用于索拉非尼递送的基于核苷脂质的纳米载体

背景

以 Nexavar™ 名称商业化的索拉非尼是一种疏水性药物激酶抑制剂 [1]，被批准用于治疗不同的人类癌症，包括晚期肾细胞癌 (RCC) [2]、肝细胞癌 (HCC) [3] 和晚期甲状腺癌癌。索拉非尼具有多种已知的蛋白激酶靶点，包括跨膜受体和细胞内酪氨酸和丝氨酸-苏氨酸激酶，并且还被证明可以诱导细胞凋亡。在作用机制方面，据报道索拉非尼通过多靶点抑制肿瘤生长，直接作用于肿瘤和/或肿瘤血管生成（通过抑制 VEGFR 和 PDGFR 信号传导）[4, 5]。其抑制恶性细胞生长的功效已在许多组织学癌症类型中得到证实，例如黑色素瘤 [6]、甲状腺 [7]、胰腺癌 [5]、肝细胞癌和白血病 [8]。然而，低水溶性、毒性和副作用限制了索拉非尼在许多临床应用中的使用。为了解决这些问题，目前正在研究几种索拉非尼制剂 [9, 10]，包括液晶纳米颗粒 [11]、纳米乳液 [12]、环糊精修饰的多孔硅纳米颗粒 [13]、药物洗脱纳米复合材料 [14]、聚电解质基于纳米粒子 [15] 或姜黄素自组装纳米粒子 [16]。然而，载有索拉非尼的脂质纳米颗粒（LNs）的研究却很少[17, 18]。

在此，我们报告了第一个基于索拉非尼的固体脂质纳米颗粒 (SLN) [19] 由核苷脂质 [20,21,22] 稳定的例子。对带正电荷和带负电荷的核脂（分别为 DOTAU 和 diC16dT）进行的色谱研究表明，这些两亲物具有在药物递送应用框架内使用所需的稳定性和纯度 [23, 24]。一个简单的纳米沉淀程序允许形成具有阳性 (SLN ⁺ ) 或负电荷 (SLN ⁻ ） （图。1）。值得注意的是，所有研究的前哨淋巴结都增强了索拉非尼对不同人类癌症的细胞毒作用，表明前哨淋巴结可以克服索拉非尼在水溶性和抗癌活性方面的局限性。

SLNs 制定方案。阴离子核苷酸脂质的化学结构，胸苷 3'-(1,2-dipalmitoyl-sn -glycero-3-phosphate) (diC16dT)、阳离子-核苷-脂质 DOTAU（2',3'-dioleyl-5'-deoxy-5'-trimethyl-amine-uridine）和本研究中使用的索拉非尼（左）。在核脂（diC16dT或DOTAU，导致SLN ^- ）纳米沉淀后获得的平行六面体形状的SLN示意图 和 SLN ⁺ ，分别）与索拉非尼（右）。示意图改编自透射电子显微镜 (TEM) 图像，显示 DOTAU 索拉非尼负载的纳米粒子（插图，条形 500 纳米）

方法

化学品和试剂

甲醇 (MeOH)、甲酸 (FA) 和甲酸铵 (AFNH4) 购自 VWR Chemicals（法国），均为 HPLC（高效液相色谱）级。 HPLC 级水（最小电阻率为 18.2 MΩ）由 ELGA Millipore 系统（法国）内部生产。 DOTAU（CAS 编号：868226-06-6）和 diC16dT（CAS 编号：1160002-70-9）根据参考文献 [23,24,25] 中报告的方案在实验室中合成。索拉非尼，4-[4-[[4-氯-3-(三氟甲基)苯基]氨基甲酰基-氨基]苯氧基]-N -甲基-吡啶-2-甲酰胺（CAS号：284461-73-0）购自SynVec http://synvec.fr (Ref# D114250414)。

色谱研究

开发了一种反相 UHPLC（超高效液相色谱）方法，用于对 SLN 中的核脂（DOTAU 和 diC16dT）和索拉非尼进行定量。在 HPLC 注射之前，将纳米颗粒的水溶液用乙醇稀释 5 倍和 10 倍，分别对核脂和索拉非尼进行定量。

