131I 追踪的 PLGA-脂质纳米颗粒作为靶向化疗治疗黑色素瘤的药物递送载体
摘要
在此，叶酸 (FA) 共轭聚 (d,l-丙交酯-共-乙交酯) (PLGA)-脂质复合物 (FA-PL) 被开发为纳米载体，用于靶向递送不溶性抗癌药物紫杉醇 (PTX)，得到的 FA-PLP 纳米颗粒。此外， 131 I作为放射性示踪剂，用于标记FA-PLP纳米颗粒（FA-PLP- 131 I) 评估它们的细胞摄取活性、体内血液循环和生物分布。 FA-PLP- 131 I 纳米粒子具有稳定性高的球形形态、窄的尺寸分布（165.6 和 181.2 nm），平均 zeta 电位为 -22.1 mV。共聚焦激光扫描显微镜表明靶向分子FA促进PLP- 131 I 被黑色素瘤 B16F10 细胞摄取，通过 131 的细胞掺入率进一步证实了这一点 I 活动检测由伽马计数器测量。 FA-PLP- 131 我没有 PTX (FA-PL- 131 I) 显示出较小的细胞毒性，良好的生物相容性，而 FA-PLP- 131 与游离 PTX 和 PLP- 131 相比，我被证明具有有效的细胞活力抑制 I. 静脉注射后游离 PTX 的血液循环半衰期 (t 1/2 =5.4 ± 0.23 小时）通过 FA-PLP- 131 延长至 18.5 ± 0.5 小时 一、通过FA靶向，肿瘤摄取FA-PLP- 131 与 PLP- 131 相比，我大约高出 4.41 和 12.8 倍 我和免费 PTX- 131 我分别。此外，在治疗 40 天后，FA-PLP- 131 与游离 PTX 和 PLP- 131 相比，I 显示出更好的肿瘤抑制作用 I，无复发，无显着的全身性体内毒性。结果表明， 131 I标记的PLGA-脂质纳米颗粒可同时应用于靶向给药和体内药物的可靠追踪。
背景
最具侵袭性的皮肤癌之一，黑色素瘤，起源于黑色素细胞的恶性转化 [1, 2]。鉴于其容易复发和转移的可能性高，转移性黑色素瘤患者的 5 年生存率仅为 10%。迄今为止，黑色素瘤患者最常用的治疗方法是化疗，但化疗伴随着不良的严重副作用、生物利用度低、肿瘤选择性差和剂量限制性全身毒性，对肿瘤化疗提出了重大挑战[3, 4]。
紫杉醇 (PTX) 是一种天然植物提取物，来自红豆杉属（一种针叶树 [5, 6]）的干燥根、枝、叶和树皮，对多种肿瘤显示出有效的抗肿瘤活性，包括卵巢癌和肺癌癌症 [7,8,9]。此外，据报道，PTX 还可有效对抗人类黑色素瘤 [10, 11]。然而，除了化疗药物的上述缺点外，Cremophor EL 和无水酒精 (1:1, v /v ) 混合物在当前的临床实践中用作 PTX 的稀释介质，这可能会导致严重的副作用，包括超敏反应 [12, 13]。因此，开发新策略以提高化学治疗剂的水溶性和肿瘤积累以减少其外周暴露并最大限度地减少其体内毒性至关重要。生物相容性药物纳米载体的最新发展提供了增强 PTX 生理稳定性的潜力 [14,15,16]。此外，靶分子与这些纳米载体的结合将允许通过肿瘤细胞表面受体介导的靶向作用将化疗药物选择性递送至肿瘤部位，同时减少外周暴露[17,18,19]。
在此，我们制备了一种聚（d，l-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA）-脂质复合物，该复合物与叶酸（FA：一种肿瘤靶向分子）共价结合，并将 PTX 封装为用于治疗黑色素瘤的化疗药物。此外， 131 I，一种放射性标记，用于放射性标记 PLGA 脂质纳米颗粒，以清楚地评估它们的体内行为。由于其负 β 发射、物理半衰期和广泛的衰变特性， 131 I 在临床上通常用作放射性标记 [20,21,22]。 131 的形貌、稳定性和分散性 I 标记的 PLGA 脂质纳米粒子 (FA-PLP- 131 I) 在体外进行了评估。此外，FA-PLP- 131 的细胞摄取、血液循环和生物分布 我通过测量 131 的放射性进行了调查 I. 此外，FA-PLP- 131 的靶向抗癌功效 我在体外和体内进行了研究。结果表明 FA-PLP- 131 我可能是一个多功能的纳米平台，可用作化疗药物的潜在肿瘤药物递送纳米载体。
方法
材料
聚（d,l-丙交酯-共-乙交酯）（PLGA，MW：5000–15,000，丙交酯：乙交酯（50:50））和氯胺-T 购自 Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。钠 131 我是从 Atomic Hitech（中国北京）获得的。 PTX (99%) 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 购自阿拉丁化学试剂有限公司（中国上海）。由 90–95% 磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N 组成的大豆卵磷脂 -[叶酸（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000-FA）和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N -[羧基（聚乙二醇）-2000]（DSPE-PEG2000-COOH）从Avanti（Alabaster，AL，USA）获得。所有细胞培养试剂均购自Sigma Aldrich。
