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纳米粘土作为 COVID-19 的潜在假抗体

摘要

尽管做出了多项努力,但开发针对 COVID-19 的有效疫苗可能需要更长的时间。人类已经体验过的传统/天然药物可能是较早的解决方案。考虑到研究团队在使用纳米粘土作为癌症转移、黑色素瘤治疗和骨再生的高亲和力材料方面的经验,我们建议使用这些纳米粘土来预防/治疗 COVID-19。由于亲和力高,纳米粘土会在病毒与人类 hACE2 接触之前捕获病毒。在这项研究中,在使用和不使用纳米粘土的情况下,对冠状病毒刺突和 hACE2 蛋白的相互作用进行了分子级模拟和建模。结果表明,与前者和 hACE2 之间的相比,SARS-CoV-2 尖峰和纳米粘土之间具有非常高的亲和力/凝聚力。我们假设这些已被用作药物载体的纳米粘土也可以作为“单独粘土”药物注射。也为未来的体外和体内研究提供了建议。

背景

新型冠状病毒 SARS-CoV-2 的突然出现和迅速传播,除了严重影响世界经济之外,还严重影响了人类的健康和生活。 SARS-CoV-2 刺突 S 与人血管紧张素转换酶 2 (hACE2) 具有高亲和力,并将其用作侵入受体以侵入靶细胞(图 1a、b)[1]。病毒表面刺突蛋白介导冠状病毒进入宿主细胞。 SARS-CoV-2 刺突蛋白包含一个受体结合域 (RBD),可明确识别为其受体 hACE2 [2, 3]。 hACE2 的表面包含两个病毒结合热点,它们对 SARS-CoV-2 S 的结合至关重要。 SARS-CoV-2 RBD 中的几个自然选择突变围绕这些热点并调节 SARS-CoV-2 的传染性、发病机制以及跨物种和人际传播 [2, 4, 5]。

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SARS-CoV-2 攻击人类 hACE2 和随后的免疫系统反应的示意图。 , b RBD结合hACE2而不受干扰。 c RBD 在受体附着位点与抗体复合,因此与 hACE2 竞争。 d RBD在非受体附着位点与RBD复合,导致RBD结构改变,RBD与hACE2的锁键结合中断

目前,还没有临床批准的专门针对 SARS-CoV-2 的疫苗或药物。遵循开发疫苗的实际方案,可能需要更长的时间才能开发出有效的疫苗。人们对开发针对 SARS-CoV-2 的治疗性抗体很感兴趣。然而,尽管进行了许多努力,但除少数试验 [7] 外,这些抗体尚未被发现 [6]。一项试验表明,通过与其 S 糖蛋白的 RBD 结合,可以有效地中和 SARS-CoV-2 [8]。在该试验 [8] 中,建议使用抗体混合物,即不同抗体的混合物,因为它对 SARS-CoV-2 具有增强的中和作用。然而,过去使用 SARS-CoV 恢复期患者的抗体治疗 SARS-CoV 感染已显示患者出现不良反应,例如抗体依赖性增强 (ADE),导致病毒传染性增加和其他有害免疫反应 [7]。此外,根据 SARS-CoV 和 MERS 疫苗开发工作的经验,为 SARS-CoV-2 所做的努力实现的可能性似乎很小。因此,具有人类安全消费/摄入历史的天然/传统药物可被视为 SARS-CoV-2 的治疗选择之一。作为一种天然材料和人类使用/消费的历史,我们建议将“高电荷纳米粘土”用作冠状病毒阻断剂和刺突介导进入人体细胞的抑制剂。

