DNA 合成

背景

脱氧核糖核酸 (DNA) 合成是制作核酸链拷贝的过程。在自然界中，DNA 合成是通过一种称为 DNA 复制的机制在细胞中进行的。利用基因工程和酶化学，科学家们已经开发出合成 DNA 的人造方法。其中最重要的是聚合酶链反应 (PCR)。 PCR 最初开发于 1980 年代初，现已成为一个价值数十亿美元的产业，原始专利的售价为 3 亿美元。

历史

DNA 于 1951 年由 Francis Crick、James Watson 和 Maurice Wilkins 发现。使用 Rosalind Franklin 生成的 X 射线晶体学数据，Watson 和 Crick 确定 DNA 的结构是双螺旋结构。由于这项工作，沃森、克里克和威尔金斯于 1962 年获得了诺贝尔生理学或医学奖。多年来，科学家们一直致力于研究 DNA，试图找出“生命密码”。他们发现 DNA 充当蛋白质序列的指令代码。他们还发现，每个生物体都有一个独特的 DNA 序列，可用于筛选、诊断和识别目的。在这些研究中证明限制的一件事是可从单一来源获得的 DNA 数量。

在确定 DNA 的性质后，科学家们能够检查细胞基因的组成。基因是 DNA 碱基对的特定序列，为构建蛋白质提供密码。这些蛋白质决定了生物体的特征，例如眼睛颜色或血型。当某个基因被分离出来时，合成那个分子的拷贝就变得很可取了。合成大量特定 DNA 的最早方法之一是通过基因工程。

基因工程首先将感兴趣的基因与细菌质粒相结合。质粒是在许多细菌中发现的一小段 DNA。由此产生的杂交 DNA 称为重组 DNA。然后将这种新的重组 DNA 质粒注射到细菌细胞中。然后通过允许细胞在培养物中生长和繁殖来克隆细胞。随着细胞繁殖，插入基因的拷贝也在繁殖。当细菌繁殖到足够多时，可以分离插入基因的多个拷贝。这种 DNA 合成方法可以在几周内产生数十亿个基因拷贝。

1983 年，当 Kary Mullis 开发出一种称为聚合酶链反应 (PCR) 的 DNA 合成方法时，产生 DNA 拷贝所需的时间显着减少。这种方法比以前已知的方法快得多，在短短几个小时内就可以产生数十亿个 DNA 链副本。它首先将一小部分双链 DNA 放入含有 DNA 聚合酶、核苷酸和引物的溶液中。加热溶液以分离 DNA 链。当它冷却时，聚合酶会创建每条链的副本。该过程每五分钟重复一次，直到产生所需数量的 DNA。 1993 年，穆利斯对 PCR 的发展使他获得了诺贝尔化学奖。今天，PCR 已经彻底改变了医学诊断、法医学和微生物学领域。据说这是基因研究中最重要的发展之一。

背景

了解 DNA 合成的关键是了解其结构。 DNA 是一种长链聚合物，由称为核苷酸的化学单元组成。 DNA 也称为遗传物质，是携带信息的分子，这些信息决定了大多数生物体中的蛋白质合成。通常，DNA 以两条化学连接的核苷酸链的形式存在。这些链接遵循碱基配对规则规定的特定模式。每个核苷酸由一个脱氧核糖分子、一个磷酸基团和四个含氮碱基之一组成。碱基包括嘧啶胸腺嘧啶 (T) 和胞嘧啶 (C) 以及嘌呤腺嘌呤 (A) 和鸟嘌呤 (G)。在 DNA 中，腺嘌呤通常与胸腺嘧啶相连，鸟嘌呤与胞嘧啶相连。该分子排列在称为双螺旋的结构中，可以通过想象扭曲的梯子或螺旋楼梯来想象。碱基构成梯子的横档，而糖和磷酸盐部分构成梯子的侧面。核苷酸连接的顺序称为序列，由称为 DNA 测序的过程确定。

在真核细胞中，DNA 合成发生在细胞分裂之前，通过一个称为复制的过程。当复制开始时，两条 DNA 链被各种酶分开。这样打开后，每条链都充当了产生新链的模板。这整个过程是由一种叫做 DNA 聚合酶的酶催化的。该分子将相应的或互补的核苷酸与每条 DNA 链相一致。然后核苷酸通过化学连接形成新的 DNA 链，它是原始链的精确副本。这些拷贝，称为子链，包含一半的亲本 DNA 分子和一半的全新分子。这种方法的复制称为半保守复制。复制过程很重要，因为它为细胞提供了一种方法，可以将其遗传物质的精确副本从一代细胞转移到下一代细胞。

