牙科分级纳米玻璃-氧化锆材料老化后的生物相容性

背景

牙科氧化锆基陶瓷（例如，3 mol% 钇稳定的四方氧化锆多晶 (3Y-TZP)）由于固有的相变增韧机制而表现出优异的机械强度和优异的抗断裂性，并且它们被广泛用于制造假肢装置。 1]。氧化锆芯材通常涂有半透明贴面瓷以覆盖其不透明的外观。然而，分层氧化锆修复体往往会失败。据报道，饰面陶瓷的碎裂和分层是氧化锆修复体失败的最常见原因 [2, 3]。据报道，贴面陶瓷的碎裂和分层是由于氧化锆芯和贴面陶瓷之间的热膨胀系数和弹性模量不匹配造成的 [4]。因此，在我们之前的研究中，我们通过将具有匹配热膨胀系数的低模量纳米玻璃渗透到由纳米氧化锆颗粒烧结而成的氧化锆表面，引入了一种改善芯单板粘合的新概念，从而产生弹性梯度纳米玻璃/氧化锆 (G/Z) 系统。 G/Z系统与贴面瓷的结合强度比传统的氧化锆基系统高出三倍[4]。

Y-TZP 的老化是众所周知的。 Y-TZP 的老化可由口腔环境诱导，暴露于潮湿、机械负荷和低温，导致表面粗糙、微裂纹和 Y-TZP 颗粒释放到体内 [5, 6]。在湿度和低温的情况下，可以触发四方到单斜 (t-m) 氧化锆的相变。晶体体积膨胀导致材料表面局部应力和微裂纹，使水进一步渗透到材料内部，导致额外的相变并导致机械性能下降 [7,8,9]。此外，众所周知，生物材料的物理化学性质，如表面粗糙度和化学成分，会影响其生物相容性。因此，有必要评估老化降解对G/Z生物相容性的影响。

张等人。 [10, 11] 将玻璃渗透到致密的氧化锆亚结构中，并开发出具有优异机械性能的分级玻璃-氧化锆复合材料。然而，梯度玻璃-氧化锆复合材料的生物相容性尚不清楚，特别是考虑到老化现象。

因此，由于添加了玻璃材料和随之而来的结构变化，新开发的 G/Z 系统的生物相容性测试对其临床应用至关重要。 G/Z 系统的引入可以为基于氧化锆的修复体的失败提供解决方案，从而提高其成功率。因此，G/Z系统老化前后的生物相容性测试将为G/Z的临床应用提供生物安全性指导。

在本研究中，评估了 G/Z 系统在老化前后的生物相容性。评估包括口腔黏膜刺激试验以及细胞活力、细胞形态、细胞粘附和氧化应激反应的分析。

方法

标本准备

Y-TZP是一种已获批临床应用的生物相容性材料，此处以Y-TZP标本为对照组。所有样品均制成均匀的板（1.5 × 1.5 × 0.2 cm）。 ISO 13356 描述了对具有简化几何形状（弯杆）和抛光表面的测试样品的评估。

G/Z 标本的制备

研磨玻璃粉末，直到用纳米研磨仪（Emax, Retsch, Haan, North Rhine-Westphalia, Germany）获得纳米尺寸的颗粒。渗透玻璃的主要成分和百分比（> 1wt%）列于表 1[4]。钇稳定氧化锆粉末（5.18 wt% Y2O3，TZ-3Y-E 等级；Tosoh，Tosoh，Tosoh，Tosoh，Tokyo，Japan）在 150 MPa 的单轴压力下压缩 2 分钟，然后在 1350°C 下部分烧结 2 h 在马弗炉中。将所需的氧化物球磨成 200 目粉末。 Y-TZP 基材样品在 1200°C 下预烧结 2 小时，形成多孔结构。将熔化的玻璃浆施加到预烧结的 Y-TZP 多孔基材样品的顶面上。然后将涂层试样在 1350°C 下渗透 2 小时，以产生分级的玻璃-氧化锆结构。玻璃渗透和致密化同时进行。

Y-TZP 标本的制备

Y-TZP 坯料（Weiland，Weiland Dental，Pforzheim，Baden-Württemberg，德国）使用 CAD/CAM 系统（Zenostar，Weiland Dental，Pforzheim，Baden-Württemberg，德国）设计、铣削和烧结至全密度。

细胞培养

人牙龈成纤维细胞 (HGF) 在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素、1% l-谷氨酰胺和 1% 非必需氨基酸的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，营养混合物 F-12）中培养37 °C 下 5% CO2 的湿润气氛。每 3 天更换一次培养基。通过在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中冲洗并在胰蛋白酶-EDTA 溶液中孵育，将细胞从培养皿中取出。将细胞以 1 × 10 ⁵ 接种在每个测试基质上 所有测定在相同培养基中的细胞/mL。

