通过靶向 Sox6

介绍

脓毒症是一种全身炎症，由感染引起并导致多器官功能障碍，包括急性呼吸窘迫综合征 [1]。它的特点是严重的低血压、进行性低氧血症、组织损伤和炎症改变[2]。肺是脓毒症中最关键和最脆弱的器官，急性肺损伤(ALI)是一种常见的脓毒症诱发的炎症性疾病[3]。脓毒症引起的 ALI 的严重程度可归因于肺泡毛细血管网络的通透性受损，导致供氧减少 [4]。肺细胞凋亡是脓毒症所致肺损伤的关键因素[5]。脓毒症所致 ALI 的病理生理学尚不清楚，支持措施和抗生素是脓毒症和 ALI 患者唯一可用的治疗方法，它们对脓毒症高死亡率的影响有限[6]。

MicroRNAs (miRNAs) 是内源性表达的 RNA 的非编码小片段，由大约 18-24 个核苷酸组成，可以控制广泛的细胞功能，并与特定基因的靶区域结合，通过抑制或激活 mRNA 来控制其表达翻译/转录 [7]。 MiR-499-5p 是最近发现的肌球蛋白编码 miRNA 的成员 [8]。一项研究报道，miR-499-5p 的血清水平可用于指示脓毒症患者的器官衰竭 [9]。另一项研究表明，miR-499-5p 的表达参与了脓毒症诱导的心脏细胞凋亡 [10]。性别决定区 Y (SRY) 相关的高迁移率盒 (HMG) (SOX) 家族由一组基因定义，包括 HMG 类 DNA 结合域，其与 SRY 的序列同一性大于 50% [11] . Sox6 转录因子是 SRY 相关 HMG-box 家族的一部分，在进展过程中在多个组织中表达，在从增殖祖细胞到功能成熟细胞的过渡中发挥关键作用 [12]。有一项研究报告称，升高的 Sox6 与败血症诱导的心脏细胞凋亡有关 [10]。研究表明，Sox2 表达和 Sox4 表达在人类小细胞肺癌中升高 [13, 14]。但Sox6与脓毒症肺损伤的关系需要进一步研究。因此，本研究旨在探讨miR-499-5p靶向Sox6对脓毒症肺损伤小鼠的保护作用。

材料和方法

遵守道德标准

所有动物实验均符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。该方案经山东大学奇鲁医学院威海市医院动物实验伦理委员会批准。

实验动物

健康雄性无特定病原体级 BABL/c 小鼠（6-8 周龄，体重 18-22 g）购自山东大学（中国山东）实验动物中心。环境设置为24 ± 2°C，12个明暗交替。小鼠可以自由获得无菌食物和无菌水。适应性喂养7 d后开始实验。

通过盲肠结扎和穿刺 (CLP) 在小鼠中建立败血症诱导的肺损伤模型

小鼠随机分为 2 组：假手术组（n =8) 和模型组。小鼠术前禁食12 h，然后用1%戊巴比妥钠(70 mg/kg)腹腔注射麻醉。观察麻醉效果；注意到老鼠的呼吸和心跳。取小鼠头、四肢仰卧固定，取腹部皮肤，用碘伏棉球消毒。模型组小鼠在腹部正中线中段纵切口（1.0 cm），打开腹腔，从腹腔中拔出盲肠，避免损伤肠系膜血管。在盲肠末端1/2处用1-0丝线结扎，用16号穿刺针在对侧肠系膜边缘穿刺盲肠，挤出适量肠内容物，将盲肠放回原处，缝合切口。打开腹腔后，sham组小鼠只拔出盲肠，再放回盲肠。小鼠术后皮下注射0.9%氯化钠溶液1 mL，分笼饲养。