使用了来自 Dionex-Thermo Scientific (USA) 的色谱系统 UHPLC UltiMate 3000，该系统由带有用于色谱柱选择的四元阀系统的泵、恒温自动进样器和恒温柱温箱组成。使用 Syncronis C18 50 × 2.1 mm, 1.7 μm 色谱柱进行分离。流动相由 70/30 MeOH/25 mM 乙酸铵（pH =7.4）（A）和 26.5 mM 乙酸铵的 MeOH 溶液（pH =7.9）（B）组成。使用 0.2 mL/min 的流速，梯度曲线为 0-2 分钟，0-100% B； 2–20 分钟，100% B。柱温设置为 25°C。索拉非尼和 diC16dT 在 267 nm 处进行检测，DOTAU 在 257 nm 处进行检测。注射体积为 1 μL，导致索拉非尼的定量限为 0.6 ng，核脂、DOTAU 和 diC16dT 的定量限均为 15 ng。

乙醇中索拉非尼、DOTAU 和 diC16dT 的标准曲线显示在附加文件 1：图 SI1、SI2 和 SI3 中。

索拉非尼纳米颗粒的制备

将 10 毫克索拉非尼溶解在 1 毫升乙醇中，并将 10 毫克 NL（diC16dT 或 DOTAU）溶解在 1 毫升乙醇中。在室温下将 100 微升 NL、100 微升索拉非尼溶液和 800 微升乙醇混合在一起，并在磁力搅拌下逐滴加入 10 毫升蒸馏水中。将溶液置于 25°C 的超声波浴中 90 分钟。在 30°C 下真空除去乙醇，并将体积调整为 1 mL。通过使用 6 毫米的超声波探头 (Vibracell 75186) 以 100% 振幅和每 5 秒 2 秒的脉冲对该溶液进行两次超声处理。 1 毫升用 30 毫升蒸馏水透析 3 × 15 分钟。此体积调整为 2 mL，并保留用于表征量化和稳定性研究。此外，在没有核脂的情况下，使用相同的方案实现了对照实验。

透射电子显微镜（TEM 和 EDX）

通过负染色显微镜观察纳米颗粒。将 10 微升纳米颗粒转移到碳涂层铜网格上 10 分钟。然后将样品干燥并用 2.5% (w /w ) 醋酸双氧铀在水中放置 2 分钟。用 Hitachi H 7650 电子显微镜观察样品。使用TECNAI透射电子显微镜与Quantax-X-Flash SVE 6耦合进行能量色散X射线光谱。

粒度和 Zeta 测定

使用 Zetasizer NanoZS，Malvern 确定粒子 zeta 和大小。实验是将 40 μL 纳米颗粒稀释在 400 μL 水中进行的，并在 25 °C 下进行测量。

细胞毒性分析

HuH7 和 HepG2 在补充有 10% 胎牛血清的 DMEM-Glutamax 中单层生长。 MDA-MB-134 和 T-47D 在补充有 10% 胎牛血清的 RPMI 中单层生长（仅适用于 T-47D，非必需 AA 1X，葡萄糖 0.45%，胰岛素 10 mg L ^-1 和丙酮酸钠 1X)。所有培养试剂均来自 Invitrogen。 10 ⁴ 将 90 μL 完全培养基中的细胞/孔接种到 96 孔板中，并在 37°C 和 5% CO2 下孵育 24 小时，然后在培养基中加入 10 μL SLN 或索拉非尼。索拉非尼（CAS 编号：284461-73-0）溶解在含有 0.1% DMSO 的培养基中。请注意，在这些条件下，没有沉淀的索拉非尼的最大浓度为 5 μM，而对于负载有索拉非尼的 SLN，测试的最大浓度为 120 μM，没有 DMSO。孵育 4 天后，通过添加 20 μL/孔的试剂溶液，使用基于甲臜的增殖测定（CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit, Promega）评估细胞活力。在 37°C、5% CO2 下孵育 30 分钟后，使用 Berthold 分光光度计在 492 nm 波长下测量每个孔的吸光度。结果表示为 \( \frac{{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{treatment}\ \mathrm{cells}-{\mathrm{OD}}_ {492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{blank}}{\ {\mathrm{OD}}_{492}\mathrm{of}\ \mathrm{未处理}\ \mathrm{cells}-{\mathrm {OD}}_{492}\ \mathrm{of}\ \mathrm{blank}} \).

