结果与图7的结果很接近。

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HEL吸附前后微球的FT-IR光谱和TGA曲线. FTIR 光谱和 c ATP-CG微球的TGA曲线,b FTIR 光谱和 d ATP-CL微球的TGA曲线

为探究两种微球吸附容量差异的原因,根据D-R等温线模型进一步分析了微球的平衡吸附数据。拟合曲线见图9,拟合参数分别见表1。从拟合结果来看,ATP-CG的相关系数高于ATP-CL,表明D-R模型适合描述ATP-CG微球的药物吸附行为。由于 E 值低于 8 kJ/mol,HEL 对 ATP-CG 微球的吸附是物理吸附。最大容量(Q m) ATP-CG 微球的 HEL 可高达近 381 mg/g,接近图 7a 的结果。

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HEL 在 ATP-CG 微球上的吸附等温线模型。 b HEL在ATP-CL微球上的吸附等温线模型

由于HEL在ATP-CG微球上的吸附是物理吸附,因此研究了微球的表面电位。如图 10a 所示,超纯水中 ATP-CG、ATP-CL 微球和 HEL 的 zeta 电位值分别为 – 17 mV、- 22 mV 和 20 mV。 HEL吸附后,ATP-CG和ATP-CL微球的zeta电位值分别变为2.7 mV和1.5 mV,表明HEL分子通过静电引力吸附到微球表面。然而,静电引力并不是两种微球吸附容量差异的主要原因,因为微球之间的zeta电位值(- 17 mV和- 22 mV)没有显着差异。

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HEL吸附前后HEL和微球的Zeta电位

因此,为了进一步阐明导致微球之间吸收能力差异的原因,对微球的比表面积进行了研究。如图 11a 所示,BET 比表面积 (S ATP-CG 微球的 BET) 为 143 m 2 g −1 , 大约是 ATP-CL 微球 (55 m 2 g −1 , 表 2)。因此,比表面积会影响微球之间的吸收能力差异。 ATP-CG 微球的这种高比表面积主要归因于低结晶度 [31]。从图 11b 可以看出,ATP-CG 微球的结晶度低于 ATP-CL 微球的结晶度。此外,ATP-CG和ATP-CL之间结晶度的差异主要是由于合成条件不同。一般在一定的压力和温度下,产物结晶度随反应物水解程度的增加而增加。在此,葡萄糖酸的酸度(pKa =3.39)高于l-乳酸(pKa =3.86),这会导致较慢的水解速度并最终呈现较低的结晶度。结果,通过改变钙源获得了具有更高比表面积的ATP-CG微球。

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氮吸附-解吸等温线。 b 微球的XRD图

结论

以ATP为有机磷源,CG为有机钙源,通过微波辅助水热法设计了ATP-CG蛋黄壳微球。微球显示出高比表面积和高吸附能力。还研究了Ca/P、水热温度和时间对微球形态和结构的影响。研究表明,有机磷源和有机钙源对蛋黄壳结构微球的形成有显着影响。此外,包括Ca/P、水热和温度在内的热液条件是形成蛋黄-壳微球的原因。此外,通过比较不同钙源合成的两种微球的HEL吸附行为,我们发现比表面积和表面电位等表面化学性质是影响微球吸附能力的两个关键因素。

数据和材料的可用性

支持本文结论的所有数据均包含在本文中。

缩写

赌注:

Brunauer-Emmet-Teller 测量

FTIR:

傅里叶变换红外光谱

TEM:

透射电子显微镜

XRD:

X射线衍射

TGA:

热重分析

HRTEM:

高分辨率透射电镜

SAED:

选区电子衍射


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