原材料

用于 DNA 合成的主要原料包括 DNA 起始材料、taq DNA 聚合酶、引物、核苷酸和缓冲溶液。这些中的每一个都在数百万个 DNA 分子的生产中发挥着重要作用。

受控的 DNA 合成从识别要复制的一小段 DNA 开始。这通常是包含所需蛋白质代码的特定 DNA 序列。这种称为模板 DNA 的物质的浓度约为 0.1-1 微克。它必须高度纯化，因为即使是 DNA 纯化中使用的痕量化合物也会抑制 PCR 过程。一种纯化 DNA 链的方法是用 70% 的乙醇对其进行处理。

虽然 DNA 复制过程在 1980 年之前就已为人所知，但由于没有已知的热稳定 DNA 聚合酶，因此无法进行 PCR。 DNA聚合酶是催化DNA合成反应的酶。在 1980 年代初期，科学家们发现了生活在天然蒸汽喷口周围的细菌。原来，这些生物体，叫做水生栖热菌， 有一种 DNA 聚合酶，在极端高温下仍能保持稳定和功能。这个 taq DNA聚合酶成为现代DNA合成技术的基石。在典型的 PCR 过程中，2-3 微克 taq 需要DNA聚合酶。但是，如果使用过多，则会产生不需要的非特异性 DNA 序列。

聚合酶通过在每条 DNA 链上结合相应的核苷酸来构建 DNA 链。从化学上讲，核苷酸由三种类型的分子基团组成，包括糖结构、磷酸基团和环状碱基。糖部分为所有核苷酸提供一级结构。通常，糖由五个碳原子组成，并附有许多羟基 (-OH) 基团。对于 DNA，糖是 2-脱氧-D-核糖。核苷酸的定义部分是与糖共价结合的杂环碱基。这些碱基是嘧啶或嘌呤基团，它们构成了核酸密码的基础。发现了两种类型的嘌呤碱基，包括腺嘌呤和鸟嘌呤。在 DNA 中，存在两种类型的嘧啶碱基，胸腺嘧啶和胞嘧啶。磷酸基团构成核苷酸的最后部分。该基团源自磷酸并与第五个碳上的糖结构共价键合。

聚合酶链反应 (PCR) 的第一阶段涉及 DNA 的变性。 DNA 分子的这种“开放”为下一个要生产的 DNA 分子提供了模板。随着 DNA 分裂成单独的链，温度降低——引物退火步骤。在下一阶段，DNA 聚合酶与链相互作用并沿整个长度添加互补核苷酸。对于每 1,000 个碱基对，此阶段所需的时间约为 1 分钟。

要启动 DNA 合成，必须使用 DNA 的短引物部分。这些引物部分称为寡核苷酸片段，长度约为 18-25 个核苷酸，对应于模板 DNA 上的一个部分。它们通常具有均匀分布的约 60% 的 C 和 G 核苷酸浓度。这提供了合成过程中的最大效率。

缓冲溶液提供了可以进行 DNA 合成的介质。这是一种含有 MgCl2、HCl、EDTA 和 KCl 的水溶液。 MgCl2 浓度很重要，因为 Mg2+ 离子与 DNA 和引物相互作用，为 DNA 合成产生关键的复合物。推荐浓度为 1 到 4 微摩尔。该系统的 pH 值很关键，因此它也可以用硫酸铵缓冲。为了激发反应，添加了各种能量分子，例如 ATP、GTP 和 NTP。这些化合物与生物体用来驱动代谢反应的化合物相同。

可用于该过程的其他材料包括矿物油或石蜡。 DNA 合成完成后，通常会分离和纯化 DNA。此过程中使用的一些常用试剂包括苯酚、EDTA 和蛋白酶 K。

制造过程

DNA 合成通常在实验室中小规模进行。它涉及三个不同的过程，包括样品制备、DNA 合成反应循环和 DNA 分离。这些制造步骤通常在不同的区域进行，以避免污染。按照这些程序，科学家们能够将几股 DNA 转化为数以百万计的精确副本。