体内转染

建模前，将小鼠分为 7 组（n =8)：模型组、miR-499-5p agomir组、agomir阴性对照（NC）组、小干扰RNA（si）-Sox6组、si-NC组、miR-499-5p agomir + 过表达(oe)-Sox6组和miR-499-5p agomir + oe-NC组。建模前一小时，根据分组处理小鼠。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉后，固定于45°斜位仰卧位，将小鼠舌移至口腔另一侧以保证呼吸道通畅。对小鼠颈部前部皮肤进行消毒并切掉以暴露气管。转染复合物(50 μL)用微量进样器吸收(按组滴入，模型组滴入等量磷酸盐缓冲液(PBS))，然后缓慢滴入气管。转染后，小鼠垂直旋转，转染复合物完全分布到肺部[15]。在转染过程中，观察小鼠的呼吸和心跳。如出现呼吸和心脏骤停，立即停止转染，呼吸道通畅。待小鼠呼吸、心跳平稳后继续转染。 MiR-499-5p agomir及其NC以及相应的Sox6质粒购自上海基因制药有限公司（中国上海）。转染后，将小鼠分笼饲养1 d，然后安乐死。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，仰卧位固定，腹主动脉静脉切开安乐死。小鼠皮肤局部消毒，打开胸腔，结扎气管和右主支气管，断开右主支气管，取出右肺。将右肺下叶置于10%中性福尔马林中进行病理检查，迅速称中肺叶重量计算湿重（W），56℃烘烤，72h后计算干重（D），从而计算出 W/D 比。右上叶保存在液氮中用于 mRNA 和蛋白质检测。左肺用0.4 mL生理盐水洗涤3次，收集约1 mL支气管肺泡灌洗液（BALF），移至1.5 mL Eppendorf（EP）管中并置于冰上。 BALF 1500 rpm离心5 min后转移至新的EP管中，-80℃保存用于炎症因子检测。

此外，将小鼠分为3组（n =10/组）：sham组、模型组和miR-499-5p agomir组（术前1h气管滴注50 μL miR-499-5p agomir）。每12 h监测一次存活率，共7 d。观察7 d内小鼠的存活情况，测定miR-499-5p的毒性[16]。

苏木精-曙红 (H&E) 染色和损伤评分

肺组织制备成石蜡切片，H&E染色，光学显微镜下观察。通过美国胸科学会发布的肺损伤病理评分系统对肺损伤进行评分（肺泡充血、出血、中性粒细胞浸润或肺泡腔或血管壁聚集、肺泡壁增厚和/或透明膜形成）。 0 分表示没有或非常轻微的病变； 1分表示病变轻微； 2分表示中度病变； 3分表示病变严重； 4分表示非常严重的病变。四项总分为肺损伤总分[17]。

马森染色和评分

将肺组织制成石蜡切片 (4 µm) 并用 Masson 染色 [18]。胶原纤维、粘液和软骨呈蓝色，细胞质、肌肉、纤维素和神经胶质呈红色，细胞核呈蓝黑色。在半定量Ashcroft评分系统[19]中，0分表示肺正常； 1分表示肺泡或支气管壁轻度纤维增厚； 3分表示肺泡或细支气管壁中度增厚，肺结构未受损； 5分表示纤维化加重，伴有肺结构损伤，形成纤维带或肿块； 7分表示肺结构严重损伤和大面积纤维化，形成纤维带或团块； 8分表示所有区域纤维堆积。

末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸-生物素缺口末端标记 (TUNEL) 染色

通过TUNEL试剂盒（Roche Diagnostics GmbH，Mannheim，Germany）检测肺组织的凋亡，并通过光学显微镜观察。凋亡细胞在细胞核中被染成棕色。凋亡指数表示TUNEL阳性细胞的百分比[20]。

免疫组织化学

肺组织切片用二甲苯脱蜡，用3%过氧化氢孵育并用山羊血清封闭。然后，Caspase-3 (ab13847, 1:500)、Caspase-9 (ab32539, 1:250) 和 SOX6 (ab30455, 1:500, 均来自 Abcam, MA, USA) 作为免疫染色切片的抗体。使用光学显微镜（Leica Microsystems，IL，USA）捕获图像，然后使用 Image Pro Plus 6.0 软件（Media Cyber​​netics，Rockville，MA，USA）进行分析 [21]。

逆转录定量聚合酶链反应 (RT-qPCR)

采用OMEGA试剂盒（北京阳光生物科技有限公司）提取肺组织总RNA并测定RNA浓度。互补 DNA (cDNA) 由逆转录组成，符合 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，Massachusetts，USA）。引物由 Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 设计，如表 1 所示。PCR 反应按照 FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) 试剂盒 (Roche) 进行。通过2 ^{−△△Ct对实验进行定量分析} 方法。 U6为miR-499-5p的加载对照，GAPDH为其他基因的内参[22]。