FA-PLP 纳米颗粒的制备
FA-PLP 纳米粒子是通过自组装纳米沉淀法合成的 [23]。具体而言，将 10 毫克 PTX 溶解在 1 毫升乙醇中，并将 2 毫克 PLGA 溶解在 1 毫升二氯甲烷中。将它们混合后，将卵磷脂/DSPE-PEG2000-FA (4:1) 乙醇水溶液 (4wt%) 逐滴加入混合物溶液中，在 25°C 温和搅拌 4 小时。将混合物过滤并使用Millipore超滤离心管用去离子水洗涤3次以去除未包封的药物和有机溶剂。作为对照，没有 FA 分子接枝的纳米颗粒通过相同的方法制备，用 DSPE-PEG2000-COOH 代替 DSPE-PEG2000-FA。纯化后的 FA-PLP 纳米颗粒在 4°C 下储存直至进一步使用。
131 的准备 I-标记的 FA-PLP 纳米颗粒
放射性 FA-PLP (FA-PLP- 131 I) 通过氯胺-T 氧化法制备纳米颗粒 [24]。 1 mL FA-PLP (1 mg/mL)、500 μCi Na 131 的混合物 I（可以接枝到 FA-PLP 上的最大放射性）和 100 μL 5 mg/mL 氯胺-T 在室温下在 pH 7.5 磷酸盐缓冲液中反应 10 分钟。然后通过添加 200 μL 焦亚硫酸钠 (5 mg/mL) 淬灭反应。 131 按照相同的程序制备 I 标记的 PLP 和 PTX。使用离心管 (Millipore) 纯化它们以去除剩余的游离 Na 131 直到在滤液中检测不到伽马活性。使用γ计数器（LKB gamma 1261；LKB Instruments）分析标记纳米颗粒的放射性标记产率和纯度。
特征化
使用紫外-可见分光光度计（UV7502，上海先进光电技术有限公司，中国上海）记录紫外-可见吸收光谱。在蔡司 LIBRA 120 TEM 上收集透射电子显微镜 (TEM) 图像。使用 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments) 通过动态光散射 (DLS) 分析检测纳米颗粒的尺寸、zeta 电位和多分散指数 (PDI)。光学照片使用尼康D3200数码相机拍摄。
细胞培养
小鼠黑色素瘤细胞系 B16F10 获自中国科学院典型培养物保藏中心细胞库（中国上海），并在含有 10% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素/链霉素的 DMEM 中培养37°C 时 5% 的 CO2 气氛。
体外掺入分析
进行时间依赖性体外掺入试验以确定 131 的最佳细胞结合效率时间 I-标记的化合物[25]。 B16F10细胞以1 × 10 5 接种于24孔板中 每孔细胞并培养至汇合。放射性碘样品 ( 131 我，PL- 131 我，FA-PL- 131 我，PLP- 131 我，FA-PLP- 131 I) 在 DMEM 培养基中制备并分别添加到细胞培养孔中。孵育 0.5、1、2、4 和 6 小时后，将细胞用 PBS 洗涤 3 次，并用伽马计数器（中国科学技术研究院，嘉科创新有限公司）测量其放射性。掺入值 (%) 的计算方法如先前文献 [25] 中所述。此外，纳米粒子用荧光染料异硫氰酸荧光素（FITC，Sigma）标记，然后与 B16F10 细胞一起孵育。使用商用共聚焦激光扫描显微镜（FV1200，Olympus，Tokyo，Japan）捕获细胞的荧光图像。
体外细胞毒性试验
MTT细胞活力测定法研究PL- 131 的细胞毒性 我和 FA-PL- 131 I，以及免费 PTX，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 I，针对 B16F10 细胞。简而言之，将 B16F10 细胞接种在 96 孔板中 24 小时并暴露于 PL- 131 我和 FA-PL- 131 I（含 0–100 μg/mL PLGA-脂质）或游离 PTX，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 I（以 0–40 μg/mL 的各种浓度）持续 24 小时。该实验一式三份进行。所有数据均表示为平均值 ± SD。
动物模型
3 至 5 周龄的 Balb/c 小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司（中国上海）。所有动物实验均经复旦大学动物护理与使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南。
B16F10 细胞 (1 × 10 6 ) 中的 PBS 被皮下注射到小鼠的右侧。用卡尺测量生长的肿瘤体积，用公式计算肿瘤体积：体积=（长×宽 2 )/2。当肿瘤体积达到约 80 mm 3 ，将小鼠随机分为实验组。
血液循环和生物分布研究
