¹³¹I标记FA修饰PLGA-脂质纳米颗粒实现黑色素瘤靶向紫杉醇递送与成像

摘要

本研究开发叶酸（FA）偶联聚(D,L-乳酸-共-乙酸)（PLGA）-脂质复合材料（FA-PL）作为纳米载体，实现难溶抗癌药紫杉醇（PTX）的靶向递送，形成FA-PLP纳米颗粒。进一步利用放射性示踪剂¹³¹I标记FA-PLP纳米颗粒（FA-PLP-¹³¹I），评估细胞摄取、体内血液循环和生物分布。FA-PLP-¹³¹I呈球形、稳定性好、粒径分布窄（165.6-181.2 nm）、平均Zeta电位-22.1 mV。共聚焦激光扫描显微镜显示靶向分子FA促进PLP-¹³¹I被黑色素瘤B16F10细胞摄取，γ计数器测定¹³¹I活性的细胞内摄率进一步确认。无药物FA-PL-¹³¹I低细胞毒性、生物相容性好；FA-PLP-¹³¹I抑制细胞活性效果优于游离PTX和PLP-¹³¹I。静脉注射后，游离PTX血液循环半衰期（t₁/₂=5.4±0.23 h）被FA-PLP-¹³¹I延长至18.5±0.5 h。FA靶向使FA-PLP-¹³¹I肿瘤摄取分别比PLP-¹³¹I和游离PTX-¹³¹I高约4.41倍和12.8倍。40天治疗后，FA-PLP-¹³¹I抑瘤效果优于游离PTX和PLP-¹³¹I，无复发、无显著全身毒性。结果表明¹³¹I标记PLGA-脂质纳米颗粒可同时用于靶向给药和体内药物可靠追踪。

研究背景

黑色素瘤源于黑色素细胞恶性转化，极易复发转移，转移性患者5年生存率仅10%。化疗是主流治疗，但伴随严重副作用、低生物利用度、差肿瘤选择性、剂量限制性全身毒性。紫杉醇（PTX）源于红豆杉属植物干根枝叶树皮，对卵巢癌、肺癌等多肿瘤有效，也对人类黑色素瘤有效。但临床用Cremophor EL和脱水乙醇（1:1）作PTX稀释剂，可致严重过敏反应。开发新策略增强化疗药水溶性和肿瘤富集、降低外周暴露和体内毒性至关关键。生物相容药物纳米载体近年发展为增强PTX生理稳定性提供潜力。靶向分子偶联纳米载体可通过肿瘤细胞表面受体介导靶向效应，选择性递送药物至肿瘤部位、减少外周暴露。

本文制备共价偶联叶酸（FA：肿瘤靶向分子）并封装PTX的PLGA-脂质复合纳米载体治疗黑色素瘤。利用¹³¹I放射性标记PLGA-脂质纳米颗粒以清晰评估体内行为。¹³¹I因β⁻衰变、物理半衰期、衰变特性广泛用作临床放射性标记。评估了¹³¹I标记PLGA-脂质纳米颗粒（FA-PLP-¹³¹I）的形貌、稳定性、分散性。测量¹³¹I放射性研究FA-PLP-¹³¹I细胞摄取、血液循环、生物分布。体外体内研究靶向抗癌疗效。结果表明FA-PLP-¹³¹I可作为化疗药物靶向递送纳米载体的多功能纳米平台。

实验方法

材料

PLGA（MW: 5000-15,000，乳酸:乙酸=50:50）和氯胺T购自Sigma Aldrich（美国圣路易斯）。Na¹³¹I购自原子高科（中国北京）。PTX（99%）和DAPI购自阿拉丁（中国上海）。大豆卵磷脂（90-95%磷脂酰胆碱）、DSPE-PEG₂₀₀₀-FA、DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH购自Avanti（美国阿拉巴马）。细胞培养试剂购自Sigma Aldrich。