蛋白质印迹分析

使用放射免疫沉淀测定裂解缓冲液收集总蛋白以处理肺组织。总蛋白浓度采用二辛可宁酸法测定。蛋白样品（30 μg）经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳处理，转移至聚偏氟乙烯膜上，用5%脱脂奶粉封闭，与一抗Sox6（ab30455，1:1000，Abcam）、Caspase反应-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), 肿瘤坏死因子-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam )、白细胞介素-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, USA)、IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) 和 GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA）。然后，将膜与二抗（1:2000）孵育并通过增强化学发光显色[23]。

酶联免疫吸附测定 (ELISA)

用ELISA试剂盒（Boster，湖北，中国）测定BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。在450 nm处进行比色测定。

氧化应激指数检测

将肺组织在液氮中称重并在低温条件下用一定比例的生理盐水稀释，然后匀浆，4℃、3000r/min低温离心20分钟，取上清液进行测定。髓过氧化物酶（MPO）活性采用MPO检测试剂盒（南京健城生物工程研究所，南京，中国）检测，丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和过氧化氢酶（CAT）进行检测试剂盒由建诚生物工程研究所提供。

双荧光素酶报告基因检测

Sox6可能是某生物网站（http://www.targetscan.org/vert_72/）预测的miR-499-5p的靶基因。 miR-499-5p 和 Sox6 mRNA 3'非翻译区 (UTR) 之间有四个结合位点。 pmiR-RB-REPORT-Sox6 野生型（WT）和 pmiR-RB-REPORT-Sox6 突变型（MUT）载体由广州日博生物有限公司（中国广东）构建，相应的荧光素酶报告质粒为生成。 TC-1细胞（小鼠肺上皮细胞，1 × 10 ⁵ 细胞/孔，上海一燕生物科技有限公司，上海，中国）接种于 24 孔板，并用 miR-499-5p agomir 或 agomir-NC、pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT 或pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT 通过 Lipofectamine2000。应用双荧光素酶报告基因检测系统（Promega，WI，USA）检测荧光素酶活性。

统计分析

所有数据均通过 SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA) 软件进行分析。测量数据以平均值 ± 标准偏差表示。通过t进行两组之间的比较 检验，多组间的比较采用单向方差分析（ANOVA）进行评估，ANOVA分析后采用Tukey事后检验进行两两比较。生存曲线采用 Kaplan-Meier 法制作。 P 值 <0.05表示差异有统计学意义。

结果

W/D 比率和 Sox6 增加，而 miR-499-5p 在脓毒症诱导的肺损伤小鼠的肺组织中减少

在小鼠身上测试了 miR-499-5p 的毒性，以检测脓毒症小鼠的存活时间。结果显示（图1a）假手术组小鼠7 d内存活率为100%，败血症小鼠存活率降低。 miR-499-5p治疗后脓毒症小鼠的存活率得到提高。肺组织W/D比值结果表明（图1b）：与假手术组相比，模型组W/D比值升高（P <0.05)。与agomir NC组和si-NC组相比，miR-499-5p agomir组和si-Sox6组的W/D比降低（均P <0.05)。与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比，miR-499-5p agomir + oe-Sox6 组的 W/D 比显着提高（P <0.05).

在脓毒症诱导的肺损伤小鼠的肺组织中，W/D 比和 Sox6 增加，而 miR-499-5p 减少。 一 Kaplan-Meier 制作的小鼠生存曲线。 b 各组肺组织的 W/D 比。 c miR-499-5p在小鼠肺组织中的表达。 d Sox6 mRNA在小鼠肺组织中的表达。 e 通过蛋白质印迹分析得到的 Sox6 蛋白条带。 f Sox6 在小鼠肺组织中的蛋白表达。 g 小鼠肺组织的 Sox6 免疫组织化学。 (a) P <0.05 与假手术组相比。 (b) P <0.05 与agomir NC 组相比。 (c) P <0.05 与 si-NC 组相比。 (d) P <0.05 与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比。测量数据表示为平均值 ± 标准差，数据采用单向方差分析和Tukey事后检验评估

检测到 MiR-499-5p 和 Sox6 表达，我们发现（图 1c-f）：与假手术组相比，模型组中 miR-499-5p 降低，Sox6 升高（均 P <0.05)。与agomir NC组相比，miR-499-5p agomir组的miR-499-5p升高而Sox6降低（均P <0.05)。与 si-NC 组相比，si-Sox6 组中的 Sox6 被抑制 (P <0.05)。与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比，miR-499-5p agomir + oe-Sox6 组的 Sox6 显着升高（P <0.05).

