吸入多壁碳纳米管对血压和心脏功能的影响

背景

随着潜在的广泛工业应用和产量增加，许多工业部门接触纳米材料的机会增加。因此，接触纳米材料对健康的不利影响受到了极大的关注。动物研究表明，根据所测试纳米材料的物理和化学特性，短期肺部暴露于工程纳米粒子会导致肺部严重或轻微的炎症反应。此外，肺部暴露于碳纳米管 (CNT) 与肺纤维化和癌症促进有关 [1,2,3,4,5]。尽管最近对纳米材料职业暴露的强调更多地关注肺部疾病和致癌作用，而较少关注心血管系统，但流行病学和最近的动物研究的证据强烈表明，纳米材料的肺部暴露可以通过纳米颗粒引起的炎症、易位影响心血管系统和/或神经元调节 [6,7,8,9]。我们的研究发现，来自超细二氧化钛 (UFTiO2) 和多壁碳纳米管 (MWCNTs) 的纳米颗粒，在引起肺部轻微急性炎症反应的剂量下，可以瞬时增加外周神经元中的神经递质合成 [8] 并导致自主神经系统 (ANS) 活动的改变 [10]。此外，我们之前还报道了分离的心肌细胞直接暴露于 UFTiO2 不会改变心肌细胞的生物活性 [11]。综上所述，我们的研究强烈表明，一些纳米材料在对肺表现出轻微急性作用的剂量下，通过影响神经元系统而不是通过纳米颗粒直接易位到心脏来影响心血管系统。

ANS 在维持正常心血管功能方面起着关键作用。 ANS 障碍可导致心血管系统功能障碍，进而可能导致高血压、中风或心律失常 [12,13,14,15]。流行病学研究支持吸入纳米颗粒可能诱发心血管后遗症。例如，吸入颗粒物空气污染仅仅几个小时就会通过改变人的 ANS 平衡来增加与心血管疾病相关的死亡率和发病率，尤其是那些已经存在心血管疾病的人 [16]。流行病学研究还表明，超细颗粒物 (UFP) 可能对颗粒物空气污染的心血管影响有显着影响，部分原因是超细颗粒物与细颗粒物相比，UFP 的肺泡沉积效率相对更高 [17]。沉积在传导气道中的较大的空气传播颗粒可以通过黏液纤毛自动扶梯迅速清除，这是肺部清除的主要机制。然而，纳米尺寸的粒子可能会绕过这个第一道防御系统，深入气管和肺，持续刺激感觉神经元末梢。我们之前证明吸入 MWCNTs 显着改变了心率变异性 (HRV) [10]。本研究使用大鼠模型进一步阐明肺暴露于多壁碳纳米管对心血管系统功能的影响，并将这些改变与 ANS 活性相关联。

方法

动物

来自 Hilltop Lab Animals（Scottdale，PA，USA）的雄性 Sprague-Dawley（Hla：（SD）CVF）大鼠，体重 275-300 克，不含病毒病原体、寄生虫和支原体、螺杆菌和纤毛相关呼吸道 (CAR)芽孢杆菌用于所有实验。大鼠在到达后适应 1 周，并在受控的温度和湿度条件下以及 12 小时光照/12 小时黑暗循环下饲养在过滤顶笼中。随意提供食物（Teklad 7913）和自来水。动物设施不含特定病原体、环境可控，并获得国际实验室动物护理评估和认证协会 (AAALAC) 的认可。研究期间使用的所有动物程序均已获得美国国家职业安全与健康研究所动物护理和使用委员会的审查和批准。

肺部 MWCNT 吸入暴露

MWCNT 购自 Hodogaya Chemical Company（MWCNT-7，批号 061220-31）。雄性 Sprague-Dawley 大鼠 (250–300 g) 暴露于 MWCNT 气溶胶 (5 mg/m ³ ) 5 小时。将大鼠单独放置在密封笼子中，笼子通过抗静电软管连接到主暴露室（用作本研究的混合室）。 Gilian gilair-5 R 基本空气采样泵（Sensidyne, St. Petersburg, FL 33716 USA）连接到密封笼，以将 MWCNT 气溶胶从主暴露/混合室或过滤空气（对照组）吸入密封笼流速为 1.25 升/分钟。密封笼中 MWCNT 气溶胶的粒度分布由级联冲击器（MOUDI，Models 110 和 115，MSP Co.，Shoreview，MN）确定。 MWCNT 质量浓度通过使用特氟龙过滤器的物理重量分析确定。 MWCNT 气溶胶的气溶胶生成系统、曝光室和物理特性已在其他地方进行了描述 [10, 18, 19]。使用 1.5 或 2.7% 的沉积分数和 186 毫升/分钟的平均每分钟通气量 [5]，我们的暴露方案的总肺负荷计算为 5 毫克/米 ³ （暴露浓度） × 186 毫升/分钟（分钟通气量） × 10 ^{− 6} m ³ /ml（体积换算） × 300 分钟（暴露时间） × 1.5 或 2.7%（肺泡沉积分数），在大鼠中大约等于 4.2 或 7.5 微克 MWCNT。如果工人接触 40 μg/m ³ 水平的多壁碳纳米管，只需 14 到 25 天即可达到相同的肺负荷 ,这是一种可行的人类职业暴露[19, 20]。