细胞活力研究

HuH7 如先前在“细胞毒性分析”部分中所述生长。在与 SLN ⁺ 孵育 4 天后测定细胞活力 使用活/死细胞活力测定 (Invitrogen) 加载不同浓度（0、1、5、10、25、50 和 100 μM）的索拉非尼。简而言之，去除培养基，用汉克斯平衡盐溶液（HBSS）洗涤贴壁细胞一次。将 200 微升含有 2 μM 钙黄绿素乙酰氧基甲酯和 4 μM 乙锭同二聚体-1 的 HBSS 添加到每个孔中，并在 37°C 和 5% CO2 下孵育 45 分钟。染色后，细胞用 HBSS 洗涤一次，并在倒置荧光显微镜上显微成像。通过荧光激活细胞分选 (FACS) 分析评估死细胞的百分比。用 4 μM 乙锭 homodimer-1 溶液染色后，用胰蛋白酶处理细胞并用磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 以 1000 rpm 离心 5 分钟洗涤两次。在 Becton Dickinson 的 LSRFortessa 流式细胞仪上获取数据，并使用 DIVA 软件分析结果。用70%甲醇制备死细胞样品，作为对照。

结果与讨论

SLN 的合成和表征

核脂的无毒和自组装特性使其成为封装疏水性药物（如索拉非尼）的理想两亲性佐剂。在这项研究中，开发了一种简单的纳米沉淀程序来解决索拉非尼的低水溶性特性并增强其抗癌活性，这在许多情况下限制了其临床应用。关于水溶性，我们假设索拉非尼的疏水特性、杂环和氢键功能有利于与核脂的相互作用和纳米物体的形成。此外，预计载有索拉非尼的前哨淋巴结应通过增强索拉非尼的细胞摄取来增加抗肿瘤活性。事实上，在我们之前对顺铂纳米颗粒进行的一项研究中，我们证明顺铂抗肿瘤活性的增强是由于内化到癌细胞中的药物量增加 [23] [1]。我们的纳米沉淀过程包括三个步骤：(i) 在 40°C 下将索拉非尼溶解在乙醇中（10 毫克/毫升索拉非尼，100 微升）并添加一当量的核脂（阴离子核苷酸脂质，diC16-3 '-dT [胸苷 3'-(1,2-二棕榈酰基-sn -glycero-3-phosphate)] 或阳离子核苷脂质 DOTAU [23] [2',3'-dioleyl-5' -脱氧-5'-三甲基-铵-尿苷]，100 μL 10 mg/mL 乙醇溶液； (ii) 在室温下将 1 mL 乙醇溶液滴加到 10 mL 蒸馏水中； (iii) 蒸发所得悬浮液以除去过量的乙醇并超声处理。

色谱研究

为了评估新型制剂的载药能力，开发了一种反相 UHPLC 方法。使用这种 HPLC 方法，在 12 分钟内实现了索拉非尼和核脂的同时分离，允许对 SLN 中的化合物进行单独量化（附加文件 1：图 SI1-4）。

对于由索拉非尼/DOTAU (SLN ⁺ ) 和索拉非尼/diC16dT (SLN ⁻ ）， 分别。在不存在核脂的情况下进行的对照实验中，由于索拉非尼在水中的溶解度低，在制剂的不同步骤中损失了约 90% 的索拉非尼。该结果表明核脂是溶解索拉非尼和稳定前哨淋巴结所必需的。

物理化学研究

进行动态光散射 (DLS) 实验以表征 SLN 的形成。负核脂和正核脂（diC16dT 和 DOTAU）在水溶液中形成类似的非球形纳米颗粒，具有平行六面体形状，具有单分散性（多分散性指数，PDI =0.202 和 0.289；尺寸分别为 335.2 和 304.4 nm 和附加文件，图 2。 1：图 SI7)。正如预期的那样，基于 SLN 的物体的 zeta 电位取决于核脂极性头 (ζ 对于 SLN ⁺ =+ 59.1 和 − 54.9 mV 和 SLN ⁻ ，参见附加文件 1：图 SI10）。通过 TEM 成像验证了 NP 中索拉非尼的存在，并且通过 EDX 采集实现了 SLN-的 EDX 采集。图 2e、f 显示了 I 和 II 点。图 2f 中的点 I 显示出氯原子的发射（点 I，图 2e，f），表明存在索拉非尼（参见化学结构图 2f）。请注意，氯仅存在于点 I，而不存在于点 II（图 2f）。