纳米粘土是源自沉积岩矿物的纳米级天然材料,对细菌和病毒具有非常高的亲和力 [9]。由于分子结构中的同晶取代,这些纳米粘土在其表面上表现出电荷不足。它们表面的电荷不足被水分子和溶解的阳离子中和(图 2)。粘土纳米粒子的带电结构和大表面积使它们对带电实体具有亲和力,如在细菌表面和细菌毒素上发现的那样。它们独特的生物医学特性包括高吸收性、吞噬微生物的能力和无毒性。每种电活性粘土矿物都有其独特的形态、特征和相互作用行为。纳米粘土研究最多的生物医学应用包括作为抗癌药物的载体和复合物,如 5-氟尿嘧啶和曲妥珠单抗 [11,12,13,14,15,16,17]。因此,它们已成为多种疾病的潜在替代药物 [18,19,20,21,22]。粘土纳米粒子由于其粘性,也被用作缓释药物的载体 [15, 23]。纳米粘土也已成功用于吸附和治疗牛轮状病毒和牛冠状病毒 [24]。研究人员 [25] 将抗癌剂甲氨蝶呤 (MTX) 插入阴离子粘土中以制造纳米混合药物。他们使用共沉淀和随后的水热方法制备了这种化学、结构和形态上明确定义的二维药物-粘土纳米混合物。研究人员 [26] 发现,由于具有生物相容性和高负载能力,膨润土纳米粘土可用于制备给药载体。在这项研究中,他们制备了阿霉素-膨润土纳米粘土复合物(DOX-Bent复合物),形成了黑色素瘤瘤内化疗的缓释给药系统。由于最近正在研究将蒙脱石粘土用作添加剂和药物载体材料,因此这些纳米粘土复合材料吸引了它们以各种剂量形式使用,主要用于药物的控制释放 [27]。研究人员 [28] 还发现,纳米粘土可用于最近的双功能药物递送系统 (DDS),以提高药物递送效率,从而降低用于甲状腺癌治疗的阿霉素 (DOX) 的毒性。研究人员 [29] 使用 12 个单单型光可裂解两亲 Janus 树枝状聚合物库,开发了一种自组装光响应树枝状聚合物囊泡平台。与纳米粘土类似,来自(糖)树状体的表面修饰的生物活性病毒模拟有机纳米囊泡具有结构修饰,有助于表现出 SARS-CoV-2 和宿主病原分子相互作用,帮助病毒逃离人体免疫系统[30].

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SEM 图像和 b Na-蒙脱石的相应分子结构显示了构型、同晶取代、电荷缺乏和层间阳离子(来自[10])

通过大量先前的研究,我们开发了带电粘土矿物的基本表征和行为模型 [31,32,33],及其在控制癌症转移 [10]、黑色素瘤治疗的体外和体内研究 [34] 中的应用,以及钙沉积/骨再生研究 [35]。在作者之前的一项研究 [35] 中,已经证明粘土纳米颗粒对带电表面具有高亲和力。纳米粘土的高吸引力亲和力和癌细胞非特异性粘附吸引力的增加使纳米粘土成为控制癌症转移的有利候选者。在该研究中,我们证明了可能使用两种带电粘土矿物来控制癌细胞的转移:蒙脱石钠 (SWy-3) 和坡缕石 (PFl-1)。继作者先前关于使用这些纳米粘土控制癌症转移的研究结果 [35] 之外,我们还通过体外和体内研究确定这些纳米粘土对黑色素瘤具有抑制作用癌细胞,主要是细胞增殖和活力[34]。在这些先前的研究中,除了实验室实验外,还对纳米粘土和细胞的相互作用进行了分子水平的模拟。这些模拟提供了对与粘土纳米粒子相互作用和不与粘土纳米粒子相互作用的内聚性/亲和力的相对水平的评估。

基于作者对纳米粘土的高亲和力潜力的所有上述经验,我们提出纳米粘土可以被模仿为抗体,从而可以在冠状病毒与人类 hACE2 接触之前吸引并吞噬它们。本文是通过分子级模拟和建模方法建立这种感知的第一步。根据分子水平模拟的结果,还提供了对体外和体内研究下一阶段的建议的概述。由于这些纳米粘土也成功地用作药物载体,我们也假设它们也可以作为“单独粘土”药物注射/摄入,因此,我们为此提出了一种暂定的纳米粘土给药方法。

材料—分子

SARS-CoV-2和hACE2的选择和配制

从蛋白质数据库网站 RCSB [36,37,38] 获得了 SARS-CoV-2 尖峰 S 和 hACE2 的分子。 Materials Studio软件[39]中制定的SARS-CoV-2spike S和hACE2的分子模型分别如图3a、b所示。在进行模拟之前,这些分子使用软件的电荷平衡法QEq进行充电。

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a的分子水平模型 SARS-CoV-2 尖峰,b hACE2 和 c 在 Materials Studio 软件中配制钠蒙脱石微晶

纳米粘土微晶的选择与配方

Na-蒙脱石是粘土矿物蒙脱石组中最活跃的成员之一,被选为研究对象。钠蒙脱石是层状页硅酸盐粘土蒙脱石(图 2)。在胶体形式中,相邻层之间的空间可以包含游离的钠、钙或镁阳离子,这些阳离子被静电吸引到带负电的外部表面 [40]。在其干粉状态下,Na-蒙脱石以等维薄片/片的形式存在,尺寸约为 0.5 × 0.5 × 0.001 微米(图 2a)。其夹层表面上的这些负电荷由阳离子平衡。作为胶体,层间阳离子从粘土颗粒中解离并与其他带负电的表面结合。由于在其末端存在断裂的键,这些颗粒也具有带正电的边缘。表 1 提供了这些纳米粘土的形态和进一步的特性,下面解释了它们在 Materials Studio 软件中的微晶配方。

