创新核苷-脂质纳米载体增强索拉非尼递送并降低毒性

摘要

尽管索拉非尼作为一种酪氨酸蛋白激酶小分子抑制剂，在癌症化疗中是全球通用的选择，但其水溶性低（<5 μM）、毒性和副作用等问题仍亟待解决。纳米载体被视为克服这些缺陷的有效策略。本文报道了一种由混合核苷-脂质稳定的新型索拉非尼纳米颗粒。固体脂质纳米颗粒（SLNs）根据核苷-脂质电荷呈现负或正zeta电位。透射电镜显示索拉非尼负载的SLNs为平行六面体纳米颗粒，尺寸约200 nm。在肝癌和乳腺癌等四种细胞系上的生物学研究表明，SLNs显著增强了索拉非尼的抗癌活性。重要的是，在高浓度索拉非尼（>80 μM）SLNs孵育癌细胞后，相差显微镜图像显示所有情况下癌细胞完全死亡。这些结果突显了核苷-脂质基SLNs作为药物递送系统的潜力。

背景

索拉非尼商品名Nexavar™，是一种疏水性激酶抑制剂，获批用于晚期肾细胞癌（RCC）、肝细胞癌（HCC）和晚期甲状腺癌等多种人类癌症治疗。索拉非尼靶向多种蛋白激酶，包括跨膜受体和细胞内酪氨酸/丝氨酸-苏氨酸激酶，也能诱导凋亡。其作用机制为通过多靶点抑制肿瘤生长，直接作用于肿瘤和/或通过抑制VEGFR和PDGFR信号通路抑制肿瘤血管生成。其抑制恶性细胞生长的功效已在黑色素瘤、甲状腺癌、胰腺癌、肝细胞癌、白血病等多种组织学癌症类型中得到验证。然而，低水溶性、毒性和副作用限制了其在许多临床应用中的使用。为解决这些问题，目前正研究多种索拉非尼制剂，包括液晶纳米颗粒、纳米乳液、环糊精修饰多孔硅纳米颗粒、药物洗脱纳米复合材料、聚电解质纳米颗粒、姜黄素自组装纳米颗粒等。但负载索拉非尼的脂质纳米颗粒（LNs）研究较少。

本文首次报道了由核苷-脂质稳化的索拉非尼基固体脂质纳米颗粒（SLNs）。色谱研究表明，带正电（DOTAU）和负电（diC₁₆dT）的核苷脂质具有药物递送应用所需的稳定性和纯度。简单的纳米沉淀法可制备带正电荷（SLN⁺）或负电荷（SLN⁻）的SLNs（图1）。值得关注的是，所有研究的SLNs均增强了索拉非尼对不同人类癌细胞的细胞毒性，表明SLNs可克服索拉非尼在水溶性和抗癌活性方面的局限。

方法

化学品与试剂

甲醇（MeOH）、甲酸（FA）、甲酸铵（AFNH₄）购自VWR Chemicals（法国），均为HPLC级。HPLC级水（电阻率≥18.2 MΩ）由ELGA Millipore系统（法国）自制。DOTAU（CAS: 868226-06-6）和diC₁₆dT（CAS: 1160002-70-9）按文献[23,24,25]在实验室合成。索拉非尼（CAS: 284461-73-0）购自SynVec（Ref# D114250414）。

色谱研究

建立反相超高效液相色谱（UHPLC）法，用于SLNs中核苷脂质（DOTAU和diC₁₆dT）和索拉非尼的定量。进样前，纳米颗粒水溶液分别用乙醇稀释5倍和10倍以定量核苷脂质和索拉非尼。使用Dionex-Thermo Scientific（美国）UHPLC UltiMate 3000系统，配备四元阀柱选择泵、恒温自动进样器、恒温柱箱。色谱柱为Syncronis C18 50×2.1 mm, 1.7 μm。流动相A为70/30 MeOH/25 mM乙酸铵（pH=7.4），B为26.5 mM乙酸铵/甲醇（pH=7.9）。流速0.2 mL/min，梯度：0-2 min 0-100% B；2-20 min 100% B。柱温25 °C。检测波长：索拉非尼和diC₁₆dT为267 nm，DOTAU为257 nm。进样量1 μL，索拉非尼定量限0.6 ng，两核苷脂质均为15 ng。标准曲线见补充材料Figures SI1-SI3。

索拉非尼纳米颗粒制备

10 mg索拉非尼溶于1 mL乙醇，10 mg核苷脂质（diC₁₆dT或DOTAU）溶于1 mL乙醇。混合100 μL核苷脂质、100 μL索拉非尼溶液和800 μL乙醇，室温下滴加入10 mL蒸馏水中并磁力搅拌。超声水浴90 min（25 °C）。30 °C减压除去乙醇，定容至1 mL。用6 mm超声探针（Vibracell 75186）以100%振幅、脉冲2秒/间隔5秒超声两次，每次10 min。1 mL透析对30 mL蒸馏水，3×15 min。定容至2 mL保存用于表征、定量和稳定性研究。对照实验按相同流程无核苷脂质进行。

