负载rhBMP-2的丝素蛋白支架改善骨诱导性以用于骨组织工程

摘要

生物医学应用中对丝素蛋白（SF）支架制剂的需求日益增加。研究者通过戊二醛交联丝素蛋白与不同比例的骨诱导性重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2），制备了三种溶液：(i) 3% SF无rhBMP-2 (SF)，(ii) 3% SF与等量rhBMP-2 (SF+rhBMP-2)，(iii) 12% SF与3% rhBMP-2 (4SF+rhBMP-2)。利用电纺丝技术制备纳米支架，评估rhBMP-2对SF支架骨诱导潜力的增强效果。应力-应变关系显示，rhBMP-2的添加不降低纤维机械强度，且随SF浓度增加支架机械强度提高。溶胀研究表明rhBMP-2结合增加了支架的水分保持能力。人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在偶联支架上存活率更高，支架对细胞无细胞毒性。体外和体内实验均显示，偶联支架中细胞碱性磷酸酶（ALP）活性显著升高，证实了新型构建体增强的骨诱导性。支架亦被证明对体内成骨有效。

研究背景

骨组织具备自我修复小骨折的能力，经历成骨、愈合及重塑原有形态的过程。但这种再生能力有限，临床常需自体移植或异体移植治疗。异体移植易引发免疫排斥；自体移植虽无免疫问题，但受限于可用骨量。组织工程被视为克服这一局限的潜在技术，通过在预制支架上培养人间充质干细胞或成骨肉瘤细胞（MG63），构建细胞-支架系统作为移植物。支架需提供细胞锚定和生化微环境，选材时需考虑机械强度、骨诱导性、生物吸收、梯度孔隙率及生物相容性。骨诱导性是骨组织工程（BTE）支架材料的关键属性。含骨生成因子的支架能模拟骨再生中血管生成与成骨耦合的过程，募集祖细胞并诱导分化。骨形态发生蛋白（BMPs）作为诱导成骨的生长因子类，与去矿骨基质（DBM）和磷酸钙一同被提议用于BTE。

金属、陶瓷、合成聚合物、复合材料及丝素蛋白均被报道为BTE支架制备的潜在材料。丝素蛋白因其优异的力学性能和生物相容性，被认为适合组织工程支架制备。迄今尚无报道评估BMPs与SF电纺纳米支架结合的协同效益。本研究制备了新型重组人骨形态发生蛋白-2（rhBMP-2）偶联SF电纺纳米纤维支架，并与纯SF支架对比，阐明rhBMP-2偶联对骨诱导的影响，同时测定细胞活力与增殖性能，确立其在骨组织工程中的应用潜力。

材料与方法

SF/BMP-2水溶液制备

首先按成熟方案分离家蚕茧丝素蛋白水溶液。茧在0.02 M Na₂CO₃中煮沸20 min去丝胶和蜡，提取的丝素蛋白在60 °C下用9 M溴化锂溶解4 h，透析4天浓缩至7% w/v。再通过25% PEG-10000透析浓缩至不同浓度，稀释制备不同浓度SF水溶液，10 °C保存。冻干rhBMP-2粉末溶于pH 3.8 PBS，经0.22 μm滤器灭菌后加入各SF溶液并持续搅拌。采用戊二醛交联结合BMP与丝素蛋白：10 mL反应体系中，6%丝素蛋白与1% rhBMP-2各5 mL，加200 μL戊二醛和40 μL 12 N HCl交联。制得三组溶液：(i) 3% SF无rhBMP-2 (SF)；(ii) 3% SF含0.5% rhBMP-2 (SF+rhBMP-2)；(iii) 12% SF含0.125% rhBMP-2 (4SF+rhBMP-2)。供电纺丝制备支架使用。

电纺丝制备支架

各溶液装入5 mL玻璃注射器，接25G不锈钢针头（内径0.26 mm），连接5.5 kV直流电源。注射泵控制流速0.4 mL/h，距离针尖15 cm处铝箔收集纤维，每组收集4 h。

扫描电镜观察

Zeiss EVO40 SEM观察支架形貌，样品喷金后成像。随机测量10根纤维直径取平均值。

支架力学性能测试

Instron 3345单柱台式电子万能试验机进行压缩实验。电纺更长时间获得0.2 mm直径纤维，在25 °C、50%湿度下测定应力-应变曲线的拉伸强度和断裂伸长率。

溶胀研究

各配方溶于pH 7.4 PBS（37 °C），定时取出称干重至平衡。溶胀率 = (Wₛ - W₀)/W₀ × 100%，W₀为初始干重，Wₛ为各时间点溶胀重。

细胞培养

人骨髓间充质干细胞（hMSCs）用含10%胎牛血清、1%青霉素的DMEM培养，37 °C、5% CO₂饱和湿度至90%汇合度。消化离心后重悬计数。支架经乙醇洗涤、紫外照射30 min、PBS洗涤后，用DMEM预处理。每支架滴加20 μL细胞悬液，塑料薄膜作对照。37 °C、5% CO₂静置30 min后，置入DMEM培养21天，隔天换液。