FA-PLP纳米颗粒制备

自组装纳米沉淀法合成FA-PLP纳米颗粒。10 mg PTX溶于1 mL乙醇，2 mg PLGA溶于1 mL二氯甲烷。混合后，卵磷脂/DSPE-PEG₂₀₀₀-FA（4:1）乙醇水溶液（4 wt%）滴加至混合液，25°C温和搅拌4 h。超滤离心管（Millipore）用去离子水过滤洗涤3次除去未包裹药物和有机溶剂。对照组用DSPE-PEG₂₀₀₀-COOH替代DSPE-PEG₂₀₀₀-FA同法制备无FA纳米颗粒。纯化FA-PLP纳米颗粒4°C保存。

¹³¹I标记FA-PLP纳米颗粒制备

氯胺T氧化法制备放射性FA-PLP（FA-PLP-¹³¹I）。1 mL FA-PLP（1 mg/mL）、500 µCi Na¹³¹I（可接枝最大放射性）、100 µL 5 mg/mL氯胺T在pH 7.5磷酸缓冲液中室温反应10 min。200 µL 5 mg/mL亚硫酸钠终止反应。同法制备¹³¹I标记PLP和PTX。超滤离心管纯化除去游离Na¹³¹I直至滤液无γ活性。γ计数器（LKB gamma 1261）分析放射性标记产率和纯度。

表征

UV-Vis吸收光谱（UV7502，上海先进光电）。透射电镜（Zeiss LIBRA 120）。动态光散射（Zetasizer Nano ZS，Malvern）测粒径、Zeta电位、分散指数（PDI）。尼康D3200数码相机拍摄光学照片。

细胞培养

小鼠黑色素瘤细胞系B16F10购自中国科学院上海细胞库。DMEM含10% FBS、100 U/mL青霉素/链霉素，5% CO₂、37°C、饱和湿度培养。

体外摄取实验

时间依赖性体外摄取实验确定¹³¹I标记化合物最佳细胞结合效率时间点。B16F10细胞24孔板播种1×10⁵/孔培养至汇合。DMEM配制放射性样品（¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I）分别加入孔中。孵育0.5、1、2、4、6 h后PBS洗涤3次，γ计数器测放射性。摄取率（%）按文献计算。另以荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记纳米颗粒孵育B16F10，共聚焦激光扫描显微镜（FV1200，奥林巴斯）拍摄荧光图像。

体外细胞毒性实验

MTT法研究对照纳米载体PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I及游离PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I对B16F10细胞毒性。96孔板铺细胞24 h后暴露于PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I（0-100 µg/mL PLGA-脂质）或游离PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I（0-40 µg/mL PTX浓度）24 h。三重复孔，数据为均值±SD。

动物模型

3-5周龄Balb/c小鼠购自上海斯莱克实验动物。所有动物实验经复旦大学动物护理使用委员会批准，符合NIH实验动物护理使用指南。B16F10细胞（1×10⁶）PBS悬液皮下注射小鼠右侧腹。游标卡尺测肿瘤体积，公式：体积=(长×宽²)/2。肿瘤达~80 mm³时随机分组。

血液循环与生物分布研究

健康Balb/c小鼠尾静脉注射PTX-¹³¹I和FA-PLP-¹³¹I（100 µL，10 µCi/只，5 mg/kg）。尾尖取血~10 µL，γ计数器测血液放射性。肿瘤负荷小鼠注射PTX-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I同剂量，24 h后处死，主要器官称重γ计数。

体内肿瘤化疗

B16F10肿瘤小鼠尾静脉注射150 µL生理盐水、游离PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I（同PTX浓度5 mg/kg）。每4天游标卡尺测肿瘤大小和体重。相对肿瘤体积计算为V/V₀（V₀为治疗起始时肿瘤体积）。约40天治疗后处死小鼠，主要器官取出，4%福尔马林固定、石蜡包埋切片，HE染色，数码显微镜观察。

结果与讨论

¹³¹I标记FA-PLP纳米颗粒制备与表征

FA-PLP-¹³¹I合成路线图（图1）：自组装纳米沉淀法制备FA-PLP，氯胺T氧化法制备放射性FA-PLP-¹³¹I。PTX被PLGA-脂质复合物包裹，表面经PEGylation共价接枝FA，最后¹³¹I接枝于纳米颗粒外表面。TEM显示FA-PLP-¹³¹I球形、粒径分布窄（165.6-181.2 nm），DLS确认（图2a,b）。Zeta电位-39.1至-3.2 mV（图2c）。游离PTX和FA-PLP-¹³¹I（同PTX浓度）UV-Vis谱均显示233 nm特征峰（图2d），证实PTX成功包裹且包裹不影响吸收强度。计算PTX在FA-PLP-¹³¹I中包封率56.35±1.6%。PTX-¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I放射性标记产率分别为45.6±2.3、52.1±4.1、48.9±1.9、56.3±2.5、54.8±2.7。