通过免疫组织化学测定败血症小鼠肺组织中 Sox6 的蛋白质含量（图 1g）。观察到与假手术组相比，模型组Sox6蛋白表达增加（P <0.05)；与agomir NC组和si-NC组相比，miR-499-5p agomir组和si-Sox6组的Sox6蛋白表达较低（均P <0.05)；相对于miR-499-5p agomir + oe-NC组，miR-499-5p agomir + oe-Sox6组中Sox6蛋白表达增强（P <0.05).

恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 可减轻肺组织病理学、降低肺损伤评分、胶原纤维和脓毒症引起的肺损伤中的肺纤维化程度老鼠

HE染色结果显示（图2a）：Sham组肺组织结构完整，肺泡间隔基本无水肿、炎症，肺泡腔清晰。模型中，agomir NC、si-NC和miR-499-5p agomir + oe-Sox6组，肺组织大部分肺泡腔可见渗出、水肿和出血，肺间质可见大量炎性细胞浸润。 miR-499-5p agomir、si-Sox6和miR-499-5p agomir + oe-NC组肺组织病变较模型组减少。

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恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 可减轻肺组织病理，降低肺损伤评分、胶原纤维和败血症诱导的肺损伤小鼠的肺纤维化程度。 一 小鼠肺组织HE染色结果。 b 各组小鼠肺组织损伤评分。 c 小鼠肺组织的 Masson 染色。 d 各组小鼠肺纤维化评分。 (a) P <0.05 与假手术组相比。 (b) P <0.05 与agomir NC 组相比。 (c) P <0.05 与 si-NC 组相比。 (d) P <0.05 与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比。测量数据表示为平均值 ± 标准差，数据采用单向方差分析和Tukey事后检验评估

小鼠肺损伤评分和半定量Ashcroft评分结果显示（图2b、d）：与假手术组相比，模型组肺损伤评分和肺纤维化程度明显提高（P <0.05)。与agomir NC组和si-NC组相比，miR-499-5p agomir和si-Sox6组的肺损伤评分和肺纤维化程度降低（均P <0.05)。与miR-499-5p agomir + oe-NC组相比，miR-499-5p agomir + oe-Sox6组的肺损伤评分和肺纤维化程度显着升高（P <0.05).

Masson染色结果显示（图2c）：Sham组小鼠肺组织中含有少量蓝色胶原纤维。在模型中，agomir NC、si-NC和miR-499-5p agomir + oe-Sox6组，胶原纤维增加。 miR-499-5p agomir组、si-Sox6组和miR-499-5p agomir + oe-NC组胶原纤维较模型组减少。

恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 降低了脓毒症诱导的肺损伤小鼠肺组织中 TUNEL 阳性细胞、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白的表达

Western印迹、TUNEL染色和免疫组织化学结果表明（图3a-f）：正常细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的棕色。与假手术组相比，模型组TUNEL阳性细胞、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达增强（均P <0.05)。与agomir NC和si-NC组相比，miR-499-5p agomir和si-Sox6组中TUNEL阳性细胞、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达降低（所有P <0.05)。与miR-499-5p agomir + oe-NC组相比，miR-499-5p agomir + oe-Sox6组TUNEL阳性细胞、Caspase-3和Caspase-9蛋白表达升高（均P <0.05).

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恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 降低了脓毒症诱导的肺损伤小鼠肺组织中 TUNEL 阳性细胞、Caspase-3 和 Caspase-9 蛋白的表达。 一 小鼠肺组织中的 TUNEL 阳性细胞。 b 小鼠肺组织中TUNEL阳性细胞数。 c 小鼠肺组织中Caspase-3和Caspase-9的免疫组化； d 小鼠肺组织中 Caspase-3 和 Caspase-9 的平均 OD 值。 e 小鼠肺组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白条带。 f 各组小鼠肺组织中Caspase-3和Caspase-9蛋白表达情况。 (a) P <0.05 与假手术组相比。 (b) P <0.05 与agomir NC 组相比。 (c) P <0.05 与 si-NC 组相比。 (d) P <0.05 与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比。测量数据表示为平均值 ± 标准差，数据采用单向方差分析和Tukey事后检验评估

恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 降低脓毒症诱导的肺损伤的 BALF 和肺组织中的 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 含量老鼠

ELISA和Western blot结果显示（图4a-g）：模型组TNF-α、IL-1β和IL-6含量较假手术组增加（均P我> <0.05)。与agomir NC和si-NC组相比，miR-499-5p agomir和si-Sox6组的TNF-α、IL-1β和IL-6含量降低（所有P <0.05)。与miR-499-5p agomir + oe-NC组相比，miR-499-5p agomir + oe-Sox6组TNF-α、IL-1β和IL-6含量升高（所有P <0.05).

