用于超声介导多柔比星靶向递送的生物相容性壳聚糖纳米泡

背景

化疗是目前恶性肿瘤的主要治疗方式，大大提高了癌症患者的生存率。然而，化疗药物的疗效受到其不良副作用的限制，例如全身毒性[1]。局部递送化疗药物可通过增加靶向部位的治疗剂量和降低循环药物的血浆水平来降低其毒性。由于其无创性和靶向性，超声靶向纳米/微泡破坏（UTN/MD）已被广泛用作有效的给药系统。

与传统的微泡相比，纳米尺寸的颗粒可以更容易地穿过毛细血管壁，因此可以更有效地输送到目标部位。 NBs 已被用于靶向治疗的研究，例如载有 5-氟尿嘧啶的 NBs 已被测试用于肝细胞癌 [2]。沉等人。最近使用超声介导的NBs将白藜芦醇递送至髓核细胞[3]，NBs也被用于治疗乳腺癌[4]。

UTN/MD 中使用的纳米气泡 (NBs) 通常由气核和稳定壳组成。在壳的组合物中使用脂质、表面活性剂、聚合物或其他材料。在以前的研究中已经制作了不同类型的 NB。然而，许多用于形成 NB 或纳米颗粒的化学物质对人体构成潜在威胁。因此，一些纳米颗粒的转运在正常组织和细胞中带来了不令人满意的治疗效果和毒性[5]。吐温 80 和戊二醛等化学制剂具有高毒性和致突变风险，从而限制了其临床应用 [6, 7]。 PLA 是 NB 中使用的另一种材料，在某些情况下可能会引起临床副作用 [8]。在此背景下，重要的是要考虑用于组装 NB 的材料的生物相容性和安全性。

壳聚糖多糖因其天然来源、生物降解性、生物相容性、极低的免疫原性、抗菌活性和实用性而备受关注[9, 10]。壳聚糖是甲壳素的N-脱乙酰衍生物，是地球上最丰富的生物材料之一[11]。此外，之前的一项研究表明，在 IFN-γ 存在的情况下，水溶性壳聚糖寡聚体可以激活巨噬细胞以杀死癌细胞 [12]。因此，壳聚糖本身具有直接和间接两种抗肿瘤作用，使其更适合作为抗癌药物的载体。我们在 NB 中使用的其他材料是卵磷脂和棕榈酸，它们是用于 NB 的绝佳候选材料 [13]。棕榈酸是饱和度最高的 14、16 和 18 碳脂肪酸之一，通常由乙酰辅酶 A 合成，具有低毒性和高生物相容性 [14]。卵磷脂是一种主要来自大豆的天然表面活性剂 [15]。先前的研究表明，大豆卵磷脂具有降低胆固醇的特性，因此对健康有益。例如，大豆卵磷脂有助于降低患心血管疾病的风险，而纯化大豆可用于包裹乳酸链球菌素 [16, 17]。在这项研究中，我们使用上述材料来制造生物相容性 NB。在超声递送的辅助下，盐酸多柔比星 (DOX) 被用作模型药物来测试新型生物壳聚糖 NBs 的载药能力，在人类密歇根癌症基金会-7 (MCF- 7) 乳腺癌细胞。此外，还评估了 UTN/MD 后 DOX-NBs 的抗肿瘤作用。

材料和方法

材料

本研究中描述的 NB 以全氟丙烷（C3F8，中国北京核工业物理化学工程研究所特种气体研发中心）为核心，壳聚糖涂层为壳构建。此外，Epikuron 200（含有95%二棕榈酰磷脂酰胆碱的大豆卵磷脂，Lukas Meyer，德国汉堡）、乙醇（分析级，Hushi，中国）、盐酸多柔比星（Sigma-Aldrich，Missouri，USA）、壳聚糖（100~300 KD , Bozhihuili, 中国青岛) 和棕榈酸 (JINDU, Shanghai, China) 也用于本研究。 Pluronic F68 购自 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)。