透射电镜（TEM和EDX）

负染电镜观察纳米颗粒。10 μL样品置于碳膜铜网10 min，干燥后用2.5%（w/w）醋酸铀染色2 min。Hitachi H 7650电镜观察。能谱X射线光谱用TECNAI透射电镜联用Quantax-X-Flash SVE 6进行。

粒径与Zeta电位测定

用Zetasizer NanoZS（Malvern）测定。40 μL样品稀释于400 μL水中，25 °C测量。

细胞毒性分析

HuH7和HepG2在DMEM-Glutamax含10%胎牛血清中单层培养。MDA-MB-134和T-47D在RPMI含10%胎牛血清中培养（T-47D额外添加非必需氨基酸1X、葡萄糖0.45%、胰岛素10 mg/L、丙酮酸钠1X）。所有培养试剂购自Invitrogen。96孔板每孔接种10⁴细胞/90 μL完全培养基，37 °C、5% CO₂孵育24 h后加入10 μL SLNs或索拉非尼。索拉非尼用0.1% DMSO溶于培养基，最大无沉淀浓度5 μM；SLNs负载索拉非尼最大浓度测至120 μM且无需DMSO。孵育4天后，用福尔马嗪基增殖分析（CellTiter 96® Aqueous One Solution, Promega）评估细胞活力，加入20 μL/孔试剂，37 °C、5% CO₂孵育30 min，Berthold分光光度计492 nm测吸光度。结果表示为：(OD₄₉₂处理细胞 - OD₄₉₂空白) / (OD₄₉₂未处理细胞 - OD₄₉₂空白) × 100%。

细胞活力研究

HuH7按上述方法培养。用Calcein-AM/碘化乙锭活/死染色试剂盒（Invitrogen）检测不同浓度（0, 1, 5, 10, 25, 50, 100 μM）SLN⁺负载索拉非尼孵育4天后的细胞活力。简述：移去培养基，HBSS洗涤一次，加入含2 μM Calcein-AM和4 μM碘化乙锭-1的HBSS 200 μL/孔，37 °C、5% CO₂孵育45 min。染色后HBSS洗涤一次，倒置荧光显微镜成像。死细胞百分比经流式细胞术（FACS）分析：4 μM碘化乙锭-1染色后胰蛋白酶消化，PBS离心洗涤两次（1000 rpm, 5 min）。BD LSRFortessa流式细胞仪采集数据，DIVA软件分析。70%甲醇处理死细胞作对照。

结果与讨论

SLNs合成与表征

核苷脂质的无毒性和自组装特性使其成为封装索拉非尼等疏水药物的理想两性添加剂。本研究开发简单纳米沉淀法，解决索拉非尼低水溶性问题并增强抗癌活性。我们假设索拉非尼的疏水性、杂环和氢键官能团有利于与核苷脂质相互作用形成纳米颗粒。同时预期SLNs负载索拉非尼可通过增强细胞摄取提高抗肿瘤活性。此前我们在顺铂纳米颗粒研究中已证实抗肿瘤活性增强源于癌细胞内药物内化量增加。纳米沉淀过程三步：(i) 索拉非尼在乙醇中40 °C溶解（10 mg/mL, 100 μL）并加入等当量核苷脂质（阴离子diC₁₆-3'-dT或阳离子DOTAU, 10 mg/mL乙醇溶液100 μL）；(ii) 1 mL乙醇溶液室温滴加入10 mL蒸馏水；(iii) 旋蒸除去多余乙醇并超声处理。

色谱研究

为评价新制剂药物负载能力，建立反相UHPLC法。该法可在12 min内同时分离索拉非尼和核苷脂质，实现SLNs中化合物个体定量（补充材料Figure SI1-4）。索拉非尼/核苷脂质质量负载比分别为50%和80%，索拉非尼包封率分别约55%和75%（SLN⁺为DOTAU配方，SLN⁻为diC₁₆dT配方）。对照实验无核苷脂质时，索拉非尼在制备各步骤中约90%损失，可能因其水溶性低。这证明核苷脂质对溶解索拉非尼和稳定SLNs至关重要。

物理化学研究

动态光散射（DLS）表征SLNs形成。阴阳离子核苷脂质（diC₁₆dT和DOTAU）均形成形貌相似的非球形平行六面体纳米颗粒，单分散性良好（PDI=0.202和0.289；尺寸=335.2和304.4 nm，图2及补充材料Figure SI7）。符合预期，SLNs的zeta电位取决于核苷脂质极性头基（ζ=+59.1和-54.9 mV，分别对应SLN⁺和SLN⁻，见补充材料Figure SI10）。TEM成像和EDX验证了索拉非尼在纳米颗粒中的存在。图2e、f显示I和II两点EDX采集。图2f中I点显示氯原子发射峰（图2e、f中I点），表明索拉非尼存在（见化学结构图2f）。氯仅在I点出现，II点无（图2f）。