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恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 降低了脓毒症诱导的肺损伤小鼠 BALF 和肺组织中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的含量。 一 各组小鼠BALF中TNF-α含量。 b 各组小鼠BALF中IL-1β含量。 c 各组小鼠BALF中IL-6含量。 d 各组小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白条带。 e 各组小鼠肺组织TNF-α蛋白表达情况。 f 各组小鼠肺组织IL-1β蛋白表达情况。 G 各组小鼠肺组织IL-6蛋白表达情况。 (a) P <0.05 与假手术组相比。 (b) P <0.05 与agomir NC 组相比。 (c) P <0.05 与 si-NC 组相比。 (d) P <0.05 与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比。测量数据表示为平均值 ± 标准差，数据采用单向方差分析和Tukey事后检验评估

恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 提高 SOD、CAT 和 GSH-Px 活性，并降低脓毒症诱导的肺组织中的 MDA 和 MPO 含量肺损伤小鼠

氧化应激指标检测结果表明（图5a-e）：与假手术组相比，模型组SOD、CAT和GSH-Px活性减弱，而MDA和MPO含量升高（均P <0.05)。与agomir NC和si-NC组相比，miR-499-5p agomir和si-Sox6组中SOD、CAT和GSH-Px活性升高，而MDA和MPO含量降低（所有P <0.05)。与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比，在 miR-499-5p agomir + oe-Sox6 组中，SOD、CAT 和 GSH-Px 活性受到抑制，而 MDA 和 MPO 含量增加（所有 P <0.05).

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恢复的 miR-499-5p 或耗尽的 Sox6 会提高 SOD、CAT 和 GSH-Px 的活性，并降低败血症诱导的肺损伤小鼠肺组织中的 MDA 和 MPO 含量。 一 小鼠肺组织中的 SOD 活性。 b 小鼠肺组织中MDA含量。 c 小鼠肺组织中的 GSH-Px 活性。 d 各组小鼠肺组织CAT活性。 e 小鼠肺组织中 MPO 含量。 (a) P <0.05 与假手术组相比。 (b) P <0.05 与agomir NC 组相比。 (c) P <0.05 与 si-NC 组相比。 (d) P <0.05 与 miR-499-5p agomir + oe-NC 组相比。测量数据表示为平均值 ± 标准差，数据采用单向方差分析和Tukey事后检验评估

miR-499-5p 直接针对 Sox6

我们通过生物信息学网站 TargetScan 预测 miR-499-5p 和 SOX4/6 之间存在靶向结合位点。 RT-qPCR发现，与假手术组相比，模型组SOX2/4/6表达增加，SOX6表达增加最多（均P <0.05)；与 agomir NC 组相比，miR-499-5p agomir 组的 SOX2 表达没有变化，而 SOX4 表达降低，主要是 SOX6 降低（附加文件 1：图 S1a、b）。因此，我们最终选择了 SOX6 作为 miR-499-5p 的靶基因。生物预测网站（http://www.targetscan.org/vert_72/）显示 miR-499-5p 可以靶向 Sox6（图 6a）。双荧光素酶报告基因检测表明（图6b）与对照组相比，pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT载体和miR-499-5p agomir共转染TC-1细胞后荧光素酶活性明显被破坏（P <0.05），而miR-499-5p agomir与pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT载体共转染或agomir-NC与pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT载体共转染后荧光素酶活性无明显差异（ P> 0.05)，表明miR-499-5p可以直接与Sox6 3'UTR WT结合，进而抑制荧光素酶活性。

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miR-499-5p 直接靶向 Sox6。 一 生物网站预测的miR-499-5p与Sox6的靶标关系。 b 双荧光素酶报告基因检测的验证结果。 *P <0.05 与模拟 NC 组相比。测量数据以均值 ± 标准差表示，两组比较以t进行 测试