纳米金刚石中氮空位中心的地态耗竭纳米显微镜

介绍

金刚石中的氮空位 (\({\text{NV}}^{ - }\)) 中心由置换氮和相邻的空位组成，引起了多个科学和技术领域的广泛兴趣，其中最著名的是未来量子计算机中的量子存储器 [1]、非常灵敏的磁力计 [2]，可用于活细胞的生物医学成像 [3] 和神经元活动 [4]，以及作为各种超分辨率成像方法中的原子级探针例如受激发射耗尽 (STED) 显微镜及其自旋变体、基态耗尽 (GSD) 显微镜的变体 [5,6,7] 和具有纳米自旋定位的单分子随机定位显微镜 (SMLM) [8]。特别是，在荧光显微镜中突破衍射极限的方法代表了当今生物医学科学的范式变化 [9] 和钻石中的 \({\text{NV}}^{ - }\) 在该领域发挥了相关作用新型纳米探针。由于金刚石的惰性、高生物相容性、鲁棒性和\({\text{NV}}^{ - }\) 光致发光的光稳定性和高量子产率，它已被广泛探索用于生物医学科学和生物光子学 [10, 11] 和脑显微镜 [12] 中的纳米结构形式也被称为纳米金刚石 (NDs) [13, 14]。 ND 保留了主体块状金刚石的类似 NV 荧光特性，具有更适合生命科学超分辨率成像应用的优势 [15]。然而，由于目前大量生产的荧光 ND 的形状和材料氮掺杂的不均匀性，与大块金刚石相比，导致 NV 的可变特性，并且通常含有其他杂质，与大块金刚石相比，使用 ND 的超分辨率成像通常更具挑战性.

与纯度更高的大块金刚石相比，将超分辨率方法应用于 ND 的局限性与 \({\text{NV}}^{ - }\) 的光物理特性的可变性有关，因为 ND 氮的不均匀性浓度、电荷陷阱和其他杂质浓度。

NDs 中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的纳米级成像已经用 STED 显微镜证明，耗尽光束功率> 650 mW 以实现 20 纳米分辨率 [16, 17]（最大批量分辨率仅达到 3.7 GW/cm ² [5]);然而，以μW数量级的光强度实现纳米级分辨率的成像方式对于例如纳米级体内细胞成像是必要的，以减少光毒性。 NDs 具有启用细胞标记的优势，这在大容量平台上是不可能的，并且已被用于使用 SMLM [18] 的磁场超分辨率成像，其光毒性低于 STED 或 GS​​D 显微镜。之前使用 GSD 对大块金刚石中的 \({\text{NV}}^{ - }\) 进行超分辨率成像是通过使用 532 nm 的高强度光束将中心激发到发光状态来耗尽其基态来实现的；因此，基态的耗尽是通过激发态发生的 [7]。然而，这种方法还需要非常高的光强度才能实现超分辨率（几个 GW/cm ² 以获得分辨率 <10 nm）和成像重建算法以获得正图像[19]。使用皮秒脉冲激光诱导 \({\text{NV}}^{ - }\) 电荷转换为其中性电荷状态 (\({\text{NV}}^{0 }\) 在大块金刚石中具有 575 nm 处的零声子线，称为电荷状态转换 (CSD) 耗尽纳米显微镜 [20, 21]；然而，耗尽光束的平均功率为 1 mW 以达到 12 nm 的分辨率，并且机制似乎取决于材料，即超低氮浓度（低于 5 ppb [21]），通常在电子级化学气相沉积中实现大块钻石。

大块金刚石中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的 GSD 纳米显微镜的另一种方法使用亚稳态暗态通过长寿命亚稳态使用低得多的功率消耗基态，如最初在参考文献中提出。 [22] 并首次在参考文献中演示。 [23] 在哺乳动物细胞中使用有机染料 Atto532。

GSD 的原理是通过两束方法使荧光标记的荧光失活。第一个光束是激发或探测光束，它将荧光团激发到激发态，第二个光束是抑制光束，它关闭荧光。荧光的失活是通过将荧光团的群体暂时搁置到亚稳态或长寿命三重态来实现的。单重亚稳态和三重态之间的光学跃迁需要自旋翻转，因此被光学抑制[23]。