遥测发射器植入

手术前，将大鼠分开饲养，安静，轻拿轻放，以免遇险。手术器械和用品经过高压灭菌，并在整个手术过程中使用无菌技术。在诱导室中用 3% 异氟醚和每分钟 1 升氧气进行麻醉，并在手术过程中保持 2% 异氟醚和每分钟 1/2 升氧气。使用温控加热垫来维持大鼠的正常体温，在整个过程中通过肛门探针监测体温。心肺反应作为术中监测技术与脊髓反射一起被检查以确定适当的麻醉深度。切割切口部位，然后用聚维酮碘无菌制备，然后用 70% 酒精。做腹部正中切口，用无菌棉签暴露腹主动脉。遥测发射器 (HD-S21, Data Sciences International, St. Paul, MN) 的压力导管插入腹主动脉并引导至上游。组织粘合剂（Vetbond，3M Animal Care Products，St Paul，MN）用于固定导管并止血。遥测装置的主体位于切口左侧腹壁下方，并通过使用 4-0 不可吸收缝合线（Surgical Specialties Corporation，Wyomissing，PA）缝合到腹肌而固定到位。术后护理包括皮下注射 5 mg/kg 的美洛昔康（Metacam，Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. St. Joseph, MO）以缓解疼痛，每天一次，持续 4 天。密切监测大鼠的一般状况、体重以及食物和水的消耗量。在数据采集和吸入暴露之前，大鼠有 3 周的康复期。

体内血流动力学测量

通过放置在麻醉大鼠左心室中的压力-容积环导管评估暴露于多巴酚丁胺后对多巴酚丁胺的左心室功能。在暴露后第 1 天和第 7 天，在诱导室中用 3% 异氟醚和每分钟 2 升氧气对大鼠进行麻醉，并在手术过程中以每分钟 1 升氧气的速度维持 1-2% 异氟醚。心肺反应（心率、呼吸频率和深度）和脚趾挤压脊髓反射作为术中监测技术进行了检查。正常体温由温控加热垫维持，并在整个过程中通过肛门探头进行监测。大鼠背卧位，剪下切口，用聚维酮碘、70%酒精无菌制备。 Millar 的 Mikro-Tip® 超微型 PV 环导管（SPR-901，Millar, Inc. Houston, TX）通过颈动脉插入左心室。导管尖端在左心室中的正确位置由计算机显示器上可视化的压力-容积环波形确认。稳定 20 分钟后，使用连接到 PowerLab 4/30 的 PV 电导系统（MPVS-Ultra，Millar Instruments，Houston，TX，USA）以 1000 个样本/秒的采样率连续记录左心室功能的信号数据采集​​系统 (AD Instruments, Colorado Springs, CO, USA)。 USP 级多巴酚丁胺 (Hospira, Inc., Lake Forest, IL) 在药用无菌盐水溶液 (1.25, 2.5, 5, 10 μg/kg/50 μl) 中制备，并通过 Pump 11 Elite Programmable Syringe 通过颈静脉应用泵（Harvard Apparatus，Holliston，MA，USA）每次给药 30 秒。

数据采集与分析

在暴露前、暴露于 MWCNT 期间、暴露后 1 天和 7 天时，连续记录清醒自由活动大鼠的血压 24 小时。在暴露日，让大鼠适应室内 30 分钟，然后在暴露期间进行 5 小时（上午 9 点至下午 2 点）连续记录。收集每只动物的血压数据，然后将其导出（Dataquest ART 分析软件；Data Sciences International）到 Excel 电子表格程序（Excel 2010，Microsoft Corporation，Seattle，WA）。收缩压 (SBP)、舒张压 (DBP) 和平均血压在 5 小时暴露过程中（上午 9 点至下午 2 点）取平均值，用于比较对照组和 MWCNT 暴露组。

统计分析

使用双向（按天处理）重复测量方差分析比较数据。随后的成对比较使用 Fishers LSD 进行测试。所有数据均使用SAS软件（9.3版）进行分析，差异在p水平上被认为具有统计学意义 <0.05。图中数值表示为平均值 ± SE。

结果

在这项研究中，确定了密封暴露笼中多壁碳纳米管气溶胶的粒径分布和质量浓度。结果表明质量中值空气动力学直径为 1.4 μm（图 1），MWCNT 质量浓度为 5 mg/m ³ （数据未显示）。