SLNs 表征。透射电子显微镜 (TEM) 图像显示具有 DOTAU (a ) 和插图 (b ）。基于 DOTAU 的 SLN 的示例，其尺寸为 327 x 172 nm（箭头），这证实了由 DLS 测量的平均尺寸为 304 nm (d ）。 c 显示 diC16dT-SLN 的 TEM 图像示例（箭头分别为 330 x 500 nm）。 (e ) SLN-的 TEM 图像。 I &II 点是执行 EDX 采集的本地化。 (f ) I 和 II 位置的 EDX 光谱。虚线强调了氯原子的发射，它只存在于I中。还展示了索拉非尼分子的化学结构。两个光谱都用 8 keV 的 Cu 原子发射进行归一化（由于 TEM Cu 网格）

重要的是，在对照实验中，在没有核脂的情况下，索拉非尼的纳米沉淀没有产生任何纳米物体，这表明核脂有助于前哨淋巴结的形成和稳定。

稳定性研究

SLN ⁺ 的胶体稳定性 和 SLN ⁻ 由 DLS 和 zeta 电位在两个温度下测量（图 3a 和附加文件 1：图 SI10）。对于基于 diC16dT 的配方，SLN ⁻ 的大小 在 4°C 和 37°C 下 30 天后均未改性，表明这些纳米颗粒具有高稳定性（附加文件 1：图 SI9）。这种稳定性可以通过相互作用的性质来解释（涉及 H 键，π -π 堆积、电荷/电荷相互作用）发生在 diC16dT 和索拉非尼之间。然而，对于基于 DOTAU 的配方，SLN ⁺ 如 DLS 研究所揭示的，仅在 4°C 下稳定 30 天（图 3a），而在 37°C 时，观察到尺寸和 PDI 均增加（图 3a）。在 SLN ⁺ 的情况下，这种相对不稳定性在 37°C 下观察到 可以通过索拉非尼和 DOTAU 的正电荷之间发生的排斥库仑相互作用来解释。有趣的是，胶体稳定性研究表明可以调节稳定性，因此根据用于稳定 SLN 的核脂，可以调节索拉非尼从 SLN 向生理环境的递送。根据所需的释放动力学，稳定性调节可能具有吸引力。

SLN 的稳定性研究。 SLN ⁺ 的胶体稳定性 (a ) 以及索拉非尼和 DOTAU 在 SLN ⁺ 中的化学稳定性 4°C 和 37°C (b ）。 PDI，多分散指数

与胶体稳定性平行，使用新的色谱方法研究基于 SLN 的制剂中索拉非尼、DOTAU 和 diC16dT 的化学稳定性作为时间的函数在 4°C 和 37°C 下（参见附加文件 1：图 SI4）。两种温度下的动力学研究分别显示在图 3b 和附加文件 1：DOTAU-SLN 和 diC16dT-SLN 的 SI5 中。结果表明，制剂中的索拉非尼和 diC16dT 分子在至少 1 个月内保持稳定，表明在 SLN ⁻ 的情况下，在两种温度下都具有长期化学稳定性 .然而，在 SLN ⁺ 中观察到 DOTAU 在此期间下降 配方。首先，在 4°C 下，测量到的损失在 7 天内约为 12%，在 30 天内约为 20%。当温度升高时，DOTAU 稳定性下降，在 7 天后下降 55%，在 37°C 下 30 天后下降 95%。在之前的稳定性研究中已经证明了核脂之间化学稳定性的这种差异（参见附加文件 1：图 SI6）。