细胞系

MCF-7 人乳腺癌细胞系获自美国典型培养物保藏中心 (Rockville, MD, USA) 并在补充有 10% 热灭活胎牛血清 (FBS) (Gibco, Carlsbad) 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 中培养，加利福尼亚州，美国）。细胞在 37 °C、5% CO2 和 95% 湿度下培养。收集对数生长期细胞进行实验。

加载 DOX 的壳聚糖 NB 的制备

我们根据之前描述的方法制作了 NB [18, 19]。 DOX-NBs的壳使用中等分子量壳聚糖（100~300 kD），核使用全氟丙烷。为了制备 DOX-壳聚糖溶液，将适当剂量的 DOX 溶解在超纯水中，并通过涡旋混合器混合 5 s 将 2 ml DOX 溶液（1 mg/mL）加入壳聚糖水溶液中。 DOX-壳聚糖溶液在 65 °C 下孵育 1 小时。单独地，将含有 Epikuron 200 的乙醇溶液加入到棕榈酸水溶液中。加入适当体积的超纯水后，使用涡旋混合器将棕榈酸-Epikuron 200 系统均质化。随后，将棕榈酸-Epikuron 200 系统分装到 1.5 mL Eppendorf 管（EP 管）中，使用 10 mL 长细针注射器将管内空气置换为全氟丙烷。每个管在机械振荡器（Ag and Hg 混合器，西安，中国）中振荡 120 秒。接下来，将 1.5 mL EP 管中的所有液体倒入离心管中，并在冰浴中与 DOX-壳聚糖溶液混合。随后，将混合物在- 4 °C下温育30 分钟。接下来，Pluronic F68 (0.01%, w /w )，一种稳定剂，在搅拌的同时加入上述混合物中。然后进行透析纯化步骤（超滤离心管，Millipore，30 kDa）以去除任何残留的游离 DOX。

观察NB的物理特性

通过加入适量的 PBS（磷酸盐缓冲盐水）稀释 DOX-NBs 的悬浮液。然后在配备× 100油浸物镜（OLYMPUS BX41，Olympus Corporation，Japan）的荧光显微镜下观察并成像DOX-NB的形状。使用荧光显微镜（Nikon TE2000-S，日本）评估荧光图像。还通过透射电子显微镜（TEM）（JEOL，Tokyo，Japan）观察了 DOX-NBs 的形态。将稀释的纳米气泡水悬浮液喷洒在涂有 Formvar 的铜网上，并用 4% w 染色 /v 醋酸双氧铀反应 10 分钟。然后使用 TEM 对样品进行可视化和成像。 DOX-NB 的尺寸和表面 zeta 电位通过 Delsa Nano C 粒度和 zeta 电位分析仪（Beckmann Instruments，USA）测量。所有测量一式三份进行以计算平均值。

DOX-NB 的稳定性

随着时间的推移测量 DOX-NBs 的大小和形态，以观察这些纳米气泡的稳定性。部分 DOX-NB 在 4 °C 的冰箱中储存 24 小时或 48 小时。其他的在室温下保持6 小时。还在冻干人血清（Seronorm™ Human，Norway）中研究了 25 °C 下的纳米气泡稳定性。为此，将 1 ml DOX-NBs 水悬浮液加入 1 ml 血清中，并在 25 °C 下孵育 6 小时。然后，使用光学显微镜通过形态分析测量所有 DOX-NB，以评估其结构的完整性。通过Delsa Nano C粒度和zeta电位分析仪（Beckmann Instruments，USA）测量NB的尺寸。

