分级纳米玻璃/氧化锆牙科材料老化后的生物相容性

摘要

通过将纳米玻璃渗透进纳米氧化锆表面制备了分级纳米玻璃/氧化锆(G/Z)体系，增强了核-面层结合强度。老化是钇稳定四方氧化锆多晶(Y-TZP)的关键问题，因此临床应用前必须评估老化对G/Z体系生物相容性的影响。将人牙龈成纤维细胞(HGF)接种在未老化和老化的G/Z及Y-TZP试样上培养2-72 h。测试包括口腔黏膜刺激、细胞活力、粘附和氧化应激。老化G/Z和Y-TZP在72 h时代谢活性显著下降(P < 0.00001)。所有时间点、老化前后G/Z与Y-TZP活力无显著差异。老化G/Z和Y-TZP在72 h时ROS产生增加，但差异不显著(P > 0.05)。老化后两材料粘附率均上升，但G/Z与Y-TZP粘附相当(P > 0.05)。老化和未老化G/Z的宏观和微观刺激评分均为0，表明无刺激性。

结论

G/Z体系展现出优异的生物相容性，有望用于未来临床应用。

背景

牙科氧化锆陶瓷，特别是3 mol%钇稳定四方氧化锆多晶(3Y-TZP)，因相变强化机制具有高强度和抗断裂性，广泛用于修复装置[1]。然而，氧化锆核上的面层瓷常因核面层热膨胀系数和弹性模量失配而发生崩瓷或脱层[2,3,4]。为此，我们此前引入分级纳米玻璃/氧化锆(G/Z)体系，将低模量纳米玻璃渗透进烧结纳米氧化锆表面，实现比传统体系高三倍的结合强度[4]。

Y-TZP老化——由湿度、机械载荷和低温触发——导致表面粗糙化、微裂纹和四方-单斜(t-m)相变，可能损害力学性能[5-9]。因表面化学和粗糙度影响生物相容性，评估老化对G/Z体系与生物组织相互作用的影响至关重要。

Zhang等人此前证实了玻璃渗透氧化锆复合材料的力学优势[10,11]，但该分级复合材料的生物相容性，特别是老化后，仍未知。本研究通过对比G/Z与临床公认的Y-TZP，评估老化前后的细胞活力、形态、粘附、氧化应激和黏膜刺激，填补这一空白。

方法

试样制备

临床批准的Y-TZP试样作为对照。所有样品为均匀板块(1.5×1.5×0.2 cm)，按ISO 13356标准抛光。

G/Z试样制备

玻璃粉末经Emax研磨机研磨至纳米级。渗透玻璃成分见表1[4]。钇氧化锆粉末(5.18 wt% Y₂O₃, TZ-3Y-E级, 东洋)单轴压制150 MPa 2 min，1350°C部分烧结2 h，球磨至200目。基体试样1200°C预烧结2 h形成多孔网络。熔融玻璃浆料涂覆表面，1350°C渗透2 h，同步完成渗透和致密化。

Y-TZP试样制备

Y-TZP块经铣削和CAD/CAM系统(Zenostar, Weiland Dental)烧结致密。

细胞培养

HGF在含10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素、1% L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸的DMEM/F-12中培养，37°C, 5% CO₂。每3天换液。用PBS和胰蛋白酶-EDTA消化细胞，以1×10⁵ cells/mL接种于各基底进行所有实验。

老化处理

机械老化模拟咀嚼条件：试样置于37°C人工唾液中，施加80 N三点弯曲载荷，2 Hz，10⁵循环，遵循方案[12,13]。

细胞活力

用alamarBlue®分析(10% in DMEM)在2, 24, 48, 72 h测定活力。孵育后加500 µL染料，再孵育4 h，用Synergy™ H4酶标仪(BioTek)测荧光(激发530 nm, 发射580 nm)。三重复孔，三次重复实验。活力(%) = (处理孔吸光度)/(对照孔吸光度)。

氧化应激

用化学发光法(南京建成生物工程研究所反应性氧物种检测试剂盒)定量ROS水平。

细胞粘附

HGF在老化前后试样表面培养2 h。固定后用DAPI(Yeasen)染核，Carl Zeiss LSM 510倒置荧光显微镜成像。粘附率 = 贴壁细胞/总接种细胞，在×200放大倍数下五个随机450 µm×450 µm视野计算。

细胞形态

孵育2 h后，G/Z表面细胞固定并用菱氨酸鬼笔环肽(1:100 in 3% BSA)染F-actin，Zeiss LSM 510成像。形态也用SEM(Philips XL-30 ESEM)检查。样品载玻片计数并DAPI复染。

口腔黏膜刺激试验

十只雄性Wistar小鼠单侧颊囊植入老化G/Z，对侧植入未老化G/Z，依据YY/T 0127.13-2009。两周后肉眼检查颊囊，HE染色组织学检查颊黏膜。刺激指数 = 试验评分 - 对照评分。