老化

为了刺激咀嚼条件，在人工唾液中在 37 °C 下进行机械老化，并使用三点弯曲夹具以 2 Hz 的频率施加负载。使用了以下老化曲线：80 N 负载和 10 ⁵ 所有样品的循环次数 [12, 13]。

细胞活力

使用 alamarBlue ^® 在 2、24、48 和 72 小时（暴露时间）测定未老化和老化 G/Z 和 Y-TZP 暴露后 HGF 的活力 盐测定作为 DMEM 中的 10% 溶液。在测定测试之前，从 HGF 中取出所有样本，然后取出 500 μL alamarBlue ^® 加入染料，然后孵育 4 小时。将等分试样 (100 μL) 倒入 96 孔细胞培养皿中，并使用 Synergy™ H4 微孔板分光光度计（BioTek，Winooski，Vermont，USA）在激发 (530 nm) 和发射 (580 nm) 波长下测定荧光强度。所有实验一式三份进行三次。细胞活力计算如下：活力（%）=（处理孔的吸光度）/（对照孔的吸光度）。

氧化应激

使用活性氧物种测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，江苏南京）通过化学发光法鉴定老化前后G/Z-和Y-TZP处理的HGF的活性氧物种（ROS）水平。

细胞粘附

在老化之前和之后，HGF 在 G/Z 和 Y-TZP 样本表面上培养 2 小时。固定后，细胞核用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI) (Yeasen, Shanghai, Shanghai District, China) 染色。使用倒置 LSM 510 荧光显微镜（Carl Zeiss, Jena, Tuttlingen, Germany）获得图像。在× 200的放大倍数下，随机选择5个切片（450μm × 450μm）对贴壁细胞进行分析。通过贴壁细胞数除以接种细胞总数确定细胞粘附率。

细胞形态学

在老化之前和之后，在未老化和老化的 G/Z 样本表面上培养 HGF 2 小时。固定后，使用罗丹明鬼笔环肽（1:100 溶于 3% BSA 的 PBS）对细胞进行丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）染色。使用倒置 LSM 510 荧光显微镜（Carl Zeiss, Jena, Tuttlingen, Germany）获得图像。使用 DAPI (Yeasen, Shanghai, Shanghai District, China) 将样品安装在玻璃盖玻片上，用于细胞核的可视化。使用XL-30 ESEM（Philips，Eindhoven，North Brabant，The Netherlands）通过扫描电子显微镜（SEM）观察老化前后G/Z和Y-TZP表面的细胞形态。

口腔粘膜刺激试验

口腔黏膜刺激性试验按照中华人民共和国药品标准YY/T 0127.13-2009进行。选择 10 只 Wistar 雄性小鼠进行该测试。将老化的 G/Z 标本放置在每只动物的一个颊囊中作为测试材料，而将未老化的 G/Z 标本放置在对侧作为对照。 2 周后处死动物，取出圆盘后肉眼检查小袋。对用苏木精和伊红染色的冷冻切片进一步进行颊粘膜的组织学分析。获得所有宏观和微观观察的平均等级。试验组平均值减去对照组平均值即为刺激指数。

统计分析

单向方差分析 (ANOVA) 用于汇总（所有暴露时间）细胞活力、氧化应激和细胞粘附率数据，以评估单个牙科标本（SPSS 22.0；SPSS Inc., Chicago, IL, USA ).

结果

分级层结构

渐变层的厚度控制在大约 0.9-1.0 毫米。 G/Z 系统的结构和 SEM 图像如图 1a、b 所示。图 1a、b 描绘了由残留玻璃痕迹、玻璃涂层氧化锆颗粒和晶间空隙组成的形态，这些形态创造了一种非常适合提高芯板粘合强度的表面形态。此外，渐变层的 EDS 分析如图 1c 所示，表明随着距表面距离的增加，Zr 元素的含量增加，而 Si、Al 和 La 元素的含量减少。详细信息已在我们之前的研究中进行了描述 [4]。

G/Z 的物理和化学特性。 一 结构图。 b 扫描电镜图像。 c 功能梯度层的EDS分析

细胞活力

在 72 小时观察到老化的 G/Z 和 Y-TZP 处理细胞的代谢显着下降（P <0.00001)（图 2a）。在 2 h (P =0.47), 24 小时 (P =0.82) 和 48 小时 (P =0.53)（图 2a）。在 2 h (P =0.82)，24 小时 (P =0.32) 和 48 小时 (P =0.54)（图 2a）。与 Y-TZP 相比，G/Z 标本在 2 小时时未引起细胞活力的任何显着差异（P =0.94)，24 小时 (P =0.86)，48 小时 (P =0.68) 和 72 小时 (P =0.61) 老化前的暴露。与 Y-TZP 相比，G/Z 标本在 2 小时时未引起细胞活力的任何显着差异（P =0.98)，24 小时 (P =0.54)，48 小时 (P =0.73) 和 72 小时 (P =0.50) 老化后暴露。

