纳米金刚石中氮-空位中心高分辨基态耗尽成像

摘要

纳米金刚石(NDs)中带负电荷氮-空位(NV⁻)中心因其比其他荧光团更好的光稳定性和生物相容性，近期被研究用于细胞成像应用。多年来，利用亚衍射极限成像方法如单分子随机定位显微镜和受激辐射损耗显微镜，已证明NV⁻在NDs中可达20 nm分辨率的超分辨成像。此处我们首次展示利用三束光——探测束、耗尽束和复位束——实现NDs中这些中心的基态耗尽(GSD)纳米显微镜。638 nm耗尽束将NV⁻中心强制至亚稳暗态(除局部极小值处)，594 nm高斯探测束探测NV⁻中心，488 nm复位束用于重新填充激发态。演示了单个NV⁻中心半高全宽(FWHM)36 nm的超分辨成像，并分辨了间距72 nm的两个相邻NV⁻中心。与块体金刚石相比，GSD显微镜在此应用于NDs中NV⁻时使用更低光功率。这项工作证明了控制NDs氮浓度以针对超分辨成像方法定制应用的必要性，并为研究NDs中NV⁻纳米尺度相互作用铺平道路。

引言

金刚石中氮-空位(NV⁻)中心由取代氮和相邻空位组成，在多个科学技术领域引起广泛关注，最著名的包括：未来量子计算机中的量子存储器[1]、灵敏度极高的磁强计[2]及其在活细胞生物医学成像[3]和神经元活动成像[4]中的应用，以及作为各种超分辨成像方法中的原子尺度探针，如受激辐射损耗(STED)显微镜及其自旋变体、基态耗尽(GSD)显微镜变体[5,6,7]和具有纳米自旋定位的单分子随机定位显微镜(SMLM)[8]。特别是打破荧光显微镜衍射极限的方法代表当今生物医学科学范式转变[9]，NV⁻在金刚石中作为新型纳米探针在该领域发挥重要作用。因金刚石惰性、高生物相容性、坚固性和NV⁻光致发光高量子产率光稳定性，广泛探索其在生物医学科学和生物光子学[10, 11]及大脑显微镜[12]中的应用，也包括其纳米结构形式——纳米金刚石(NDs)[13, 14]。NDs保留宿主块体金刚石相似NV荧光性质，并具有更适合生命科学超分辨成像应用的优势[15]。然而，由于目前大规模生产荧光NDs形状和材料氮掺杂不均匀，导致NV性质与块体金刚石相比可变，且常含其他杂质，使用NDs进行超分辨成像通常比块体金刚石更具挑战性。

与纯度更高的块体金刚石相比，应用超分辨方法于NDs的局限性与NV⁻光物理性质变异性相关，源于NDs氮浓度不均匀、电荷陷阱和其他杂质浓度变化。

利用STED显微镜实现NDs中NV⁻中心纳米级成像，需耗尽束功率>650 mW达20 nm分辨率[16, 17](块体中最大分辨率用几个3.7 GW/cm²达成[5])；然而，为如纳米级体内细胞成像等应用减少光毒性，需要光强度在μW量级即可实现纳米级分辨率的成像模式。NDs具有实现细胞标记优势，块体平台无法做到，并已用于磁场超分辨成像SMLM[18]，其光毒性低于STED或GSD显微镜。先前利用GSD对块体金刚石中NV⁻进行超分辨成像，通过532 nm高强度光束激发中心至发光态耗尽基态；因此基态耗尽经由激发态发生[7]。然而，该方法也需要极高光强度实现超分辨(数GW/cm²达<10 nm分辨率)和成像重构算法获取正像[19]。利用皮秒脉冲激光诱导NV⁻电荷转换为中性电荷态(NV⁰，零声子线575 nm)的电荷态转换(CSD)耗尽纳米显微镜在块体金刚石中实现低功率超分辨[20, 21]；然而耗尽束平均功率1 mW达12 nm分辨率，机制似乎材料依赖，即超低氮浓度(低于5 ppb[21])，通常在电子级化学气相沉积块体金刚石中实现。

NV⁻中心块体金刚石GSD纳米显微镜替代方法利用亚稳暗态通过寿命长的亚稳态耗尽基态，使用更低功率，最初在文献[22]提出并首次在哺乳动物细胞中用有机染料Atto532演示[23]。

GSD原理是通过双束法去激活荧光标记荧光。第一束为激发或探测束，激发荧光团至激发态；第二束为抑制束，关闭荧光。通过瞬时将荧光团种群搁置至亚稳态或长寿命三线态实现荧光去激活。单线态亚稳态和三线态间光学跃迁需自旋翻转，因此光学上被抑制[23]。