在参考。 [24]，GSD 是通过从 CW 红色激光器 (638 nm) 连续泵浦中心 25 到 200 μW 光功率来实现的，该激光器将 \({\text{NV}}^{ - }\) 带入非-通过填充其长寿命的亚稳态，从而耗尽其基态，而荧光状态，而蓝色激光（476 nm）用于清空暗亚稳态，诱导跃迁到更高的能量状态。这里 638 nm 激光也用于激发中心，即使效率不高，然后将其搁置在亚稳态。 \({\text{NV}}^{ - }\) 只有在被蓝色和红色激光激发时才显示出发光。使用 5 mW 的耗尽激光功率实现了 16 nm 的分辨率，这远低于 STED 或以前的 GSD 中使用的分辨率。这种方法的一个可能的限制可能是不同类型的金刚石的亚稳态特性的依赖性，其含氮量更少或更多，甚至在 NDs 中甚至更多，从而限制了其适用性。在参考。 [24]，大块金刚石是 IIa 型光学级金刚石，对应于 500 ppm 的氮浓度，远高于最近的 CSD 工作 [21]，后者依赖于低氮浓度 (<5 ppb) .该声明在参考文献中报道。 [21] Ref 的暗状态。 [24] 是 \({\text{NV}}^{ - }\) 的中性电荷状态，因为没有考虑在高氮浓度下 NV ^−/0 电荷转换受到抑制 [25] 并且 NV 主要处于负电荷状态；此外，测得的暗态寿命非常长，不能归因于电荷转换过程。事实上，CSD 尚未在商用荧光 NDs（衍生自高压高温、HPHT、金刚石）中得到证实，因为它们的氮浓度高、其他缺陷导致的电荷不稳定性以及由于缺乏物料控制。

由于假设CSD不会在NDs中发生，因此在NDs中的\({\text{NV}}^{ - }\)中心建立GSD纳米镜的机制也尚未报道。

在本文中，我们证明了 GSD 可以在 NDs 中进行，证明 GSD 和 CSD 方法对金刚石氮浓度的依赖性，并促使 NDs 材料工程需要特定的超分辨率和自旋传感方法。

在本文中，我们使用类似的开/关荧光开关机制展示了 ND 中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的 GSD 纳米级三光束方法并使用 300 μW 完全耗尽激发态并实现最大分辨率。在这里，我们展示了 NDs 中 \({\text{NV}}^{ - }\) 的属性并不限制这种方法的适用性，正如之前认为的 [24]。此外，我们能够区分相同 ND 内的两个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心，如之前所示，使用 SMLM [26] 和 STED 显微镜 [17]。

为了证实我们工作中基态耗尽的机制是由于暗亚稳态而不是 CSD，我们将总结与 NV ^−/0 相关的近期关键结果 电荷态转换。在这方面，光诱导电离、NV ^-/0 的重组 电荷状态已被彻底研究并发现与激发波长有关 [27, 28]，红色（或蓝色）激光激发的电荷状态切换，红色激发用于切换 NV ⁻ 进入中性电荷状态。这种在低激光功率下发生的快速切换已被用于实现电荷状态耗尽纳米显微镜 [21] 和随机光学重建纳米显微镜 [8]，仅在通过化学气相沉积生长的大块金刚石中，其中氮浓度得到很好的控制并且通常非常低由于低温生长。在 NDs [18, 26, 29] 中没有观察到这种基于 NV 电荷状态转换的激发波长引起的开关动力学，其中闪烁是由于制造过程中机械损伤产生的电荷陷阱（通常使 HPHT 高氮碰撞浓度微金刚石）或其他与氧化相关的影响 [26, 29,30,31] 或与其他受体杂质 [18, 32] 的接近，因此与 NV ^-/0 无关 电荷转换。还证明了 NV ⁻ 电荷转换还很大程度上取决于金刚石晶格中电子供体杂质的浓度，即高浓度的供体杂质（氮）浓度会抑制负态向中性电荷态的转换[25]。事实上，有人提议在金刚石中使用施主和受主来稳定 NV 电荷状态 [33]。大多数这些研究是在大块金刚石中进行的，只有最近的一项工作 [34] 表明低温下 ND 的生长允许较低的氮掺入，因此 ND 表现为纯大块金刚石，具有强烈的红色电荷状态转换。或蓝色）激光激发，而含有更多氮杂质的高温生长显着抑制了这种电荷转换。

在我们的 NDs 中，我们没有观察到 NV ^−/0 由于激光波长激发引起的电荷转换，我们确实将暗态归因于之前所做的亚稳态 [24]，也是鉴于此处使用的大尺寸 ND（~ 100 nm），没有因表面而闪烁电荷状态，此外更重要的是它们的高氮浓度。此处研究的 ND 是商业上衍生自 HPHT 微金刚石的，其氮浓度至少为 500 ppm 不均匀。参考文献中的亚稳态。 [24] 其 150 秒的超长寿命也证明了这一点。