MWCNT 气溶胶在密封暴露笼中的典型尺寸分布，表明质量中值空气动力学直径为 1.4 μm

在装有遥测装置的自由移动的大鼠中测量血压，并与暴露前的百分比变化进行比较。我们的结果表明，与对照组相比，MWCNT 暴露组在 5 小时暴露期间的收缩压、舒张压和平均血压均显着升高（图 2a-c）。在暴露后 1 天，尽管 MWCNT 暴露组的收缩压、舒张压和平均血压的百分比变化仍然高于对照组，但差异并不显着（图 2a-c）。在暴露后 7 天，两组之间观察到的血压没有差异（图 2a-c）。

一 条形图描绘了暴露期间和暴露后 1 天和 7 天时收缩压 (SBP) 从暴露前基础水平的百分比变化（暴露前对照与 MWCNT：127.0 ± 3.0 与 127.6 ± 1.7 mmHg）。 b 条形图描绘了暴露期间和暴露后 1 天和 7 天时舒张压 (DBP) 从暴露前基础水平的百分比变化（暴露前对照与 MWCNT：85.1 ± 2.0 对 86.9 ± 1.2 mmHg）。 c 条形图描绘了暴露期间和暴露后 1 天和 7 天平均血压 (MAP) 从暴露前基础水平的百分比变化（暴露前对照与 MWCNTs：99.1 ± 2.3 对 100.4 ± 1.4 mmHg）。每个值代表八只大鼠的平均值 ± SE。 P <0.01与对照组比较(*)

暴露于 MWCNT 后的心脏功能通过测量暴露后 1 天和 7 天的麻醉大鼠对增加剂量的多巴酚丁胺的左心室性能进行评估。结果表明，暴露于多壁碳纳米管会轻微降低基础心脏每搏输出量（SV）、每搏输出量（SW）和心输出量（CO），但显着降低每搏输出量、每搏输出量和心输出量对增加剂量的反应性。暴露后 1 天服用多巴酚丁胺（图 3、4 和 5）。在暴露后 7 天，两组之间没有观察到差异（图 3、4 和 5）。还测量了多巴酚丁胺剂量增加时的血压，对照组和 MWCNT 暴露组之间没有差异（图 6）。

线形图描绘了从暴露前基础水平的每搏输出量 (SV) 的百分比变化（暴露前对照与 MWCNTs 在 1 天后：109.3 ± 7.0 与 106.7 ± 10.4 μl，对照与 MWCNTs 在后 7 天：15.7 ±8.18。与 127.5 ± 3.7 μl）。每个值代表八只大鼠的平均值 ± SE。 P <0.01 暴露与对照组相比，暴露后 1 天 (*)

线形图描绘了从暴露前的基础水平（暴露前控制与 MWCNTs 在 1 天后：11276 ± 1165 与 11,151.7 ± 727.9 mmHg × μl，控制与 7 MWCNTs 后 7 天后 7s 5s 4s 5 MWCNTs 的变化百分比）的折线图± 893.4 vs 13,644.2 ± 536.5 mmHg × μl）。每个值代表八只大鼠的平均值 ± SE。 P <0.01 暴露与对照组相比，暴露后 1 天 (*)

线形图描绘了暴露前基础水平的心输出量 (CO) 百分比变化（暴露前对照与 MWCNTs 在 1 天后：42243.3 ± 4500.1 与 40,556.6 ± 2308.8 μl/min，对照与 7 MWCNTs 在 3 天后 4 MWCNTs：3.99s ± 2906.0 与 46,210 ± 1624.8 μl/min）。每个值代表八只大鼠的平均值 ± SE。 P <0.01 暴露与对照组相比，暴露后 1 天 (*)

线形图描绘了暴露前平均血压 (MBP) 与基础水平的百分比变化（对照与 MWCNT 在后 1 天：97.7 ± 2.8 与 98.1 ± 2.6，对照与 MWCNT 在后 7 天：102.5 ±9 ±1040。 5.5)。每个值代表八只大鼠的平均值 ± SE