文献[24]中，GSD通过持续从CW红激光(638 nm)泵浦中心(25-200 μW光功率)实现，将NV⁻带入非荧光态填充其长寿命亚稳态，从而耗尽基态，而蓝激光(476 nm)用于清空暗亚稳态诱导跃迁至高能态。此处638 nm激光也用于激发中心(虽非高效)再搁置至亚稳态。仅当蓝红激光同时激发时NV⁻显示发光。用5 mW耗尽激光功率达16 nm分辨率，远低于STED或先前GSD。该方法可能局限性在于亚稳态性质随不同金刚石类型(氮含量多少)甚至NDs变化，限制适用性。文献[24]中块体金刚石为IIa型光学级金刚石，对应氮浓度500 ppm，远高于近期CSD工作[21]依赖的低氮浓度(<5 ppb)。文献[21]称文献[24]暗态为NV⁻中性电荷态，但未考虑高氮浓度下NV⁻/⁰电荷转换被抑制[25]且NV主要呈负电荷态；进而测得暗态寿命极长不能归因于电荷转换过程。事实上，CSD在商业荧光NDs(源自高压高温HPHT金刚石)中尚未被证实，因其高氮浓度、其他缺陷导致电荷不稳定和材料控制缺乏导致光物理可变性质。

由于假设CSD不可能在NDs发生，NV⁻中心GSD纳米显微镜建立机制尚未在NDs中报道。

本文展示GSD可在NDs中实现，证明GSD和CSD方法对金刚石氮浓度依赖性，提示需针对特定超分辨和自旋传感方法进行NDs材料工程。

本文演示利用类似开/关荧光开关机制，通过将电子搁置于长寿命亚稳态，采用三束法在NDs中实现NV⁻中心GSD纳米显微镜，使用300 μW完全耗尽激发态达最大分辨率。我们展示NDs中NV⁻性质不限制该方法适用性，如前认为[24]。进一步我们能区分同一NDs内两个NV⁻中心，如前用SMLM[26]和STED显微镜[17]所示。

为证实我们工作中基态耗尽机制源于长寿命亚稳态而非CSD，我们将总结近期关于NV⁻/⁰电荷态转换关键结果。关于光诱导电离，NV⁻/⁰电荷态复合被深入研究并发现依赖激发波长[27, 28]，红光(或蓝光)激发下电荷态切换，红光激发用将NV⁻切换至中性电荷态。这种低激光功率快速切换动力学已用于实现电荷态耗尽纳米显微镜[21]和随机光学重构纳米显微镜[8]，仅在化学气相沉积生长块体金刚石中，因低温生长氮浓度受良好控制且通常极低。基于NV电荷转换激发波长依赖切换动力学在NDs中未观察到[18, 26, 29]，NDs中闪烁源于制造过程(通常粉碎高氮浓度HPHT微米金刚石)机械损伤产生的电荷陷阱或氧化[26, 29,30,31]或靠近其他受体杂质[18, 32]相关效应，与NV⁻/⁰电荷转换无关。也已证明NV⁻电荷转换强烈依赖金刚石晶格中电子给体杂质浓度(即氮浓度)，高给体杂质浓度抑制负电荷态向中性电荷态转换[25]。事实上，已提议利用给体和受体稳定NV电荷态[33]。大多数研究在块体金刚石进行，仅近期工作[34]显示低温生长NDs允许更低氮掺入，因此NDs表现如纯块体金刚石对红光(或蓝光)激发有强电荷态切换，而高温生长掺入更多氮杂质显著抑制电荷转换。

在我们NDs中，未观察到激光波长激发诱导NV⁻/⁰电荷转换，我们归因暗态确为亚稳态，如前所述[24]，考虑此处使用较大NDs(~100 nm)无表面电荷态闪烁，更重要的是其高氮浓度。此处研究NDs源自HPHT微米金刚石商业产品，氮浓度至少不均匀500 ppm。文献[24]亚稳态也由其极长150 s寿命证明。

NV⁻中心通常用532或561 nm最佳激发，因其具637 nm零声子线[35]，对应三线基态和激发态跃迁，主要为自旋守恒跃迁。此外存在单线亚稳态[36]，中心经非辐射跨系统窜越跃迁。NV⁻在NDs中光学跃迁寿命约22 ns[37]，比块体金刚石12 ns长[35]。