NBs DOX-Loading容量的确定

使用浓度为 0.025、0.05、0.1 和 0.2 mg/mL 的系列 DOX 稀释液制备 DOX 浓度的标准曲线，并使用紫外分光光度计（UV-2450，SHIMADZU）测量。随后，使用空白 NB 作为对照，在 480 nm 处评估 DOX 负载效率，并根据上面建立的标准曲线计算 DOX-NB 中的 DOX 浓度。为避免纯化和测量过程中 DOX 的光降解，所有程序均在避光下进行。随后，将 DOX-NB 的悬浮液用冷冻干燥机在 - 55 °C 和 0.080 毫巴下冷冻干燥 1.5 天 [20]。然后称重冷冻干燥的 DOX-NB 以根据药物包封效率 (EE) 计算载药量，如下所示：EE =A /B × 100%，其中A 是 NBs 中加载的 DOX 量，B 是溶液中 DOX 的初始量。实验重复3次。

超声介导的 DOX 释放

在存在和不存在超声 (US) 的情况下，通过透析袋技术在 37 °C 下测定 DOX-NB 中 DOX 的体外释放动力学。将 DOX-NB 封装在透析膜（Spectra/Por，截止值 12,000–14,000 Da）中，将其置于 100 ml PBS 的容器中，并以 100 rpm 振荡。 US 组在测试前由 US（VCX400，Sonics and Materials，美国；功率密度，1.0 W/cm2；频率，20 kHz）超声处理 40 s [21]。测量 DOX 释放长达 24 小时，在每个固定时间抽取 1 ml 并用 1 ml 新鲜 PBS 代替。通过紫外分光光度计在 480 nm 处测量外部缓冲液中 DOX 的浓度。释放实验一式三份进行。

体外超声成像（时间-强度曲线）

DOX-NBs 在超声下的美国成像和稳定性在临床超声扫描仪系统 (LOGIQ E9; GE, USA) 上进行了体外验证。该实验是在特定频率、传输功率和超声波暴露持续时间下进行的。利用先前开发的方法 [19]（图 5a），DOX-NB 实现了超声增强。在暴露于机械指数 (MI) 为 0.10 和成像深度为 4.5 cm 的超声刺激后，评估了 DOX-NBs 的超声成像稳定性。使用Image J对所有US图像进行离线分析。随后，使用LOGIQ E9的内置软件进行图像分析，计算样品的灰度值。对于从 0 到 15 min 获得的每个 60 秒剪辑，首先对每一帧进行运动校正，并获得分贝值。每个分贝值都绘制在时间-强度曲线上，以反映超声照射前后对比度增强的变化。峰值强度和增强持续时间由时间-强度曲线表示。在分析过程中，通过减去与水样相对应的背景信号得到距离校正后的后向散射值。

空 NB 的细胞毒性分析

使用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 检测试剂盒 (Sigma-Aldrich, USA) 测试空壳聚糖 NB 的生物安全性。在测定之前，MCF-7细胞以2 × 10 ³ 的密度铺板 96 孔板中的细胞/孔。通过不同浓度的壳聚糖 NB 和超声条件对细胞进行处理。壳聚糖 NB 的生物安全性是通过在 0 到 30% 的 NB 系列浓度下孵育 MCF-7 细胞来评估的。使用低强度超声刺激设备（US10，Cosmogamma Corporation，Italy）进行超声刺激，频率固定为1 MHz，占空比为70%，脉冲频率为100 Hz。每组处理不同的辐照时间和不同的声强。出于安全考虑，超声波的使用强度为 0.5 W/cm ² 或 1.0 W/cm ² 脉冲长度为 30 或 60 s（表 1）。在所有超声实验中，深度、频率和其他超声条件保持一致 [22]。处理后，将细胞在 96 孔板中再培养 24 小时。随后，用含 1% FCS 的维持培养基代替含药培养基，并按照制造商的说明将 CCK-8 溶液加入板中。在 37 °C 下再孵育 2.5 小时后，使用酶标仪（Bio-Rad，美国）在 450 nm 波长下测定每个孔中的分光光度吸光度。