\({\text{NV}}^{ - }\) 中心通常最好使用 532 或 561 nm 激发，因为它们在 637 nm 处具有零声子线 [35]，对应于三重基态和激发态之间的跃迁状态，主要是自旋守恒跃迁。此外，存在单重亚稳态 [36]，中心通过非辐射衰变在其上过渡。 \({\text{NV}}^{ - }\) 在 ND 中的光学跃迁寿命约为 22 ns [37]，比大块金刚石的 12 ns [35] 更长。

594 nm 的激发（探测）束促进从基态到激发态的跃迁，而 638 nm 的耗尽束瞬时搁置 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的电子通过非辐射系统间交叉将激发态转变为亚稳态（图 1a）。与绿色（通常为 532 或 561 nm）相比，使用 594 nm 作为探针的理由是它对暗态种群的改变最小[24]。当用 594 nm 探测时，这种方法有效地使系统间交叉饱和并清空基态，防止激发到 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的激发态和随后的荧光发射。最后，488 nm 的蓝色激光重新填充激发态，抑制随后快速 (ns) 衰减到基态 [38]。

一 ND 中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中 GSD 的原理，使用 594 nm 的探测光束（黄色）、638 nm 的耗尽光束（红色）和 488 nm 的复位光束（蓝色）。 NV中心的GS基态、ES激发态和MS亚稳态。纳米金刚石中 NV 中心的插图。 b 实验装置的示意图。该系统由一个自制的共聚焦显微镜组成，其中三个激光器的工作波长分别为 488 nm、594 nm 和 638 nm。涡旋相位板在空间上将 638 nm 耗尽光束设计成环形光束，以确保仅在衍射受限区域周围耗尽。 c 通过测量每个激光器的脉冲到达时间来表征声光调制器。 d GSD 纳米显微镜中使用的脉冲序列示意图。检测窗口与 594 nm 的探测光束同步以仅收集相关荧光。 594 nm 探测光束的脉冲长度优化为 20 μs，因为较短的脉冲长度会导致较长的平均时间，而较长的脉冲长度会导致超分辨率成像效率较低。 488 nm 复位光束优化为 20 μs，因为它最好尽可能短以减少总脉冲序列时间，但仍有效地清空长寿命亚稳态

与 STED 类似，耗尽光束在空间上被设计成横向平面中的环形光束，以实现超分辨率成像 [24]。分辨率 d GSD 纳米镜遵循方程。 [23]：

NA 表示物镜的数值孔径，\(I_{{\text{s}}}\) 表示一半荧光耗尽时的饱和强度和 \(I_{{\text{D}}}^{\ max }\) 零边界峰的最大强度值。

我们根据耗尽光束强度测量了 ND 中单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的 36 nm 成像分辨率。此外，两个相距 72 nm 的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心已被解析。我们的工作有望用于活细胞内的荧光纳米显微镜检查，其中 NDs 包含 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心作为生物标志物。

实验方法

在该实验中，使用了标称尺寸为 100 nm 的高压高温 (HPHT) ND 悬浮液 [39, 40]，经酸清洗并在 MilliQ 溶液中稀释。将 20 µl NDs 溶液（1:200 在 MilliQ 水中稀释）滴涂在氧等离子体灰烬清洁的硼硅酸盐盖玻片上，并在空气中干燥 [37]。 GSD 纳米显微镜的实验装置包括一个自制的共聚焦显微镜，其中有两个波长为 488 nm 和 638 nm 的连续波二极管激光器和一个波长为 594 nm 的连续波氦氖 (HeNe) 激光器。在每个光束路径中，安装了一个声光调制器 (AOM)，以从连续光束中产生光脉冲并使它们彼此同步。在通过 AOM 传播后，空间滤波器清理了空间光束轮廓。二级透镜准直每个光束以进一步传播。首先，使用 532 nm 长通激光平面二向色镜 (Semrock-LPD01 532R) 在空间上重叠 488 nm 和 638 nm 波长的激光束。二级二向色镜 (Semrock-R405/488/543/638) 通过反射 488 nm 和 638 nm 波长并透射 594 nm 波长在空间上重叠所有三个光束。使用相位板将 638 nm 波长的耗尽光束的空间光束轮廓设计成环形光束。此外，四分之一波片放置在物镜之前，以确保耗尽光束的圆偏振。使用高数值孔径 (NA =1.4) 油浸物镜对 ND 成像。二向色 (Semrock-LP02-671RU-25) 将 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的荧光与激发波长分开，并将其重定向到单光子雪崩二极管 (SPCM-AQRH) -14FC) 检测器通过单模光纤充当针孔。光学装置的示意图如图 1b 所示。