老化前后 G/Z 和 Y-TZP 的生物相容性。数据代表平均值±标准差，n =5.a 老化和未老化样品处理的 HGF 的细胞活力。 b 老化和未老化标本处理的 HGF 的 Ros 生产。 c 老化和未老化样品处理的 HGF 的细胞粘附率。与对照组的显着性： ^# P <0.01; ^* P <0.05

氧化应激

老化的 G/Z 和 Y-TZP 处理的细胞的氧化应激数据显示在 72 小时显着增加 (P <0.00001，图 1b)。相比之下，老化的 G/Z 处理的细胞在 2 小时时没有引起 ROS 产生的显着差异（P =0.91)，24 小时 (P =0.42) 和 48 小时 (P =0.62)。此外，老化的 Y-TZP 处理的细胞在 2 小时时没有引起 ROS 产生的显着差异（P =0.07)，24 小时 (P =0.40) 和 48 小时 (P =0.53)。与 Y-TZP 在 2 h (P =0.16)，24 小时 (P =0.79)，48 小时 (P =0.14) 和 72 小时 (P =0.43) 老化前的暴露。与 Y-TZP 在 2 h (P =0.27), 24 小时 (P =0.17)，48 小时 (P =0.07) 和 72 小时 (P =0.15) 老化后暴露。

细胞粘附

G/Z 和 Y-TZP 的细胞粘附率在老化后显着增加（图 2c）。未老化G/Z和Y-TZP的细胞粘附率无显着差异（P =0.71)（图 2c）。老化G/Z和Y-TZP的细胞粘附率无显着差异（P =0.71)（图 2c）。 G/Z和Y-TZP老化后细胞粘附率无显着差异(P <0.00001)（图 2c）。老化前后Y-TZP和G/Z上细胞粘附的特征照片如图3a-d所示。

老化前后细胞对 G/Z 和 Y-TZP 的粘附。 一 老年 G/Z。 b 未老化的 G/Z。 c 年迈的 Y-TZP。 d 未成熟的Y-TZP

细胞形态学

不同孵育时间的荧光图像显示细胞附着在 G/Z 表面；然而，在老化的 G/Z 表面上铺展更大（图 4a-c），其中细胞变平且铺展良好，呈多边形。

用荧光显微镜观察老化前后 HGF 在 G/Z 上的附着、扩散和形态。 一 , b 老年 G/Z。 c 未老化的 G/Z。细胞在基质上培养 72 小时，然后固定并染色丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白，红色）和细胞核（蓝色）

SEM 图像显示，在老化和未老化的 G/Z 表面上培养的细胞显着变平，带有延伸或细长体和众多微绒毛（图 5a、b）。可以观察到圆形细胞核，证实细胞质扩散附着在标本表面（图 5a）。

培养 72 小时后老化前后 G/Z 上 HGF 形态的 SEM 显微照片。 一 老年 G/Z。 b 未老化的 G/Z。原始放大倍数：× 2000

口腔粘膜刺激试验

测试侧和对侧的宏观观察得分均为 0，表明没有随之而来的刺激。此外，双方的显微镜评价得分均为0，表明没有明显的刺激反应。图 6a、b 表明用未老化 G/Z 和老化 G/Z 处理的颊粘膜中未观察到组织病理学变化。

老化G/Z(a ) 和未老化的 G/Z (b )

讨论

随着金属离子释放的广泛讨论，金属陶瓷材料越来越多地被无金属材料所取代。假牙的银[14]、金[15]、钛[16]、镍[17]等多种金属离子会释放到唾液和血浆中。麦金利等。甚至报道说，从牙科 Ni-Cr 合金扩散的 Ni 离子可以扩散到整个上皮组织到基底层，随后扩散到整个细胞外基质，导致细胞活力和组织完整性的丧失 [18]。目前的研究主要集中在所有陶瓷材料的开发和改进上。因此，我们之前的研究 [4] 中引入了 G/Z 以提高氧化锆基材料的成功率。然而，考虑到老化的 G/Z 系统的生物相容性是未知的。生物相容性测试和适度控制是必不可少的。因此，进行了一系列生物相容性测试并与金标准进行了比较 ，Y-TZP，有老化的考虑。此外，研究证明表面形貌以及物理和化学特性对细胞粘附和活力有影响[19]。因此，所有标本都经过喷砂和抛光，达到临床表面粗糙度。