细胞粘附实验

播种后1、3、6 h收集培养基，血球计数板计数未贴壁细胞。粘附率 = (初始播种数 - 未贴壁细胞数)/初始播种数 × 100%。

细胞毒性实验

MTT法检测纳米纤维基质毒性。各时间点加入MTT溶液（1 mg/mL stock按1:10稀于PBS）孵育4 h，活细胞将MTT转化为甲臜盐，加DMSO溶解20 min，酶标仪570 nm测吸光度。

细胞增殖实验

Alamar Blue (AB)染料还原法测定支架内细胞增殖。支架与稀释AB染料孵育4 h，分光光度计测定染料还原百分比。

ALP活性检测

按试剂盒说明测定支架内hMSCs分泌ALP。PBS洗涤后，1 mL Tris缓冲液（1 M, pH 8.0）匀浆，冰上超声3 min。取25 μL上清加1 mL p-硝基苯磷酸溶液（16 mM），30 °C孵育5 min，405 nm分光光度计测p-硝基酚生成量。

体内ALP活性检测

9只100-120 g雄性无胸腺裸鼠，双侧腹肌剥离建立肌袋。将三种支架（5 mm×5 mm）分别植入，不可吸收缝线闭合。14天后取出植入物，剥离肌瓣获取外植组织，匀浆提取碱性磷酸酶，取50 μL测定ALP活性。

统计学分析

所有实验重复3次，数据以mean ± SD表示。Origin 6.0单因素方差分析（ANOVA），P<0.05为显著差异。

结果

支架形貌

SEM显示支架呈精细纳米纤维结构。SF与SF+rhBMP-2支架纤维直径相似（100-900 nm），随电纺时间变化；SF纤维均匀，rhBMP-2偶联导致直径不均。支架孔径均匀，不随丝素蛋白浓度显著变化。

力学性能

应力-应变曲线显示，rhBMP-2添加不改变SF支架力学性能；随SF浓度增加，基质拉伸性能改善，可能因交联形成纤维间键合。低浓度SF纤维机械强度较弱。

溶胀性能

支架溶胀随时间均匀增加，约380 min达平衡。rhBMP-2偶联纤维吸水更多（平衡溶胀率~81% vs ~70%），提示BMP-2结合增加亲水基团。

细胞粘附

hMSCs对三种支架均良好粘附。随时间延长粘附率升高，BMP-2混合未降低粘附能力。ANOVA显示第3、6 h三组差异显著，第1 h无显著差异。孔径增大（SF浓度降低）促进细胞粘附。

细胞毒性与增殖

MTT实验显示rhBMP-2偶联支架细胞活力显著更高，无细胞毒性。随培养天数活力上升，SF+rhBMP-2各时间点毒性最低，ANOVA差异显著。Alamar Blue实验显示三组支架均支持细胞增殖，SF+rhBMP-2各时间点最佳，大孔隙提供更多生长空间，ANOVA差异显著。

体外ALP活性

ALP是骨诱导微环境标志指标。SF+rhBMP-2构建体ALP活性高于纯SF，SF纳米支架本身亦有一定骨诱导性，但SF+rhBMP-2最优。ALP浓度随时间增加，高SF浓度构建体ALP活性低于低浓度组。

体内ALP活性

裸鼠模型显示，含rhBMP-2支架外植体ALP活性显著高于无rhBMP-2组，证实体内骨诱导潜力。

讨论

支架基组织工程在再生医学展现巨大潜力。微观结构和物理特性对体外构建体向骨组织转化至关重要。最佳力学性能（孔径、拉伸强度等）和生物相容性是细胞定植与组织化的关键。本研究结合SF的优异力学与生物相容性、rhBMP-2的骨诱导性，制备并表征了骨组织工程支架。水相法制备SF溶液避免了有机溶剂导致的SF降解。电纺SF纤维结构均一、高度多孔、孔隙互联，与前人报道一致，未见珠状结构。混合后纤维直径未减小，但均一性受影响，可能因rhBMP-2在SF纤维上分布不均。混合SF增加了纳米纤维柔韧性，符合前人SF与其他材料混合改善力学性能的报道。SF支架无细胞毒性、促增殖，本研究结果一致。rhBMP-2因骨诱导性被广泛应用于BTE，相关研究证实BMP-2支架培养细胞ALP活性更高，且随孵育时间效应增强。Kim等利用BMP-2载用多孔微球亦观察到类似骨诱导增强。

结论

成功制备含rhBMP-2的SF基纤维支架，具有均一结构、良好力学性能和生物相容性。rhBMP-2赋予支架骨诱导潜力。体内实验证实其适用于骨组织工程应用。

缩略语

ALP:

碱性磷酸酶

BTE:

骨组织工程

hMSCs:

人骨髓间充质干细胞

rhBMP-2:

重组人骨形态发生蛋白-2

SF:

丝素蛋白