594 nm激发(探测)束促进基态至激发态跃迁，638 nm耗尽束通过非辐射跨系统窜越瞬时将NV⁻中心电子从激发态搁置至亚稳态(图1a)。使用594 nm探测合理，因其比绿光(通常532或561 nm)极少改变暗态种群[24]。此方法有效饱和跨系统窜越清空基态，防止NV⁻中心激发至激发态及随后荧光发射，当用594 nm探测时。最后，488 nm蓝激光重新填充激发态，抑制随后快速(ns)衰减至基态[38]。

类似STED，耗尽束在横向平面空间工程为甜甜圈束以实现超分辨成像[24]。GSD纳米显微镜分辨率d遵循公式[23]：

$$d \approx \frac{\lambda }{{[2\left( {NA} \right)\sqrt {1 + I_{{\text{D}}}^{\max } /I_{{\text{s}}} ]} }}$$ (1)

其中NA为物镜数值孔径，I_s为一半荧光耗尽时饱和强度，I_D^max为边界零值处峰值最大强度。

我们测得单个ND中NV⁻中心成像分辨率36 nm，取决于耗尽束强度。此外，分辨了间距72 nm两个NV⁻中心。我们工作对含NV⁻中心NDs作为生物标志物的活细胞荧光纳米显微镜很有前景。

实验方法

本实验使用高压高温(HPHT)NDs悬浮液，名义尺寸100 nm[39, 40]，酸清洗稀释于MilliQ溶液。20 µl NDs溶液(1:200稀释于MilliQ水)滴铸于氧等离子清洗硼硅酸盐盖玻片并自然干燥[37]。GSD纳米显微镜实验装置包含自制共聚焦显微镜，两个连续波二极管激光器波长488 nm和638 nm，一个连续波氦-氖(HeNe)激光器波长594 nm。各光路安装声光调制器(AOM)从连续光束创建光脉冲并相互同步。通过AOMs后，空间滤波器清理空间光束轮廓。二级透镜准直各光束进一步传播。首先波长488 nm和638 nm激光束用532 nm长通激光平场二向色镜(Semrock-LPD01 532R)空间重叠。二级二向色镜(Semrock-R405/488/543/638)反射488 nm和638 nm波长透射594 nm波长实现三束空间重叠。638 nm耗尽束空间光束轮廓用相位板工程为甜甜圈束。进一步，物镜前放置四分之一波片确保耗尽束圆偏振。使用高数值孔径(NA=1.4)油浸物镜成像NDs。二向色镜(Semrock-LP02-671RU-25)分离NV⁻中心荧光与激发波长并通过单模光纤作为针孔重定向至单光子雪崩二极管(SPCM-AQRH-14FC)探测器。光学装置示意图如图1b所示。

平均尺寸40 nm金纳米颗粒滴铸玻璃盖玻片成像以研究耗尽束空间轮廓。观察到甜甜圈形状点扩散函数，中心有高强度环和局部极小值(图1b插图)。

我们首先研究各激光脉冲时间响应。AOMs通过LabVIEW用多通道脉冲发生器(PulseBlasterESR-PRO)控制，控制各激光束单独时间特性及三束间时序。因各激光光程不同，同一时刻产生光脉冲在探测器到达时间略有偏移。这使我们能在亚微秒时间尺度对三束激光进行时间控制。

测得激发束上升和下降时间60 ns(图1c)。594 nm和638 nm光脉冲相对488 nm波长脉冲到达时间分离85 ns和155 ns。各激光脉冲产生荧光源于多种不同来源，包括NV⁻中心、ND其他杂质和盖玻片缺陷。仅激发束产生荧光与GSD成像相关。其他激光脉冲荧光贡献荧光图像噪声。为此引入时间门控消除除探测束外其他激光脉冲产生荧光。通过探测束脉冲到达时间门控探测有效滤除其他荧光源，提高成像信噪比。

GSD纳米显微镜典型脉冲序列和检测窗口见图1d。用638 nm波长耗尽脉冲将电子搁置长寿态关闭NV⁻中心荧光。594 nm波长脉冲提供亚衍射区域NV⁻中心激发，488 nm波长脉冲将NV⁻中心复位回激发态。脉冲序列重复500-1000次确保高信噪比。探测束(594 nm)和复位束(488 nm)脉冲长度10-20 μs范围。耗尽束最优脉冲长度~300 μs(图2d)。光束脉冲时长优化基于文献[24]；但需更系统优化改善最终分辨率。预期分辨率依赖抑制束脉冲时长，受亚稳态寿命限制。