在 72 小时观察到老化的 G/Z 和 Y-TZP 处理细胞的代谢显着下降（图 2a），证明老化降低了 G/Z 和 Y-TZP 的细胞增殖。老化对氧化锆材料生物相容性的影响是有争议的。之前的一项研究报告了氧化锆在老化后的生物相容性降低 [20]。同时，最近的一项研究证明了老化氧化锆的生物相容性增加 [21]。老化对生物相容性的不同影响可能源于不同的老化程序，包括周期、温度、负载和频率[22]。老化对氧化锆物理和化学性质变化的影响取决于老化过程对氧化锆降解的侵蚀性。为了模拟长期口腔内状况，本研究中使用的老化程序基于临床参数，例如咬合负荷和频率、潮湿环境的使用以及人体温度 [22]。

细胞活力依赖于线粒体活性。细胞增殖的减少和 ROS 产生的增加可能是由于扩散的离子扩散到整个上皮组织到基底层，随后扩散到整个细胞外基质，导致细胞活力和组织完整性的丧失 [6, 23]。

G/Z 和 Y-TZP 的细胞粘附率在老化后增加（图 2c）。老化前后 Y-TZP 和 G/Z 上细胞粘附的特征照片如图 3a-d 所示。对 G/Z 上的细胞附着进行了精确观察。双标记荧光染色（图 4a、b）和 SEM 视图（图 5a、b）表明，在老化和未老化 G/Z 上培养的细胞均变平且分布良好。

细胞粘附取决于生物材料的物理化学特性。众所周知，迁移和粘附是不一定直接相关的生物学参数。细胞可以以非常高的粘附性缓慢迁移 [24, 25]。阿尔卡塔尼等人。 [26] 还报道，当与 Saos-2 成骨细胞一起孵育时，Y-TZP 的喷砂表面呈现出更高的细胞粘附但低细胞增殖。通过调节吸附在表面的蛋白质的量，表面润湿性也是决定细胞粘附偏好的一个因素[27]。据报道，一旦粘附完成，超亲水表面上的细胞甚至开始增殖，这种现象与吸附在亲水表面上的大量蛋白质密切相关 [28]。 G/Z和Y-TZP的老化磨损使粗糙的表面具有很强的润湿性，使细胞有很强的粘附力。这种类型的表面将是牙科基台表面周围牙龈粘附的最佳选择。相比之下，光滑表面对材料的粘附特性有限，这适用于旨在防止口腔脓毒症环境中生物膜形成的表面[29]。作为假牙材料，G/Z 和 Y-TZP 的老化磨损因此增加了生物膜形成的可能性。 G/Z 和 Y-TZP 的细胞粘附率在老化前后没有显着差异（图 2c）。这一发现证明G/Z和Y-TZP在老化前后表现出相似的细胞粘附特性，表明G/Z具有良好的表面生物学特性。

体内刺激试验对于口腔医疗器械的长期应用至关重要。在此，G/Z 处理的粘膜未观察到宏观或微观病理变化（图 6a、b）。

大量m的存在 -ZrO2 可能导致氧化锆强度降低。 G/Z 系统可靠的生物相容性可能归因于渗透过程中的小相变，这在我们之前的研究中得到了证明 [4]。另一项研究证明了渗透的 Y-TZP 材料具有良好的耐老化性。井越等人。 [30] 报道称，尽管与 Y-TZP 相比，Al2O3 渗透的 Y-TZP 具有更高的初始单斜晶体积分数，但由于层间表面存在大量 c-ZrO2 相，时效后它具有水热稳定性。

几项研究证实了玻璃-氧化锆组合物的可靠生物相容性。 L-929 成纤维细胞和 Saos-2 成骨细胞样细胞在 HAp-Al2O3-ZrO2 (FGM) 表面表现出良好的粘附和增殖，表明 FGM 具有良好的生物相容性 [31]。在犬腿骨中植入 3 个月后，玻璃 (Na2O-SiO2-B2O3-CaO)-Hap-ZrO2 植入材料显示出比钛植入材料更好的骨结合 [32]。李等人。据报道，玻璃-氧化锆材料表现出良好的生物活性且无细胞毒性[33]。最近的研究报告了一种致密的分级玻璃-氧化锆组合物，具有良好的机械性能和美观性 [10, 11, 34]。然而，尚未报道分级玻璃-氧化锆组合物的生物相容性。

结论

根据口腔粘膜刺激试验，结合细胞活力、细胞粘附、细胞形态和氧化应激反应的分析，G/Z 的生物相容性在老化前后均与 Y-TZP 相当。作为一种假牙材料，G/Z在临床应用中显示出广阔的前景。但本研究为初步报告，尚需进一步的体内外研究，采用更全面的试验方法来证实目前的结果。

缩写

DAPI：

4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐

F-肌动蛋白：

丝状肌动蛋白

FGM：

HAp-Al2O3-ZrO2

G/Z：

分级纳米玻璃/氧化锆

SEM：

扫描电镜

t-m:

四方至单斜

Y-TZP：

钇稳定的四方氧化锆多晶