使用光学显微镜进行光谱学

联用仪器是一种融合了两种不同技术的能力以形成具有新能力的新分析技术的仪器。显微镜分光光度计就是这样一种联用仪器。它是一种结合了光学显微镜的放大能力和紫外-可见-近红外范围分光光度计的分析能力的混合体。因此，显微镜分光光度计可用于测量从深紫外到近红外区域的微观样品区域的分子光谱。它们可以配置用于许多不同类型的光谱学，因此可用于测量微米级样品的吸光度、反射率甚至发射光谱，例如荧光和光致发光。加上专门的算法，显微镜分光光度计还可用于测量薄膜的厚度或作为显微样品的色度计。

使用显微镜分光光度计的原因有很多。最明显的是，可以从小于一微米的样品区域获取光谱。此外，这些仪器只需要少量固体或液体形式的样品。另一个优点是许多样品只需要很少或不需要准备。而分光光度计的光谱颜色比较往往更准确，因为这些仪器具有更宽的光谱范围，可以校正光照变化，并且可以测量每个波段的光强度。

在显微光谱学出现之前，分析许多类型的显微样品的唯一方法是使用微量化学测试，然后进行某种目视检查。不幸的是，这些方法往往具有破坏性，需要大量样本，并且受到人类视觉系统不准确的影响。显微镜分光光度计避免了这些问题，可以“看到”人眼范围之外的东西，并检测到原本不明显的变化。

显微镜分光光度计设计

显微镜分光光度计将光学或光学显微镜与紫外-可见-近红外范围分光光度计集成在一起（图 1）。显微镜是一种旨在放大小物体图像以便对其进行研究的设备。分光光度计是一种测量从紫外到可见和近红外区域的每个波长的光的强度的仪器。使用适当配置的显微镜分光光度计，可以获取亚微米级采样区域的吸光度、反射率和发射光谱。

为了以良好的图像和光谱质量覆盖如此广泛的光谱范围，定制设计的显微镜被构建并与分光光度计集成。由于光学材料以及光源本身的原因，标准光学显微镜的光谱范围有限，仅覆盖可见区域的一部分。现代显微镜分光光度计采用定制的显微镜，其光学设计和光源针对通过近红外的深紫外线进行了优化。

分光光度计本身也必须设计用于显微光谱，以获得良好的光谱结果。这意味着分光光度计必须高度灵敏，同时仍保持可接受的光谱分辨率。稳定性也是一个问题，因为显微镜分光光度计是单光束仪器，必须在测量样品之前获得参考光谱。该仪器还必须具有高动态范围，因为在测量同一样品时，人们经常从透射或反射显微光谱切换到荧光光谱。这使您可以从显微样品上完全相同的位置获得不同类型的光谱信息。

分光光度计与显微镜的集成至关重要。虽然显微镜和分光光度计都必须针对显微分光进行优化，但显微镜分光光度计操作的关键是使它们能够协同工作的硬件。这个接口有几个基本要求。最重要的是，它必须将显微镜从样品收集的电磁能引导到分光光度计中。但是，用户必须能够可视化样品测量区域，同时也能看到周围的样品。这是通过使分光光度计的入口孔径与样本图像位于同一焦平面上来完成的。然后可以用显微镜载物台移动样品，就像通常用显微镜所做的那样，直到入口孔径的图像在要测量的区域上。在图 2 中，图像中心的黑色方块是分光光度计的入口孔径。所有这些都是实时完成的，因此显微镜样品的光谱分析既快速又简单。

如图 3 所示，显微镜光学系统将光线聚焦到样品上。然后通过显微镜物镜从样品中收集电磁能。来自物镜的光聚焦到分光光度计的镜面入口孔径上。大部分光从入口孔径表面反射到相机上。分光光度计光圈也由相机成像，使其在样品上显示为黑色方块（图 2）。这样可以轻松快速地校准显微镜分光光度计。通过入口孔径的光进入分光光度计，在分光光度计中测量光谱。

根据要执行的实验类型，显微镜可以配置不同的照明方案。白光入射照明允许从深紫外到近红外的反射显微光谱。入射照明也可用于荧光或光致发光显微光谱。此外，通过显微镜聚光镜将白光聚焦到样品上，可以进行透射显微光谱分析。

显微光谱学的应用

第一台显微镜分光光度计是在 1940 年代开发的，从那时起，开发了许多不同的应用。显微镜分光光度计具有获取显微样品区域光谱的能力，从大学实验室到生产线，无处不在，用于质量控制和故障分析。

法医学。 自 1980 年代初以来，法医证据的分析一直是显微镜分光光度计最重要的应用之一。最大的努力是分析痕量证据，特别是纺织纤维和油漆碎片1、2。正如它们的名字所暗示的那样，这些类型的样品通常是微观的，作为证据，不应通过测试损坏或破坏。对于光纤，显微镜分光光度计用于测量单根光纤的紫外-可见-近红外吸收和荧光光谱。油漆片通常会被横切，然后测量每一层的吸收光谱，这样就可以将已知和有问题的样品进行比较，并具有高度的辨别力。

平板显示器。 现代平板显示器由数百万个多色像素组成。随着技术的进步，像素变得越来越小，并且在越来越大的表面上更加紧密地排列。最现代的显示器使用不同的技术，例如量子点和有机发光二极管，在微观尺度上创建不同颜色的像素。显微镜分光光度计用于帮助开发这些材料作为可行的光源，并最终作为显示器 3,4。生产过程中还使用了显微镜分光光度计，以确保整个显示屏上像素的颜色和强度保持一致，从而确保显示屏上的图像明亮均匀。

能源。 煤和石油源岩含有镜质体和其他矿物。显微镜分光光度计用于对煤、焦炭和石油源岩的热成熟度 5 以及能量含量进行分级。这是通过测量抛光样品上镜质体的绝对反射率来完成的。根据反射率，可以确定样品的热成熟度。

纳米技术。 显微镜分光光度计还基于其测量透射、反射和发射光谱微观样品区域的能力推进纳米技术和材料科学。一个快速增长的应用领域是表面等离子共振（SPR）的开发和使用6,7,8。

通过用光照射平面金属表面或纳米级金属颗粒来激发表面等离子体激元（图 4）。当这些纳米颗粒或表面与其他材料相互作用时，这些材料的光学特性就会发生变化。因此，人们正在做大量工作来开发表现出某种形式的等离子体共振的新材料，同时也在构建具有这些现象的设备。后者包括各种类型的生物传感器和微流体装置传感器。显微镜分光光度计测量 SPR 材料的光谱在不同条件下如何变化，使研究人员能够表征新材料，然后“调整”该材料以获得特定的光学效果。

结论

显微镜分光光度计是一种将光学显微镜与分光光度计相结合的技术，这样人们就可以获取微观样品区域的光谱。这种仪器能够从深紫外到可见光和近红外区域的吸收和反射光谱。显微镜分光光度计还可以测量荧光和其他类型的发射光谱。这些设备已在许多领域得到应用，包括法医学、半导体和光学薄膜厚度测量、生物技术以及最新的材料科学。

参考文献

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本文由 CRAIC Technologies（加利福尼亚州圣迪马斯）总裁 Paul Martin 博士撰写。欲了解更多信息，请联系 Martin 博士。此电子邮件地址已收到垃圾邮件机器人保护。您需要启用 JavaScript 才能查看它。或访问这里 .