重要的是，对照实验中无核苷脂质时纳米沉淀未产生任何纳米物体，证明核苷脂质使SLNs形成并稳定化。

稳定性研究

在两温度下用DLS和zeta电位测定SLN⁺和SLN⁻胶体稳定性（图3a及补充材料Figure SI10）。diC₁₆dT基配方中，SLN⁻在4 °C和37 °C下30天粒径无变化，显示高稳定性（补充材料Figure SI9）。这种稳定性可归因于diC₁₆dT与索拉非尼间相互作用（氢键、π-π堆积、电荷/电荷相互作用）。但DOTAU基配方中，SLN⁺仅在4 °C下稳定30天（图3a），37 °C下粒径和PDI均增加（图3a）。SLN⁺在37 °C的相对不稳定可能因索拉非尼和DOTAU均带正电荷产生库仑排斥。有趣的是，胶体稳定性研究表明可根据稳定SLNs的核苷脂质类型调节稳定性，从而调控索拉非尼从SLNs向生理环境的释放，这对所需释放动力学具有吸引力。

并行胶体稳定性研究，用新色谱法考察索拉非尼、DOTAU和diC₁₆dT在SLN配方中的化学稳定性随时间在4和37 °C下的变化（补充材料Figure SI4）。动力学结果见图3b和补充材料SI5（分别对应DOTAU-SLNs和diC₁₆dT-SLNs）。结果显示索拉非尼和diC₁₆dT在配方中至少1个月保持稳定，表明SLN⁻在两温度下长期化学稳定。但SLN⁺配方中DOTAU随时间减少。4 °C下7天损失约12%，30天损失20%。升温至37 °C，DOTAU稳定性下降，7天损失55%，30天损失高达95%。核苷脂质间化学稳定性差异在先前稳定性研究中已证实（补充材料Figure SI6）。

生物学研究

通过细胞代谢活性和形态评价SLNs细胞毒性。MTT法比较游离索拉非尼（0.1% DMSO）和负载药物SLNs在四细胞系（两肝癌HuH7、HepG2；两腔隙乳腺癌MDA-MB-134、T-47D）上的效果（图4）。首先，在接近游离索拉非尼最大溶解度浓度下（游离索拉非尼5 μM，0.1% DMSO；DOTAU纳米颗粒2.8 μM；diC₁₆dT纳米颗粒4 μM），两种SLNs抑制细胞活力均优于游离索拉非尼。图4b显示MDA-MB-134细胞活力研究：游离索拉非尼受水溶性限制（5 μM时细胞活力100%），而SLN⁺和SLN⁻的IC₅₀分别为15和50 μM。HuH7细胞FACS研究得IC₅₀约50 μM（补充材料Figures SI12、SI13）。相差显微镜图像显示，经SLN⁻和SLN⁺处理的细胞层密度降低，细胞形态无改变（补充材料Figure SI11）。其次，在更高SLNs浓度下（SLN⁻索拉非尼浓度120 μM，SLN⁺为84 μM）与游离索拉非尼溶解度极限（5 μM）对比。两种SLNs在四癌细胞系均显强细胞毒性（图5）。相差显微镜图像显示，SLN⁻（图5C1-4）和SLN⁺（图5D1-4）均出现细胞碎片，证实细胞死亡；而游离索拉非尼组细胞存活（图5B1-4）。值得注意的是，两种SLNs在腔隙B型乳腺癌细胞中均表现出强抗肿瘤效应（图5C1-2、D1-2），此前未有报道，为索拉非尼经SLNs递送开辟新治疗应用。

结论

我们报道了一种基于核苷脂质的新方法，实现索拉非尼高效封装和递送。研究证明形成两类高负载索拉非尼的固体脂质纳米颗粒（SLNs）。这些SLNs呈负或正zeta电位，呈平行六面体形状。DLS和HPLC研究显示，SLNs稳定性可通过核苷脂质类型调控。重要的是，SLN⁺和SLN⁻配方均能显著提高索拉非尼水溶性（浓度>120 μM）。此类SLNs在四癌细胞系（肝癌和乳腺癌）上表现出比游离索拉非尼更好的抗肿瘤活性，后者受限于水溶性差。四癌细胞系相差显微镜图像显示，孵育120 μM SLN⁻或84 μM SLN⁺后细胞死亡率剧增。因此，该药物可作为肝癌（如肝动脉化疗）或乳腺癌的新治疗选择。据我们所知，这是首个利用索拉非尼针对腔隙B型乳腺癌的研究，证明了SLN方法的实用性。总之，本文结果突显了核苷-脂质基SLNs作为药物递送系统的潜力。

缩略语

AFNH₄:

甲酸铵

DLS:

动态光散射

FA:

甲酸

HCC:

肝细胞癌

HPLC:

高效液相色谱

LNs:

脂质纳米颗粒

MeOH:

甲醇

PDI:

聚分散指数

RCC:

肾细胞癌

SLNs:

固体脂质纳米颗粒

UHPLC:

超高效液相色谱