在该软件中,钠蒙脱石微晶是根据 CEC、可交换阳离子和层间电荷等基本特性制定的(表 1)。根据使用动态光散射 (DLS) 技术的粒度分析结果选择分子/微晶尺寸 [10]。在软件中创建的粘土微晶的最终形式如图 3c 所示。在使用软件的设计模式利用固有特性制备这些微晶后,使用软件的电荷平衡方法QEq对这些微晶进行充电。

方法——分子级模拟

这部分研究包括模拟和评估 SARS-CoV-2 尖峰 S 与粘土微晶和 hACE2 的相互作用。虽然这些模型可能不是实际体外条件的完全复制,但它们已经包含了所有必要的相互作用,非常适合预期的相关和比较研究。

在该软件中,使用蒙特卡罗 (MC) 和分子力学 (MM) 技术对 SARS-CoV-2 S、Na-蒙脱石微晶和 hACE2 的配方配置进行了吸附和模拟。根据计算的内聚能密度 (CED) 评估所有模拟配置中亲和力的增强 - CED 被视为分子系统内聚性的测量。由于模拟中涉及大型计算,这些计算是使用 KFUPM, KSA 的高性能计算设施 (HPC) 进行的。总体方法和特定方法的选择以及仿真参数均基于作者先前的研究[41,42,43,44,45,46,47],在后续部分中详细说明。

SARS-CoV-2 Spike (S) 与 hACE2 和粘土微晶的相互作用

为了模拟 SARS-CoV-2 S 与粘土微晶的相互作用,在 SARS-CoV-2 S 模型上吸附了各种数量的 Na-蒙脱石粘土微晶。对于这些吸附模拟,在软件的吸附模块中选择了 Metropolis Monte Carlo 方法。在每个吸附步骤中,粘土微晶占据尖峰 S 模型周围的空间以降低复合物的整体能量。以最多 25,000 个步骤吸附所需数量的微晶,然后使用基于 MD 原理的软件的 Forcite 模块最小化系统能量。对于 SARS-CoV-2 尖峰分子与 hACE2 的相互作用建模,重复了类似的吸附过程。在这个过程中,hACE2 分子被吸附在 SARS-CoV-2 的尖峰 S 的 RBD 周围。吸附过程完成后,使用基于MD的软件模块使配方能量最小化。

包含 NPT(恒定粒子数、压力和温度)集合的软件的 Forcite 模块用于具有修改后的通用力场的 MD 模拟 [41]。模拟运行 5 到 30 ps,间隔为 0.5-fs 或直到获得恒定体积。使用衰减常数为 0.1 ps 的 Berendsen 恒温器来控制模拟过程中的温度。在 MD 模拟过程中,假设温度在大气压 (100 kPa) 下保持恒定在 310 K (37 °C)。使用衰减常数为 0.1 ps 的 Berendsen 恒压器来控制系统的压力。 Berendsen 方法被认为是最适用于单晶的方法,经过几次涉及软件中可用的其他恒温器和恒压器的试验后,被认为是最适合的。在蒙特卡罗方法中,交换、构象、旋转、平移和再生比率的参数分别选择为 0.39、0.2、0.2、0.2 和 0.2,相应的概率为 0.39、0.2、0.2、0.2 和0.2.适应旋转和平移的幅度分别为5°和1 Å。

内聚能密度 (CED) 测量

在这项研究中,通过 CED 的变化测量了 SARS-CoV-2-粘土微晶和 SARS-CoV-2-hACE2 复合物的亲和力/结合水平。在粘土微晶的吸附和每个配置的分子动力学的后续表现之后,使用软件的 Forcite 模块的内聚能密度选项确定 CED。作者的经验是,由总、范德华和静电 CED 组成的 CED 概念可以非常准确地解释各种分子水平的过程和相互作用,并模拟模拟复合物之间产生的亲和力/结合程度 [41,42 ,43,44,45,46,47]。从数量上讲,CED 定义为 1 mol 材料从液相转变为气相所需的能量。它也是分子相互亲和力/吸引力的度量,并表示为静电力和范德华力,在 NPT 系综上取平均值。