平均尺寸为 40 nm 的金纳米粒子被滴铸到玻璃盖玻片上并成像以研究耗尽光束的空间分布。观察到具有高强度环且其中心具有局部最小值的甜甜圈形点扩散函数（图 1b 的插图）。

我们首先研究了每个激光脉冲的时间响应。 AOM 通过 LabVIEW 使用多通道脉冲发生器 (PulseBlasterESR-PRO) 进行控制，该发生器控制每个激光束的单独时间属性，以及三个光束之间的时间。由于每个激光器的光路长度不同，同时产生的光脉冲到达检测器的时间略有偏移。这使我们能够在亚微秒时间尺度上对所有三个激光束进行时间控制。

激发光束的上升和下降时间为 60 ns（图 1c）。 594 nm 和 638 nm 波长的光脉冲与 488 nm 波长的脉冲相差 85 ns 和 155 ns。每个激光脉冲都会产生来自几个不同来源的荧光，包括 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心、ND 中的其他杂质和玻璃盖玻片内的缺陷。只有激发光束产生的荧光才与 GSD 成像相关。来自其他激光脉冲的荧光会导致荧光图像的噪声。为此，引入时间门控以消除由探测光束以外的激光脉冲产生的荧光。这是通过对探测光束的脉冲到达时间进行门控，有效滤除其他荧光源，提高成像信噪比来实现的。

GSD 纳米显微镜的典型脉冲序列和检测窗口如图 1d 所示。关闭 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心荧光是通过将电子搁置到长寿命状态并使用 638 nm 波长的耗尽脉冲来实现的。子衍射区域中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的激发由 594 nm 波长的脉冲提供，而 488 nm 波长的脉冲将 \({\text {NV}}^{ - }\) 中心回到激发态。脉冲序列重复 500-1000 次以确保高信噪比。探测光束 (594 nm) 和复位光束 (488 nm) 的脉冲长度在 10-20 μs 范围内。发现耗尽光束的最佳脉冲长度为 ~ 300 μs（图2d）。光束脉冲持续时间的优化基于参考文献。 [24];但是，应该进行更系统的优化以提高最终分辨率。预计分辨率取决于抑制束脉冲持续时间，而抑制束脉冲持续时间受亚稳态寿命的限制。

一 基于 488 nm 和 638 nm 激发的单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的荧光。当两种激光同时激发 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心时，检测到的荧光会增加。 b 荧光对消耗功率的依赖。插图中显示了脉冲序列的图示。仅当 594 nm 的探针激光打开时才会检测到荧光。 c \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的反聚集曲线显示了一个二阶相关函数 <0.5 零延迟时间

结果与讨论

通过在波长为 638 nm 和 488 nm 的激光源下激发 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心来研究开/关切换机制（图 2a）。只有当两束光束在空间上重叠时，才检测到 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的荧光发射增加。这种发射行为是可以理解的，假设 638 nm 波长的光束优先将电子搁置在长寿命状态，而 488 nm 的光束允许自发发射（图 1a）。我们假设 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的长寿命状态的寿命更短（NDs 的唯一测量值是参考 [38] 中的 33-127 ns，而单线态跃迁比大块金刚石中的亚稳态寿命（测量为 150 s）[24] 长 300 ns [41]，并且比激发态的寿命长得多 [37]。

使用抗聚束（图 2c）测量选择单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心，以研究耗尽光束在甜甜圈形状中有效淬灭荧光所需的功率 [42] .添加波长为 594 nm 的光束以探测单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心是处于开启状态还是关闭状态。图 2b 显示了所选 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心对耗尽光束强度的荧光依赖性。观察到荧光的快速下降。在 151.2 μW 的耗尽功率下，\({\text{NV}}^{ - }\) 中心被有效关闭。

在这里，据我们所知，我们第一次展示了 GSD 纳米镜应用于 ND 对单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的超分辨率成像。

为了通过 GSD 实现超分辨率，所有被聚焦激发光束覆盖的发射器都被瞬时关闭，除了亚衍射大小的区域，因为甜甜圈形耗尽光束的重叠将中心转移到他的长-生活在黑暗状态。获得的分辨率可以通过焦平面中的轮廓进行量化，其中中心在“开”处，并按照公式（1）进行缩放。 (1)，其中\(I_{s}\)与所涉及状态的寿命和光关断转换的抑制截面成反比[43, 44]。

图 3a 显示了 ND 中单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的超分辨荧光图像（图 2c）。半高宽 (FWHM) 在 x 方向为 57 nm，在 y 方向为 42 nm（图 3c）。