统计分析

单因素方差分析(SPSS 22.0)评估活力、氧化应激、粘附合并数据。显著性设为P < 0.05。

结果

分级层结构

分级层厚度平均0.9-1.0 mm。SEM图(图1a,b)显示表面由残余玻璃、玻璃包覆氧化锆晶粒和晶间空隙组成——这些特征促进强核-面层粘附。EDS映射(图1c)显示梯度：深层Zr浓度增加，Si、Al、La减少，证实预期成分梯度[4]。

a 结构示意图。 b SEM图像。 c 功能分级层EDS分析

细胞活力

老化G/Z和Y-TZP在72 h时代谢活性显著下降(P < 0.00001)(图2a)。2, 24, 48 h两材料均无显著下降。老化前后各时间点G/Z与Y-TZP活力无差异(P > 0.05)。数据汇总见图2a。

老化前后G/Z和Y-TZP的生物相容性。数据为均值±SD, n=5。 a 老化和未老化试样处理HGF的细胞活力。 b ROS产生。 c 细胞粘附率。显著性对照组：^#P < 0.01; ^*P < 0.05

氧化应激

老化G/Z和Y-TZP在72 h时ROS显著升高(P < 0.00001)。早期时间点无显著差异(P > 0.05)。全程G/Z与Y-TZP ROS水平相当，老化前后均无差异(P > 0.05)。

细胞粘附

老化后G/Z和Y-TZP粘附率均上升(图2c)。老化前后两材料间无显著差异(P > 0.05)。Y-TZP和G/Z老化前后细胞粘附代表性图像见图3。

a 老化G/Z。 b 未老化G/Z。 c 老化Y-TZP。 d 未老化Y-TZP

细胞形态

荧光成像显示细胞贴附于老化和未老化G/Z，老化表面上细胞铺展和平展更明显(图4a-c)。SEM证实两表面上均有良好铺展、多角形、具大量微绒毛的细胞(图5a,b)。

HGF在老化前后G/Z上的贴附、铺展和形态(荧光显微镜)。 a,b 老化G/Z。 c 未老化G/Z。 细胞在基底培养72 h后固定，染丝状肌动蛋白(F-actin, 红)和细胞核(蓝)

HGF在老化前后G/Z上72 h培养后的形态SEM微照片。 a 老化G/Z。 b 未老化G/Z。 原始放大倍数：×2000

口腔黏膜刺激试验

老化和未老化G/Z的宏观和微观刺激评分均为0，表明无刺激。组织病理学确认无黏膜改变(图6a,b)。

老化G/Z(a)和未老化G/Z(b)处理的黏膜病理检查

讨论

因金属离子释放担忧，金属-陶瓷合金日益让位于无金属替代品[14-18]。虽然许多研究聚焦陶瓷改进，但G/Z体系提供了一条不添加金属成分即可增强氧化锆性能的有前途途径。本研究证明G/Z即使老化后仍保持与Y-TZP相当的生物相容性，该老化模拟了真实口腔条件。

老化导致两材料72 h细胞增殖减弱，与部分文献报道老化后生物相容性下降[20]一致，也与报道改善[21]的文献相反。差异可能源于不同老化方案。我们的方案——80 N载荷，2 Hz，10⁵循环，37°C人工唾液——模拟临床咬合力和温度，提供对老化影响的现实评估[22]。

观察到的活力下降和ROS升高可能反映离子扩散和t-m相变产生的局部应力，可损害细胞完整性[6,23]。

有趣的是，老化增加了两材料粘附但未改变相对粘附率。老化后粗糙、亲水表面可能增强蛋白吸附，促进更好细胞贴附[27-29]。相当的粘附表明G/Z表面性质老化后仍有利。

体内刺激试验显示无组织病理改变，支持G/Z用于黏膜接触的安全性。渗透过程中引入的少量单斜相可能在保持力学完整性的同时维持生物相容性，如Al₂O₃渗透Y-TZP先前工作所示[30]。

其他玻璃-氧化锆复合材料在体外和体内显示良好生物相容性和生物活性[31-33]。我们的发现将这一证据延伸至分级纳米玻璃/氧化锆体系，提供兼顾力学强度、美学和生物安全性的材料。

结论

生物相容性评估——包括细胞活力、粘附、形态、氧化应激和黏膜刺激——证明G/Z老化前后性能与Y-TZP相当。这些结果将G/Z定位为牙科修复体的有前途候选材料。需进一步全面体外和体内研究确证这些初步发现。

缩写

DAPI:

4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐

F-actin:

丝状肌动蛋白

FGM:

HAp-Al₂O₃-ZrO₂

G/Z:

分级纳米玻璃/氧化锆

SEM:

扫描电子显微镜

t-m:

四方到单斜

Y-TZP:

钇稳定四方氧化锆多晶