体外细胞内药物摄取

通过流式细胞术（Beckman Coulter，Miami，USA）测定 DOX 的细胞内摄取。简而言之，将MCF-7细胞以2.5 × 10 ⁵ 的密度接种到六孔板中 细胞/孔在补充有 10% FBS 的 DMEM 培养基中。过夜培养后，将培养基替换为含有相同浓度的 DOX-NBs 或游离 DOX 的培养基，并用或不用超声处理细胞。考虑到细胞活力和较高的声穿孔效率，后续实验选择DOX-NBs浓度为20%，超声处理强度设置为0.5 W/cm ² 脉冲长度为 30 或 60 s。随后，孵育1小时后，去除细胞培养基，用新鲜的PBS洗涤细胞3次以去除游离和未结合的DOX-NBs或DOX。然后通过离心（5 分钟，1000 rpm）收集细胞，在细胞内摄取 DOX 之前重新悬浮在 500 μL PBS 中，并在 FACSCalibur 流式细胞仪上进行分析。分析过程中任意设置检测红色荧光的门限，每个样品分析10,000个细胞。

DOX-NBs 对体外 MCF-7 细胞的影响

使用 CCK-8 测定和流式细胞术对摄取 DOX 后的 MCF-7 细胞增殖和凋亡进行定量评估。简而言之，将 MCF-7 细胞接种在 96 孔板或 6 孔板中并孵育，并使用上述程序进行处理。对于增殖测定，将处理过的细胞在 37 °C 下孵育 24 小时，然后进行 CCK-8 染色 2 小时，并在酶标仪上读取吸光度。 DOX诱导的细胞凋亡通过Annexin V-APC测定法测定如下：处理6小时后，通过向每孔中加入0.5 μL V-APC（Sungene Biotech，天津，中国）对细胞进行染色，流式细胞术分析(Beckman, Coulter, Fullerton, CA, USA) 用于量化凋亡细胞。

统计分析

所有实验一式三份进行，数据表示为平均值。使用SPSS 18.0版进行统计分析。一个 p 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

DOX-NBs 的物理化学表征

制备的 NB 显示出球形形态。在倒置显微镜下，NBs 的成像显示离散和完整的球形轮廓（图 1a），这与 DOX-NBs 的荧光显微镜成像（图 1b）一致。 DOX-NBs 溶液的代表性 TEM 图像如图 1c 所示。 NBs 的物理性质由粒度和 zeta 电位分析仪确定。如图 2 所示，DOX-NBs 的平均直径为 641 nm，P.I. 0.256。 DOX-NBs的zeta电位为+ 67.12 ± 2.1 mV，足以使它们相互排斥，有助于防止NB聚集并支持其长期稳定性。

光学显微镜下观察的NBs（放大倍数× 1000）（a ) 和加载 DOX 的 NBs 的荧光显微镜图像 (b ) 和加载 DOX 的 NBs (c )

载有 DOX 的 NBs 的粒径分布

DOX-NBs 的稳定性和载药效率

DOX-NB 在 4 °C 下悬浮稳定 48 小时。在室温下储存后，发现 DOX-NB 在 PBS 和人血清中的大小都略大（图 3）。 DOX-NBs的最终负载量为64.12 mg DOX/g DOX-NBs，对应的EE为54.18%。

DOX-NBs a 的光学图像 在室温下，b 在 PBS 中 25 °C 6 小时后，c 25 °C 6 小时后在血清中

DOX-NB 体外释放 DOX

图 4 显示了在存在或不存在 US 处理的情况下，DOX 从 PBS 中的 DOX-NB 的体外释放曲线，以评估超声处理对 DOX 释放的影响。 DOX-NBs 释放的 DOX 量在美国组和非美国组之间有显着差异。 5 小时后，美国组的 DOX-NBs 释放了 46.45% 的封装 DOX，而非美国组仅释放 9.3%。非美国组在 24 h 后仅释放 19.4% 的 DOX。相比之下，美国组有近80%的DOX出院。结果表明，由于空化效应，US辐照可能促进DOX-NBs释放DOX。