健康的 Balb/c 小鼠静脉注射 PTX- 131 我和 FA-PLP- 131 I（每只小鼠 100 μL 10 μCi，5 mg/kg）。通过从小鼠尾部抽取大约 10 μL 的血液来测量血液循环。使用伽马计数器测量血液中的放射性。为了检测纳米颗粒的生物分布，给携带 B16F10 肿瘤的小鼠注射 PTX- 131 我，FA-PL- 131 我，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 I 在相同剂量下注射后 24 小时处死。称取主要器官进行γ计数。
体内肿瘤化疗
携带 B16F10 肿瘤的 Balb/c 小鼠注射了 150 μL 盐水、游离 PTX、PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 I（在相同的 PTX 浓度下，5 mg/kg）。每 4 天用卡尺测量肿瘤大小和体重。相对肿瘤体积计算为 V /V 0 (V 0 是治疗开始时的肿瘤体积）。治疗约40天后，处死小鼠取主要器官，4%福尔马林固定，石蜡包埋切片，苏木精伊红染色，数码显微镜下观察。
结果与讨论
131 的制备和表征 I-标记的 FA-PLP 纳米颗粒
FA-PLP- 131 的合成方案 I 纳米粒子如图 1 所示。简而言之，FA-PLP 纳米粒子是通过自组装纳米沉淀法和放射性 FA-PLP (FA-PLP- 131 I) 使用氯胺-T 氧化法制备 [23, 24]。 PTX 被 PLGA-脂质复合物包裹，然后通过聚乙二醇化在壳表面接枝共价结合的 FA。最后， 131 我被嫁接到外部纳米颗粒表面。 TEM 图像表明 FA-PLP- 131 I 纳米颗粒具有窄尺寸分布（165.6 至 181.2 nm）的球形形态，这通过动态光散射得到证实（图 2a、b）。 zeta 电位范围从 -39.1 到 -3.2 mV（图 2c）。游离PTX和FA-PLP- 131 的紫外可见光谱 I（具有相同浓度的 PTX）在 233 nm 处显示相同的特征峰（图 2d），表明 PTX 已被封装在 FA-PLP- 131 I 和该封装不影响 PTX 的吸光度强度。经计算，PTX在FA-PLP中的包封率- 131 我被证明是 56.35 ± 1.6%。 PTX- 131 的放射性标记产率 我，PL- 131 我，FA-PL- 131 我，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 我分别是 45.6 ± 2.3、52.1 ± 4.1、48.9 ± 1.9、56.3 ± 2.5和54.8 ± 2.7。
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FA-PLP- 131 的合成 I纳米颗粒
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一 FA-PLP- 131 的TEM图像 一、b 粒径和c FA-PLP- 131 的zeta电位 我通过动态光散射分析。 d 游离PTX和FA-PLP- 131 的吸收光谱 我
稳定性对于纳米粒子的生物医学应用至关重要 [26]。储存 4 周后，FA-PLP- 131 我溶解在水、细胞培养基、胎牛血清和 PBS 中，平均大小、zeta 电位、PDI 指数没有变化（图 3a-c），表明稳定性和分散性很好。此外，FA-PLP- 131 的放射性标记稳定性 我在 37 °C 的小鼠血浆中被检测到（图 3d），显示 7 天内的脱碘率低于 15%。
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一 , b 胶体稳定性和c FA-PLP- 131 的PDI测试 I 在不同的培养基中，包括水、DMEM、PBS 和胎牛血清 (FBS)。 d FA-PLP- 131 放射性标记稳定性曲线 I 在 37°C 下储存 2 周内的小鼠血浆
体外细胞摄取
图 4 显示了 131 的体外时间依赖性掺入 我，PL- 131 我，FA-PL- 131 我，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 B16F10 细胞中的 I 由伽马计数器测量。 FA-PLP- 131 我，还有 FA-PL- 131 I，显示出比所有测试时间点更高的掺入值，随时间增加。 FA-PLP- 131 的掺入值 6 小时时的 I 是 131 的 3.12 倍和 23.4 倍 我和 PLP- 131 I, 与异硫氰酸荧光素标记的 FA-PLP- 131 孵育 B16F10 细胞的共聚焦激光扫描显微镜图像结果一致 我和 PLP- 131 I 纳米粒子（附加文件 1：图 S1）。这些结果证明了 FA-PLP- 131 的高细胞摄取 I, 可能是由于 FA 介导的对 B16F10 细胞的靶向作用。
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131 的时间依赖性掺入 我，PL- 131 我，FA-PL- 131 我，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 I 在 B16F10 细胞上