结果与讨论

通过638 nm和488 nm波长激光源激发NV⁻中心研究开/关切换机制(图2a)。仅当两束空间重叠时检测到NV⁻中心荧光发射增加。这种发射行为可理解为：638 nm波长光束优先将电子搁置长寿态，而488 nm光束允许自发辐射(图1a)。我们假设NDs中NV⁻中心长寿态寿命较短(NDs唯一测量33-127 ns来自文献[38]，单线态跃迁300 ns[41])，比块体金刚石亚稳态寿命(测得150 s)[24]短得多，且远长于激发态寿命[37]。

利用反联合(图2c)测量选取单个NV⁻中心研究有效淬灭甜甜圈形状荧光所需耗尽束功率[42]。添加594 nm波长光束探测单个NV⁻中心处于开态还是关态。图2b显示选定NV⁻中心荧光随耗尽束强度依赖。观察到荧光快速下降。耗尽功率151.2 μW时NV⁻中心有效关闭。

据我们所知，首次演示GSD纳米显微镜应用于NDs实现单个NV⁻中心超分辨成像。

为通过GSD实现超分辨，聚焦激发束覆盖所有发射体瞬时关闭，除亚衍射尺寸区域外，因甜甜圈形耗尽束重叠将中心转移至长寿暗态。获得分辨率可通过焦平面中心"开启"轮廓量化，按公式(1)缩放，其中I_s与涉及态寿命和光学开关跃迁抑制截面成反比[43, 44]。

图3a显示单个ND中NV⁻中心超分辨荧光图像(图2c)。半高全宽(FWHM) x方向57 nm，y方向42 nm(图3c)。

耗尽功率与分辨率关系如图3b所示。理论曲线基于公式(1)。实验数据抑制NV⁻中心荧光所需额外功率归因于ND宿主局部环境和较短亚稳态寿命[38]与块体相比。注意最大分辨率42 nm在2.2 mW达成，而文献[24]用16 mW达12 nm分辨率，对应耗尽束峰值强度12 MW/cm²。

进一步，应用GSD纳米显微镜演示两个紧密间距NV⁻中心纳米级成像。图4a显示NV⁻中心共聚焦图像。GSD纳米显微镜下两个单个NV⁻中心以纳米级分辨率成像(图4b)。两个NV⁻中心中心间距72 nm(图4c)。y方向两个分辨NV⁻中心FWHM分别36 nm(图4d)和38 nm(图4e)。我们将ND主轴与分辨NV⁻中心间错位归因于共聚焦图像扫描时机械漂移。

结论

本工作实现利用NDs中NV⁻中心亚稳态的GSD纳米显微镜，展示NV⁻中心超分辨成像。分辨FWHM 36 nm单个NV⁻中心。展示分辨率随耗尽束强度缩放，最大超分辨在2.2 mW耗尽功率达成。此外，分辨间距72 nm两个NV⁻中心。此结果开启研究紧密间距NV⁻中心偶极耦合[45]、基于NV⁻自旋性质高空间分辨率量子传感[6, 18, 46,47,48]及基于块体金刚石[49]扩展至NDs[50]其他多功能传感应用可能性。

本文也展示金刚石氮浓度是GSD和CSD机制实现超分辨基础，分别在高和低氮掺杂金刚石中实现。因此应开发针对特定方法的工程化NDs。理解CSD因低氮浓度更易应用于自旋传感；然而NV⁰电荷态会限制CSD量子传感性质，而利用非氮给体稳定NV⁻电荷态可带来GSD应用于自旋量子传感更高灵敏度。

NDs中NV⁻中心GSD纳米显微镜使用低功率(~300 μW)光强度相比块体金刚石，更适合生物样品。通过确定最优氮掺杂[34]、研究表面钝化和其他杂质对NDs中NV⁻亚稳态寿命影响、工程化减少发光杂质NDs可提高GSD分辨率。

关于自旋传感，当前商业NDs源自HPHT和高氮含量微米金刚石高氮浓度限制自旋灵敏度，因光学检测磁共振对比度降低[34]。因此应考虑其他掺杂剂稳定NV⁻电荷态且不引入退相干[50, 51]。

最后，结合微波激发[18, 52,53,54]，若当前NDs材料性质能为此应用更好工程化，可为生命科学超分辨光学磁成像提供替代方法。

缩略语

NDs:

纳米金刚石

NV:

氮-空位

STED:

受激辐射损耗

GSD:

基态耗尽

CSD:

电荷态耗尽

FWHM:

半高全宽

HPHT:

高压高温

AOM:

声光调制器