样品的制备

• 1 为了开始 DNA 合成，需要准备各种溶液。这通常在配备紫外线灯的层流柜中完成，以最大程度地减少污染。出于类似的原因，科学家在每个生产步骤中都使用新鲜的手套。通常，除引物、聚合酶和 dNTP 之外的所有起始溶液都放入高压釜中以杀死任何污染生物。制备了两种单独的溶液。一种包含缓冲液、引物和聚合酶。另一个包含 MgCl2 和模板 DNA。将这些溶液全部放入小管中开始反应。

卡里班克斯穆利斯。

Kary Banks Muilis 于 1944 年出生于北卡罗来纳州的勒努瓦。 1966 年从佐治亚理工学院毕业并获得学士学位。在化学方面，Muilis 进入了加州大学伯克利分校的生物化学博士课程。获得博士学位1973 年，他接受了堪萨斯城堪萨斯大学医学院的教职。 1977 年，他在加州大学旧金山分校获得博士后奖学金。

Muilis 于 1979 年在加利福尼亚州埃默里维尔的一家不断发展的生物技术公司 Cetus Corporation 接受了研究科学家的职位，该公司合成了其他科学家在基因克隆中使用的化学物质。在那里，他设计了聚合酶链反应 (PCR)，这是一种快速有效的复制特定基因或 DNA（脱氧核糖核酸）片段的技术，可以在几小时内产生数十亿个拷贝。复制 DNA 的最有效方法是克隆，但这是有问题的。花了一些时间让穆利斯的同事相信这一发现的重要性，但很快 PCR 成为深入研究的焦点。 Cetus 的科学家开发了该过程的商业版本和一种称为热循环仪的机器（添加了 DNA [核苷酸] 的化学构建块和生化催化剂 [聚合酶]，该机器将在目标片段上自动执行该过程DNA）。

Cetus 授予 Muilis 10,000 美元用于开发 PCR 专利，然后以 3 亿美元的价格出售。 1986年离开希图斯，穆利斯成为私人生化研究顾问，并于1993年获得诺贝尔奖。

DNA合成循环

• 2 反应液准备好后，PCR 循环开始。第一阶段涉及 DNA 的变性。最重要的初始步骤之一是 DNA 模板的完全变性。 DNA 的变性基本上意味着双键链的断裂。 DNA 分子的这种“开放”为下一个要生产的 DNA 分子提供了模板。不完全变性将导致第一个循环中的低效复制，这会对每个后续循环产生负面影响。通过在 1 到 3 分钟内将 DNA 模板溶液加热到 203°F (95°C) 来完成初始变性。总时间取决于模板组成。在重复循环中，变性步骤持续约两分钟，包括将溶液加热至 201PF (94°C)。可以向溶液中添加其他材料以促进 DNA 变性，例如甘油、DMSO 或甲酰胺。
• 3 随着 DNA 分裂成单独的链，温度降低到 122-149°F (50-65°C)。这称为引物退火步骤，持续约两分钟。此时，左右引物匹配并与模板 DNA 上的互补碱基进行化学连接。
• 4 下一阶段涉及扩展步骤。这部分反应是大部分 DNA 链被复制的时候。系统的温度被加热到大约 162°F（72°C）并根据要复制的 DNA 的长度保持在那里。在这个阶段，DNA 聚合酶与链相互作用并沿整个长度添加互补核苷酸。对于每 1,000 个碱基对，此阶段所需的时间约为 1 分钟。
• 5 在第一个循环之后，重复 DNA 合成循环。循环次数取决于初始 DNA 的量和所需的 DNA 量。如果模板 DNA 少于 10 个拷贝，则需要 40 个循环。有了更多的初始 DNA，25-30 个循环就足够了。
• 6 在最后一个循环中，样品在 162°F (72°C) 下保持约 15 分钟。这允许（用核苷酸）填充新 DNA 链的任何突出末端。在这个阶段，聚合酶在 DNA 链的一端添加额外的 A 核苷酸。

DNA 分离

• 7 反应完成后，从 PCR 反应材料（如 DNA 聚合酶、MgCl2 和引物）中分离 DNA。这是通过添加苯酚、EDTA 和蛋白酶 K 等化合物来完成的。在这方面，离心也很有帮助。

未来

虽然科学家们定期使用 PCR 进行 DNA 合成，但对 DNA 复制仍有很多不了解的地方。未来的研究应该阐明该过程的几个重要步骤的细节，例如所涉及的成分和中间体。此外，可以开发改进的聚合酶，从而可以从较小的起始样品中产生更多的 DNA。人们希望有一天 DNA 合成将有助于解开生物体的一些关键方面，并导致开发出能够治愈各种癌症、病毒和细菌感染的药物。