稳定性对生物医学应用至关重要。4周贮存后，FA-PLP-¹³¹I在水、细胞培养基、胎牛血清、PBS中平均粒径、Zeta电位、PDI无变化（图3a-c），显示优异胶体稳定性和分散性。小鼠血浆37°C中放射性标记稳定性（图3d）：7天内脱碘<15%。

体外细胞摄取

图4显示γ计数器测定¹³¹I、PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I在B16F10细胞中时间依赖性摄取。FA-PLP-¹³¹I和FA-PL-¹³¹I所有时间点摄取值均最高，随时间增加。6 h时FA-PLP-¹³¹I摄取值比¹³¹I和PLP-¹³¹I高3.12倍和23.4倍，与FITC标记纳米颗粒共聚焦图像一致（附件图S1）。证明FA-PLP-¹³¹I高细胞摄取，归因于FA介导的B16F10细胞靶向效应。

体外细胞毒性

MTT法测对照纳米载体PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I细胞毒性。24 h处理后细胞活力与对照相近（图5a），表明良好生物相容性。同PTX浓度下FA-PLP-¹³¹I抑制B16F10增殖效果显著优于游离PTX和PLP-¹³¹I（图5b），显示卓越细胞靶向化疗效果。结果表明FA-PLP-¹³¹I具高化疗效果、无放射毒性和细胞毒性。

血液循环与生物分布研究

放射性标记被报道比荧光成像更可靠地定量准确追踪纳米颗粒体内行为。制备¹³¹I标记FA-PLP纳米颗粒研究体内行为：血液循环、生物分布（γ计数器测定）。游离PTX血液半衰期（t₁/₂=5.4±0.23 h）经FA-PLP-¹³¹I封装延长至18.5±0.5 h（图6a），有利肿瘤靶向富集。肿瘤负荷小鼠注射后1天生物分布（图6b）：FA-PLP-¹³¹I和FA-PL-¹³¹I肿瘤摄取显著增强，分别为PLP-¹³¹I和游离PTX-¹³¹I的4.41倍和12.8倍，归因于FA-PLP-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I延长血液循环和FA靶向效应。肝脾因纳米颗粒代谢也显示较高摄取，属正常代谢器官。

体内肿瘤化疗

游离PTX、PLP-¹³¹I、FA-PLP-¹³¹I处理组较生理盐水对照均抑制肿瘤生长（图7a）。约40天治疗后，FA-PLP-¹³¹I抑制肿瘤生长最有效，无复发。预期结果：FA-PLP-¹³¹I显著延长PTX血液循环，促进FA介导肿瘤靶向富集。肿瘤靶向富集也减少PTX外周暴露，降低全身毒性。整个治疗过程无明显体重下降（图7b），所有组别主要器官（心、肝、脾、肺、肾）HE染色无明显组织学病变（图7c）。

结论

总结：我们合成¹³¹I标记PLGA-脂质纳米颗粒作为黑色素瘤靶向化疗药物递送载体。通过测量¹³¹I放射性，研究FA-PLP-¹³¹I纳米颗粒体外体内行为。所得FA-PLP-¹³¹I分散性好、胶体和放射性标记稳定性优。对照纳米载体PL-¹³¹I、FA-PL-¹³¹I生物相容性好。封装PTX后FA-PLP-¹³¹I靶向效应下最有效抑制B16F10增殖、无细胞毒性。FA-PLP-¹³¹I显著延长PTX血液循环、有效在靶向肿瘤区富集。因此FA-PLP-¹³¹I具优异抑瘤效果和体内生物相容性。结果突显多功能FA-PLP-¹³¹I纳米载体作为可靠药物追踪剂及肿瘤靶向治疗应用的广阔前景。