生物研究

SLN 细胞毒性通过细胞的代谢活动和形态进行评估。 MTT 测定允许在四种细胞系中比较游离索拉非尼（在 0.1% DMSO 中）和负载药物的 SLN（图 4），包括两种肝癌（HuH7 和 HepG2）和两种管腔乳腺癌（MDA-MB-134 和 T- 47D)。首先，在接近游离索拉非尼最大溶解度的浓度下（5 μM 索拉非尼在 0.1% DMSO 中，2.8 μM 索拉非尼/DOTAU 和 4 μM 索拉非尼/diC16dT 纳米颗粒），两种 SLN 比游离索拉非尼更好地抑制细胞活力。如图 4b 所示，对 MDA-MB-134 细胞进行的细胞活力研究表明，游离索拉非尼的活性受其水溶性限制（100% 的细胞活力在 [索拉非尼] =5 μM），而 IC50 值对于 SLN ⁺ 观察到 15 μM 和 50 μM 和 SLN ⁻ ，分别（图 4b）。在对 HuH7 进行的 FACS 研究中，获得了大约 50 μM 的 IC50（附加文件 1：图 SI12 和 SI13）。相差显微镜图像确实显示用 SLN ^- 处理的细胞层密度降低 和 SLN ⁺ 与未处理或索拉非尼处理的细胞相比，细胞形态没有改变（附加文件 1：图 SI11）。其次，在更高浓度的前哨淋巴结（[索拉非尼] =120 和 84 μM 的前哨淋巴结 ^- 和 SLN ⁺ ，分别）并与游离索拉非尼在其溶解度极限（5 μM 的浓度）下进行比较。在这些条件下，两种前哨淋巴结对四种癌细胞系都表现出强烈的细胞毒作用，如图 5 所示。如相差显微镜图像所示，两种前哨淋巴结均观察到细胞碎片 ^- （图 5C1-4）和 SLN ⁺ （图 5D1-4）证明细胞死亡，而在游离索拉非尼的情况下细胞保持存活（图 5B1-4）。值得注意的是，在管腔 B 乳腺癌细胞的情况下观察到两种 SLN 的强烈细胞毒性作用（图 5C1-2 和 D1-2）。这种以前没有报道过的抗肿瘤作用开启了索拉非尼在前哨淋巴结的新治疗应用。

索拉非尼或前哨淋巴结的细胞毒性作用。 一 ) 在 5 μM 游离索拉非尼和 2.8 μM NPs Sorafenib/DOTAU (SLN+) 的 3 个孔中使用 MTS 测定法定量后，在 4 个细胞系（2 个管腔 B 型乳腺癌和 2 个肝癌）中，比较游离索拉非尼或索拉非尼的 SLNs 的细胞毒性) 和 4 μM 的 NPs Sorafenib/diC16dT (SLN-)。 b ) 在游离索拉非尼（溶解度受限）、SLN+（灰色）或 SLN-（黑色）存在下的细胞活力测定（MDA-MB-134 细胞）

对照、游离索拉非尼或 SLN 之间细胞形态的比较。相差显微镜图像显示了在不同条件下对四种人类癌细胞系（肝癌、HuH7、HepG2 和管腔乳腺癌 MDA-MB-134、T-47D）的细胞毒性。 A) 在没有索拉非尼的情况下（对照实验，A1 –A4 分别用于 MDA-MB-134、T-47D、HuH7、HepG2、细胞系）。 B) 细胞在 5 μM 游离索拉非尼存在下孵育 4 天。 C 和 D) 在 SLN ⁻ 存在下培养的细胞 和 SLN ⁺ 分别在 84 μM 和 120 μM 的索拉非尼浓度下

结论

我们报告了一种基于核脂的新方法，允许有效封装和递送索拉非尼。我们的研究表明，形成了两种高度负载索拉非尼的固体脂质纳米颗粒 (SLN)。这些 SLN 显示负或正 zeta 电位值，具有平行六面体形状。正如 DLS 和 HPLC 研究所揭示的，SLN 的稳定性可以根据所使用的核脂进行调节。重要的是，两个 SLN ⁺ 和 SLN ⁻ 制剂能够显着提高索拉非尼的水溶性（浓度高于 120 μM）。与游离索拉非尼相比，此类 SLN 对四种癌细胞系（肝癌和乳腺癌）表现出更好的抗肿瘤活性，后者由于缺乏水溶性而受到限制。在四种癌细胞系上记录的对比显微图像显示，当与 120 μM 的 SLN ⁻ 一起孵育时，细胞死亡率急剧上升 或 84 μM SLN ⁺ .因此，该药物可用作肝癌（例如，在动脉内化疗中使用索拉非尼）或乳腺癌的新治疗选择。据我们所知，本报告是第一个使用索拉非尼治疗管腔 B 型乳腺癌的研究实例，证明了 SLN 方法的有效性。总而言之，该贡献中报告的结果突出了基于核苷-脂质的前哨淋巴结作为药物递送系统的潜力。

缩写

AFNH4：

甲酸铵

DLS：

动态光散射

FA：

甲酸

HCC：

肝细胞癌

HPLC：

高效液相色谱

逻辑节点：

脂质纳米粒

甲醇：

甲醇

PDI：

多分散指数

RCC：

肾细胞癌

SLN：

固体脂质纳米粒

UHPLC：

超高效液相色谱