有或没有超声波照射 (2 kHz, 1.0 W/cm ² ) 从 DOX-NB 中释放多柔比星 )

DOX-NB 的超声稳定性

DOX-NBs 在体外实现了超声增强，如图 5b 所示。超声分贝值衰减如图 5c 所示。结果表明，DOX-NBs 实现了良好的超声增强，平滑的曲线表明 NB 悬浮液中的超声衰减过程相对较慢。这表明DOX-NBs的超声信号可能足够稳定，可用于成像和对比度增强。

体外实验装置示意图 (a )，使用 9.0-MHz 探头 (b ) 和超声对比度和加载 DOX 的 NBs 的时间强度测量 (c )

空 NB 的生物安全

通过在超声后用空 NB（不含 DOX）培养 24 小时来测量 MCF-7 细胞活力。如图 6 所示，在某些超声强度下，空 NB 不会显着影响细胞活力。当使用超声波强度为 0.5 W/cm ² 和 30 s 的照射时间，分别有 99.53% 和> 80% 的 MCF-7 细胞在 10% 和 30% NBs 悬浮液中存活（第 1 组），并且 MCF-7 细胞活力的降低呈剂量依赖性。此外，超声波强度和照射时间是影响 MCF-7 细胞活力的另外两个因素。特别是当空NBs浓度为30%时，MCF-7细胞在0.5 W/cm ² 30 s 显示出比 0.5 W/cm ² 处理的更高的活力 60 s 或 1 W/cm ² 30 s（0.84% vs. 0.75% vs. 0.63%）。因此，超声波强度为 0.5 W/cm ² 细胞摄取实验采用30 s/60 s的辐照时间。

不同浓度NBs和声强对MCF-7细胞的体外细胞毒性

通过 DOX-NB 和超声辐照增强体外 DOX 递送

将用 DOX-NBs 或游离 DOX（相同 DOX 浓度）处理的 MCF-7 细胞固定，并通过流式细胞术测量其荧光强度。未接受 DOX 处理的细胞用作空白对照。将 DOX-NBs 组中 DOX 的细胞摄取与游离 DOX 和对照组的细胞摄取进行比较。在图 7 中，与 DOX-NBs 孵育的 MCF-7 细胞的平均荧光强度远低于与游离 DOX 孵育的细胞的自发荧光，说明壳聚糖 NBs 中 DOX 的封装可以保护细胞免受 DOX 摄取和 DOX-致损伤。

载有 DOX 的 NBs (US1 0.5 W/cm ² ) 对 MCF-7 细胞中 DOX 递送的流式细胞术分析 30 s, US2 0.5 W/cm ² 60 s)

然而，超声照射导致与 DOX-NBs 孵育的 MCF-7 细胞中 DOX 摄取显着增加； DOX-NBs 可以在超声波照射的帮助下将更多的 DOX 输送到 MCF-7 细胞中。相比之下，在超声照射下，与游离 DOX 孵育的 MCF-7 细胞中 DOX 的摄取仅略有增加。结果表明，在超声照射下，DOX-NBs培养的MCF-7细胞对DOX的摄取明显高于游离DOX培养的细胞。

此外，与 DOX-NBs 一起孵育的 MCF-7 细胞中的 DOX 摄取在较长的照射时间后略有增加。这可能是由于 DOX-NBs 的破裂增加，在 MCF-7 细胞膜上产生瞬时孔。

超声辐照增强 DOX 诱导的肿瘤细胞增殖和凋亡

为了研究超声辅助 DOX-NBs 递送的抗癌作用，使用 CCK-8 测定和流式细胞术测量了 MCF-7 细胞的活力。结果表明，DOX-NBs组MCF-7细胞活力高于无超声DOX组。同时，DOX-NBs组MCF-7细胞活力明显低于局部超声照射DOX组。 DOX-NBs组细胞存活率(21.0 ± 2.2%, p <0.01)远高于无超声照射的游离DOX组(6.4 ± 0.7%)，表明NBs作为药物递送载体改善了DOX诱导的血液循环中细胞增殖的减少。