一 基于 GSD 纳米镜的超分辨 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的荧光图像。停留时间 10 毫秒和 2 纳米像素大小。 b 作为耗尽功率的函数的横向分辨率。与大块金刚石相比，实验和理论之间的差异很可能是由于主体材料的缺陷和 ND 局部环境的变化。该理论基于块状金刚石中的 NV 中心。 c 沿 x 轴和 y 轴的图像横截面轮廓，FWHM 分辨率分别为 57 nm 和 42 nm。实线代表最佳拟合

耗尽功率和分辨率之间的关系如图 3b 所示。理论曲线基于方程。 (1).抑制实验数据的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心荧光所需的额外功率归因于 ND 宿主中的局部环境和更短的亚稳态寿命 [38] 与体相相比.值得注意的是，在 2.2 mW 时实现了 42 nm 的最大分辨率，而在参考文献中。 [24] 16 mW 达到 12 nm 分辨率，对应的峰值强度为 12 MW/cm ² 用于耗尽光束。

此外，我们应用 GSD 纳米显微镜来展示两个紧密间隔的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的纳米级成像。图 4a 显示了 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的共焦图像。在 GSD 纳米显微镜下，两个单一的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心以纳米级分辨率成像（图 4b）。两个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心之间的中心距为 72 纳米（图 4c）。 y 中两个解析的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的 FWHM -方向分别为 36 纳米（图 4d）和 38 纳米（图 4e）。我们将 ND 的主轴与解析的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心之间的未对准归因于共焦图像扫描过程中的机械漂移。

一 500 × 500 nm（停留时间 2 ms 和 1 nm 像素大小）和 b 的共聚焦荧光图 白色方块的超分辨率图像 300 × 300 nm（停留时间 24 毫秒和 1 纳米像素大小）b 两个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心。单个共焦点被超分辨成两个独立的暗淡荧光点。 c 沿 X 轴的横截面显示了两个峰之间 72 nm 的间隔，对应于两个 NV 中心的中心到中心距离的位置。 d 沿 Y 轴的横截面，测量的 FWHM 分辨率为 36 nm 和 38 nm，对应于 \({\text{NV}}^{ - }\) 1 和 \({\text{NV}}^{ - }\) b 中的 2 , 分别

结论

在这项工作中，我们使用纳米金刚石中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的亚稳态实现了 GSD 纳米镜，显示了 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心。解决了 FWHM 为 36 nm 的单个 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心。还显示了分辨率相对于耗尽光束强度的缩放比例，最大超分辨率是通过 2.2 mW 的耗尽功率实现的。此外，两个相距 72 nm 的 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心被解析。这一结果开辟了研究紧密间隔 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心之间偶极耦合的可能性[45]，基于 \({\text{ NV}}^{ - }\) 自旋特性 [6, 18, 46,47,48] 以及其他基于块状金刚石 [49] 的多功能传感应用扩展到 NDs [50]。

在本文中，我们还表明，金刚石中的氮浓度是超分辨率 GSD 和 CSD 机制的基础，分别在高和低氮掺杂金刚石中实现。因此，应遵循特定方法的工程 ND。据了解，由于氮浓度低，CSD可以更容易地应用于自旋传感；然而，NV ⁰ 电荷态会限制 CSD 的量子传感特性，同时使用除氮以外的其他供体来稳定 \({\text{NV}}^{ - }\) 的电荷态可以带来更高的 GSD 灵敏度应用于自旋量子传感。

与大块金刚石相比，NDs 中 \({\text{NV}}^{ - }\) 中心的 GSD 纳米镜使用低功率（~ 300 μW）的光学强度，更适合生物样品。 GSD 分辨率可以通过确定最佳氮掺杂 [34]、研究表面钝化和其他杂质对 ND 亚稳态寿命中 \({\text{NV}}^{ - }\) 的影响以及通过减少光致发光杂质的工程NDs。

在自旋传感方面，目前由 HPHT 和高氮含量微金刚石衍生的商业 ND 中的高氮浓度限制了自旋灵敏度，因为光学检测到的磁共振对比度降低 [34]。因此，应考虑使用其他掺杂剂来稳定 \({\text{NV}}^{ - }\) 电荷态而不引入退相干 [50, 51]。

最后，将此方法与微波激发相结合 [18, 52,53,54]，如果当前的 NDs 材料特性可以针对此应用进行更好的设计，它可以为生命科学中的超分辨率光学磁成像提供另一种方法。

数据和材料的可用性

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求向相应作者索取。

缩写

ND：

纳米金刚石

NV：

氮空位

STED：

受激排放损耗

GSD：

基态耗尽

CSD：

电荷态耗尽

FWHM：

半高全宽

HPHT：

高压高温

AOM：

声光调制器