体外细胞毒性
对照纳米载体PL- 131 的细胞毒性 我和 FA-PL- 131 我通过 MTT 检测进行了测试。用 PL- 131 处理的细胞 我和 FA-PL- 131 24 小时的 I 具有与对照相似的活力（图 5a），表明具有良好的生物相容性。此外，FA-PLP- 131 我在抑制 B16F10 细胞增殖方面比游离 PTX 和 PLP- 131 更有效 I 使用相同浓度的 PTX（图 5b），表明出色的细胞靶向化疗。结果表明，FA-PLP- 131 I具有高化疗作用，无放射毒性和细胞毒性。
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一 PL- 131 处理后B16F10细胞的细胞活力 我和 FA-PL- 131 我 24 小时。 b B16F10 细胞与不同浓度的游离 PTX、PLP- 131 孵育后的细胞活力 我和 FA-PLP- 131 我 24 小时
血液循环和生物分布研究
据报道，放射性标记比荧光成像更可靠，可用于纳米粒子的定量和准确的体内跟踪 [27, 28]。 131 制备 I 标记的 FA-PLP 纳米粒子以研究它们的体内行为，包括血液循环和生物分布，如通过伽马计数器测量的。游离 PTX 的血液循环半衰期 (t 1/2 =5.4 ± 0.23 小时）通过 FA-PLP- 131 延长至 18.5 ± 0.5 小时 I（图 6a）由于纳米颗粒封装，这有利于肿瘤靶向积累 [29,30,31]。接下来，游离PTX- 131 的生物分布 我，PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 研究了注射后 1 天 B16F10 荷瘤小鼠中的 I（图 6b）。 FA-PLP- 131 我，还有 FA-PL- 131 I, 表现出明显的肿瘤摄取增强，分别是 PLP- 131 的 4.41 倍和 12.8 倍 我和免费 PTX- 131 I 分别可能是由于 FA-PLP- 131 的血液循环时间延长 我，FA-PL- 131 I，以及它的 FA 靶向效应。此外，肝脏和脾脏由于其纳米颗粒代谢也表现出相对较高的吸收，它们是正常的代谢器官[32, 33]。
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一 FA-PLP- 131 的血液循环曲线 我静脉注射后。 b PTX- 131 的生物分布 我，FA-PL- 131 我，FA-PLP- 131 我和 PLP- 131 B16F10荷瘤小鼠中的I
体内肿瘤化疗
免费 PTX-、PLP- 131 I- 和 FA-PLP- 131 与盐水对照组相比，I 处理的小鼠表现出对肿瘤生长的抑制（图 7a）。总体而言，FA-PLP- 131 在大约 40 天的治疗后，与所有治疗组相比，我在抑制肿瘤生长方面最有效，没有复发。考虑到 FA-PLP- 131 的血液循环显着延长，这些结果符合预期 I 以及它促进 FA 介导的肿瘤靶向积累的能力。此外，靶向肿瘤的积累还导致 PTX 外周暴露的减少，从而最大限度地减少全身毒性。正如预期的那样，在整个治疗过程中，体重没有明显下降（图 7b），并且任何组的主要器官，包括心、肝、脾、肺和肾，均未显示明显的组织学病变（图 7b）。图 7c).
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一 相对肿瘤体积和b 荷瘤小鼠尾静脉注射生理盐水后体重（对照）、游离PTX、PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 一、b 荷瘤小鼠尾静脉注射生理盐水后体重（对照）、游离PTX、PLP- 131 我和 FA-PLP- 131 一、c 包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的主要器官的代表性苏木精和伊红染色图像。 比例尺 =100 μm
结论
综上，我们综合了 131 I 标记的 PLGA 脂质纳米粒子作为黑色素瘤靶向化疗的药物递送载体。通过测量 131 的放射性 I, FA-PLP- 131 的体外和体内行为 研究了纳米颗粒。得到的FA-PLP- 131 我表现出很好的分散性以及胶体和放射性标记的稳定性。对照纳米载体，PL- 131 我和 FA-PL- 131 我还表现出良好的生物相容性。封装 PTX 后，FA-PLP- 131 I 在抑制 B16F10 细胞增殖方面最有效，没有细胞毒性，这归因于 FA 靶向效应。此外，FA-PLP- 131 我被证明可以显着延长 PTX 的血液循环并有效地在目标肿瘤区域内积聚。因此，FA-PLP- 131 我有极好的肿瘤生长抑制作用和很好的体内生物相容性。结果突出了这些多功能 FA-PLP- 131 的潜力 I纳米载体作为可靠的药物追踪剂及其在肿瘤靶向治疗中的应用。
纳米材料