此外，与单独使用 DOX-NBs 处理的细胞（21.0 ± 2.2%，p <0.01）、单独的游离 DOX（6.4 ± 0.7%）和游离 DOX + 超声（4.1 ± 0.8%、3.8 ± 0.6%）（图 8）。数据表明，DOX-NBs + US 显着增强了 DOX 对 MCF-7 细胞的细胞毒作用。 DOX-NBs + US 组在 MCF-7 细胞中也表现出比游离 DOX 和游离 DOX + 超声组更大的细胞毒性。

不同组间细胞活力的比较

游离DOX+超声组细胞活力的比例（4.1 ± 0.8%）低于游离DOX组（6.4 ± 0.7%）。因此，超声也降低了用游离 DOX 处理的 MCF-7 细胞的活力。 DOX-NBs+超声（60 s）处理细胞活力的比例为2.2 ± 0.9%，低于DOX-NBs+超声处理（30 s）（3.1 ± 0.8%），表明更长的脉冲长度（60 s）在 DOX-NBs 递送中更有效。

此外，在有或没有超声照射的情况下，在游离 DOX 或 DOX-NB 处理后 6 小时，通过膜联蛋白 V 染色评估 MCF-7 细胞的凋亡。在游离 DOX 存在下，凋亡 MCF-7 细胞的百分比为 4.4 ± 0.9%，而在用游离 DOX 和超声处理的细胞中观察到类似的比例（30 s，60 s）。与游离 DOX 组相比，超声辅助 DOX-NB 的递送显着增加了凋亡细胞的百分比（45.7 ± 1.1% vs. 4.4 ± 0.9%，p <0.01)。此外，未超声照射的 DOX-NBs 组的凋亡细胞百分比低于游离 DOX 治疗组（3.2 ± 0.9% vs. 4.4 ± 0.9%）。与细胞活力测定一致，这些数据表明超声辅助DOX-NBs递送增强了DOX的抗癌作用。

讨论

乳腺癌因其高发病率和死亡率而受到越来越多的关注。根据 Globocan 的一份报告，乳腺癌是欠发达地区女性癌症死亡的最常见原因 [23]。 DOX 是一种流行的抗乳腺癌药物，因为它可以诱导 DNA 损伤 [24]。然而，在临床应用中，它也会引起严重的副作用，例如心脏毒性[25]。为了克服这种毒性作用，需要仅靶向癌细胞的有效药物递送系统，从而增加其靶位点的药物浓度并降低非靶组织中的药物浓度 [26]。本工作设计了负载DOX的生物壳聚糖NBs，结合超声，可将DOX定向转运至乳腺癌细胞。

由卵磷脂和棕榈酸组成的生物壳聚糖 NB 已被配制并用于 MRI/超声检测、基因传递和氧气传递 [13, 18, 27]。然而，生物壳聚糖 NB 的载药能力和递送效率远非最佳。马拉诺等人。结合负载 DOX 的乙二醇壳聚糖 NBs 和体外冲击波 (ESW) 来增强 DOX 的抗肿瘤活性 [28]。但是ESW不具备评估肿瘤大小和准确检测其位置的成像能力。此外，虽然 ESW 的严重副作用很少见，但它们可能会诱发一过性心律失常 [29]。乙二醇的代谢物包括乙醇酸和草酸钙的沉淀也可能导致严重的代谢性酸中毒[30]。与ESW相比，超声在成像能力、无创性和安全性方面具有更大的优势。

本研究以全氟丙烷为核，壳聚糖为壳，制备了新型 DOX-NBs。壳聚糖可以激活巨噬细胞，也可以增强它们的促炎功能 [31]。应该注意的是，带正电荷的 DOX-NB 可能与血液成分发生强烈相互作用，导致从血液中快速清除并在肿瘤部位进行次优的靶向积累 [32]。为了克服这个问题，DOX-NBs 的表面涂有 Pluronic F-68，这是一种由环氧丙烷和乙烯单元形成的两亲性和非离子嵌段共聚物，它也可以通过空间稳定来防止纳米气泡的聚集 [13, 33 ].