在 Forcite 模块中,使用基于原子的截止值来评估范德华能量。在这种方法中,非键相互作用被简单地计算到一个截止距离,超出这个距离的相互作用被忽略。为了避免由直接截止引起的不连续性,大多数模拟使用切换函数来平滑地关闭一定距离范围内的非键相互作用。通过将实际电位乘以平滑函数来创建有效电位。在中间范围内选择函数是至关重要的,并且应该在该区域内连续可微,以便可以计算力。在本研究中,使用三次样条平滑函数,样条宽度为 1 Å,截止距离为 12.5 Å。

结果和讨论

SARS-CoV-2 S-hACE2 复合物的最终构型如图 4a 所示,而 SARS-CoV-2 尖峰与不同数量的粘土 Na-蒙脱石微晶之间的复合物分别如图 4b、c 所示。为了比较,图 5 绘制了 SARS-CoV-2 尖峰上不同比例/数量的粘土微晶的总 CED 以及后者与 hACE2 的相互作用。

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Materials Studio 软件中的分子级模拟结果。 SARS-CoV-2 S 和 hACE2(CED =1 J/cm 3 ), b SARS-CoV-2 S 模型与 12 种钠蒙脱石微晶相互作用 (CED =28 J/cm 3 ) 和 c SARS-CoV-2 S 模型与 24 种钠蒙脱石微晶相互作用 (CED =154 J/cm 3 )—使用软件中实现的吸附技术获得

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SARS-CoV-2 S-hACE2的内聚能密度(CED)变化及其与不同数量钠蒙脱石微晶的复合物

根据我们的经验,我们假设纳米粘土由于其高粘性,也可以作为 SARS-CoV-2 抑制剂。他们可以通过与 SARS-CoV-2 上存在的尖峰 S 强关联来做到这一点。从相互作用的分子级模拟中获得的结果表明,与前者和 hACE2 相比,SARS-CoV-2 和纳米粘土之间的 CED 非常高(图 5),它们可以抑制 SARS-CoV-2 2 与 hACE2 接触。此外,从图5还可以得出结论,纳米粘土的抑制程度以数量(剂量)依赖性方式增加。

纳米粘土与 SARS-CoV-2 Spike S 的相互作用

作者在他们早期的研究中已经证明了纳米粘土在促进癌细胞与其微环境之间的粘附并因此控制转移方面的作用 [10]。 Na-蒙脱石和坡缕石的 75/25 混合物的粘附测量显示癌细胞和细胞外基质蛋白之间的粘附增加了 100%(图 6a)。结合 Raji 细胞和纤连蛋白的纳米粘土的相应 SEM 显示在图 6b 中。样品成​​像是在佛罗里达州迈阿密大学米勒医学院的 FEI ESEM-FEG XL-30 中以 SEM 模式进行的。作者在之前的研究中还发现,静电、范德华力和 ZP 吸引力似乎在粘附过程中占主导地位 [10]。我们得出结论,同样的机制也促进了纳米粘土的粘合表面与 SARS-COV-2 尖峰的结合(图 7)。 ZP 是胶体形式的分散或絮凝趋势的量度,包括与悬浮介质中存在的其他成分的相互作用。一般而言,zeta 电位大于 30 mV(正或负)表示有分散趋势,而 zeta 电位小于 5 mV 通常会导致团聚。研究中使用的粘土纳米粒子的较高分散趋势 ZP(- 24 至 - 32 mV)导致较高的分散趋势,因此产生更高的表面积,放大了与 SARS-CoV-2 尖峰的相互作用。虽然基于其 ZP,钠蒙脱石纳米粒子具有亲水性,但在盐的存在下,它们也会促进疏水和亲水表面之间的二次粘附机制 [10]。还应注意的是,这些粘土纳米粒子由于其亲水性和相对较高的排斥酸碱 (AB) 相互作用而具有高分散趋势(表 1)。反过来,高分散导致产生高表面积以增加吸引力相互作用。由于范德华吸引力和带相反电荷的表面之间的静电力,更高的表面积促进了更大的吸引力。此外,虽然程度相对较小,但Na-蒙脱石颗粒的带正电荷边缘也被电吸引到尖峰S。

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在用不同比例的钠蒙脱石和坡缕石粘土纳米粒子处理之前和之后,使用 AFM 测量 Raji-Raji-FN 组件之间的粘附力的总结 [10]。误差棒代表试验中的变化。 b Raji细胞与纳米粘土产生的纤连蛋白结合的SEM图