Ensuring the biosafety of NBs is fundamental to their clinical application. In this study, the safety of chitosan NBs was monitored via cell viability, which showed no obvious effect on cell viability with a chitosan NB concentration of 10% and ultrasound treatment (0.5 W/cm ² , 30 s), suggesting low cytotoxicity of chitosan NBs. Indeed, even treatment with a high dosage (30%) of chitosan NBs resulted in less than 20% observable cell death. The results showed that cell viability in chitosan NBs was much higher than that in lipid-coated nanobubbles [19], indicating that chitosan NBs were highly biocompatible with MCF-7 cells and that the cell death observed in this study may be due to the energy released by ultrasound-induced NB disruption. The high safety profile of biocompatible chitosan NBs renders them suitable for loading other drugs in the future.

Our research shows that US irradiation can effectively promote the release of DOX from DOX-NBs and subsequent cellular uptake of DOX in vitro. Exposure of cells to DOX-NBs and ultrasound resulted in near instantaneous cellular entry of DOX. The reason for this is that sonoporation is a process by which ultrasonically activated ultrasound contrast agents pulsate near biological barriers (cell membranes or endothelial layers), increasing their permeability and thereby enhancing the extravasation of external substances. In this way, drugs and genes can be delivered inside individual cells [34]. Our data showed that the cellular uptake of DOX was significantly higher in the DOX-NBs group than in the free DOX group when ultrasound-assisted delivery was applied. Meanwhile, without ultrasound, MCF-7 cells in the free DOX group showed increased DOX uptake than those in the DOX-NBs group, indicating that the chitosan NBs could reduce cellular uptake of DOX in normal tissues and protect them in the absence of ultrasonic irradiation.

陈等人。 showed that the carrier-free HCPT/DOX nanoparticles enhanced synergistic cytotoxicity against breast cancer cells in vitro [35], but they could not reduce DOX cytotoxicity and its toxicity in the circulation. A biophysical research group from Vytautas Magnus University proposed combining DOX-liposomes with microbubbles and US to enhance targeting [36]. Their results showed that the cell survival rate of DOX-liposomes decreased by 60~70% when microbubbles and ultrasound were present. By comparison, the cell survival rate of the DOX-NBs + US group in our study was 85.3% or 89.5% ((21–3.1 or 21–2.2)/21) lower than that of the DOX-NBs group. This proves that the combination of DOX-NBs and US are more effective in transporting DOX than DOX-liposomes combined with microbubbles and US. We also found that the cells in the DOX-NBs + US group showed a higher rate of apoptosis than those in the free DOX and DOX-NBs only groups. This finding was not unexpected as greater accumulation of DOX in cancer cells can increase cell death, consistent with a previous report [37].

结论

In summary, DOX-loaded biocompatible chitosan NBs were successfully prepared using a combination of biological surfactants. The prepared NBs possessed a good ability to achieve ultrasound enhancement and excellent biosafety. The in vitro results demonstrated that DOX­NBs are an innovative drug delivery system that may be useful in obtaining efficient ultrasound­assisted DOX delivery for the treatment of mammary cancer.

缩写

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DMEM：

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

EE：

Encapsulation efficiency

EP tubes:

Eppendorf tubes

ESWs:

Extracorporeal shock waves

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

NBs:

Nanobubbles

US:

Ultrasound

UTN/MD:

Ultrasound-targeted nano/microbubble destruction