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蒙脱石纳米粘土与 SARS-CoV-2 尖峰 S 相互作用的三种可能机制:(1)带正电荷的纳米颗粒边缘和带负电荷的病毒表面的 Na/Ca 离子之间的静电吸引。 (2) 范德瓦尔斯景点。 (3) ZP静电相互作用

SARS-CoV-2 尖峰 S 与粘土微晶相互作用的分子级模拟结果(图 5)也证实了上述相互作用行为。已经观察到粘土纳米颗粒的吸附导致紧密相互作用的强范德华引力场的形成。这些范德瓦尔斯引力场创造了粘土/SARS-CoV-2 配置的更高 CED。添加粘土微晶后总 CED 显着增加(图 5)也证明了 SARS-CoV-2 与这些颗粒的亲和力与前者与 hACE2 的亲和力相比非常高。

作为伪抗体的纳米粘土

基于作者目前和过去的所有研究,确定了纳米粘土的高亲和力潜力,我们假设纳米粘土可以被模仿为抗体,因此可以在冠状病毒与人类 hACE2 接触之前吸引并吞噬它们。抗体是由浆细胞合成的糖蛋白,作为适应性免疫反应的一部分,有助于清除体内感染。抗体以多种方式帮助清除感染,例如调理病原体以促进吞噬作用、激活补体系统、微生物凝集以及中和病毒和毒素。当与病毒表面蛋白结合时,抗体通过阻止病毒附着到细胞上的目标受体来阻止病毒进入细胞。抗体结合可以发生在表面蛋白的不同位点,导致产生相同效果的各种机制。在 SARS-CoV-2 的情况下,已经观察到抗体的两种病毒中和机制 [1, 48],如图 1c、d 所示。其中一种机制涉及抗体与 SARS-CoV-2-RBD 的附着位点的直接结合,导致抗体与目标受体 hACE2 竞争。另一种机制涉及抗体与 RBD 上其他位点的结合,而不与目标受体发生任何竞争。后者被证明参与了研究中发现的最有效的单克隆抗体 (mAb) 的中和作用 [1, 48]。类似于抗体与 SARS-CoV-2 RBD 的相互作用,抑制后者与 hACE2 结合,为纳米粘土制备了类似的分子水平模型,导致对冠状病毒的类似抑制,如图 8 所示。由于它们非常高的亲和力,纳米粘土会被 SARS-CoV-2 的尖峰吸引,从而限制这些尖峰的 RBD 与 hACE2 的结合。

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纳米粘土颗粒与SARS-CoV-2spike S抑制后者与hACE2相互作用的相互作用机制

提议的纳米粘土管理方法

粘土用作药物载体已经过多次测试,产生了对人体细胞几乎没有细胞毒性的有希望的结果。高岭石粘土矿物经过测试可用于潜在的药物递送系统,并显示出具有高生物相容性和非常低的细胞毒性 [11]。聚(d,l-丙交酯-共-乙交酯)/蒙脱石纳米颗粒体外细胞毒性也被证明可以忽略不计[14]。坡缕石-聚乙烯亚胺-异硫氰酸荧光素纳米复合材料在体外也几乎没有细胞毒性[13]。在体内研究期间,作者还体验了皮下注射纳米粘土治疗黑色素瘤的经验 [34]。基于粘土作为抗癌药物载体和其他缓释药物的使用[25,26,27,28],我们提出纳米粘土可以作为“粘土单独”药物注射,待体内验证和临床试验。

尽管纳米粘土是不可生物降解的,但在研究 [49] 中对类似无机纳米颗粒的设计及其在体内代谢性能的综合理解也可以将这些纳米粘土归类为人体可清除的无机试剂。

结论和建议

基于作者目前和过去的所有研究,确定了纳米粘土的高亲和力潜力,这些可以被模仿为抗体,从而可以在冠状病毒与人类 hACE2 接触之前吸引并吞噬它们。

SARS-CoV-2 尖峰 S 与粘土微晶相互作用的分子级模拟结果导致形成密切相互作用的强范德瓦尔斯引力场。这些范德瓦尔斯引力场创造了粘土/SARS-CoV-2 配置的更高 CED。添加粘土微晶后总CED的显着增加也证明了SARS-CoV-2与这些颗粒的亲和力与前者与hACE2的亲和力相比非常高。

我们建议通过在 SARS-CoV-2 与不同百分比的纳米粘土之间进行体外相互作用研究来继续研究。基于在体外阶段开发的纳米粘土的最佳剂量,我们建议对动物进行体内研究。应在有无纳米粘土的情况下进行动物研究,以确定纳米粘土的剂量,并为临床试验奠定基础。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章中。


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