讨论

自主神经系统 (ANS) 在调节心血管功能中的作用已得到充分研究 [21]。我们之前曾报道，肺部吸入多壁碳纳米管会通过增加大鼠交感神经和副交感神经系统的活动来改变心率变异性 (HRV) 并降低心率 (HR) [10]。在工人中，肺部暴露于直径小于 300 nm 的 TiO2 颗粒与 HRV 改变有关，这种变化与颗粒对自主神经系统的影响一致 [22]。相应地，一项流行病学研究证实，环境空气中颗粒物的超细成分在调节心血管自主神经活动中起着关键作用[23]。然而，肺暴露于 EN 导致自主神经系统的改变影响心血管功能的机制尚不清楚。交感神经和副交感神经系统倾向于以相互的方式起作用以调节心血管功能。然而，我们的研究结果表明，接触 MWCNTs 后交感神经和副交感神经的活动同时增加 [10]。为了阐明暴露于 EN 后 ANS 活动改变对心血管性能的影响，我们记录并分析了我们之前报道的用于研究 HRV 的相同清醒自由移动大鼠的血压 [10]。我们的结果表明，与对照组相比，MWCNT 暴露期间收缩压、舒张压和平均血压均显着升高（图 2a-c），并且在暴露后 1 天仍保持较高水平（尽管不显着）。肺暴露于多壁碳纳米管后血压显着升高不太可能是由于应激反应，因为反应在整个 5 小时暴露期间保持不变，并且与过滤空气对照不同。压力反应通常会导致战斗或逃跑反应，这是一种生理反应，血压升高，心率加快，由于对副交感神经系统的抑制作用而导致心脏收缩增强。在我们之前的研究中，交感神经系统的活动直接受到 MWCNT 吸入的刺激，这表明 MWCNT 刺激的交感神经系统活动增加是本研究中暴露于多壁碳纳米管后血压升高的原因。

在本研究中，我们的结果表明，与对照组相比，暴露于 MWCNTs 期间血压升高与清醒自由活动大鼠的心率降低有关（接近统计显着性 (p =0.054)))（数据未显示））。在暴露期间观察到的心率降低与我们之前的报告一致，即在暴露于多壁碳纳米管期间副交感神经活动增加 [10]。通过研究麻醉大鼠的基础心脏性能和对多巴酚丁胺（一种 β-肾上腺素能受体激动剂）的心脏反应性，支持了副交感神经活动增加与暴露于多壁碳纳米管后对心脏性能的影响之间存在相关性的证据。在暴露后 1 天，MWCNT 暴露大鼠的心率、心输出量和左心室收缩末压的基础心脏活动均较低，但差异未达到统计学差异（数据未显示）。副交感神经活动增加对心脏的影响进一步表明，每搏输出量、心脏做功和心输出量对多巴酚丁胺的反应降低（图 3、4 和 5）。多巴酚丁胺是一种β受体激动剂。心脏中 β 受体的激活模拟了交感神经作用。因此，心脏功能对多巴酚丁胺的反应性降低可能是由于交感神经活动的减少。然而，在本研究中，多巴酚丁胺存在时心脏功能降低更可能是由于暴露于多巴酚丁胺期间副交感神经活动增加所致，因为我们之前的研究表明，暴露于多巴酚丁胺后，清醒自由活动大鼠的交感神经活动仍然很高 [10] .尽管清醒、自由活动的大鼠和麻醉大鼠的血压和心脏功能测量存在时间差异，但清醒大鼠的心率降低以及心脏功能对多巴酚丁胺的反应性降低（图 3、4 和 5）意味着暴露于多壁碳纳米管后副交感神经活动升高及其对心脏的影响。

在这项研究中，有两种机制可能导致心率和心脏功能下降以及血压升高。一种是已经很好建立的压力感受器反射反应。第二个是吸入 MWCNTs 后心血管中枢副交感神经元输出的直接增加，正如我们之前报道的 [10]。这两种机制都涉及副交感神经系统，但途径不同。众所周知，血压升高可以通过增加压力感受器的基础动作电位产生率来刺激压力感受器，并将信号发送到孤束核 (NTS)，从而抑制血管舒缩中枢并刺激迷走神经核 [24] , 25]。最终结果是降低心率和心脏收缩力，使血压保持在狭窄的波动范围内。在我们的研究中，清醒大鼠暴露于 MWCNT 后，心率和心脏功能降低与血压显着升高有关，这可能是由于高血压触发了压力感受器反射。然而，在麻醉大鼠中，我们发现对照组和暴露组之间的基础血压没有差异（对照组与 MWCNTs：平均血压 98.6 与 97.9 mmHg），这很可能是由于麻醉的影响 [26]。与对照组相比，MWCNT 暴露组的心脏性能在基础水平上相对较弱（参见图 3、4 和 5 的图例）。有趣的是，暴露于多巴酚丁胺的大鼠的每搏输出量、心功和心输出量对多巴酚丁胺剂量增加的反应显着较弱，而同时测量的血压与对多巴酚丁胺反应的心功能没有差异。和 MWCNT 组（图 6）。这些观察排除了压力感受器反射的作用，并强烈表明肺暴露于 MWCNTs 可以通过压力感受器反射以外的机制增加副交感神经系统的活动。在另一项动物研究中也观察到碳纳米管直接刺激副交感神经活动的证据 [27]。该研究发现，气管内滴注单壁碳纳米管可降低大鼠的心率，而不会增加大鼠的血压 [27]。考虑到暴露期间的快速发作以及对 ANS、血压和心脏功能的短暂影响，我们的研究还排除了纳米颗粒诱导的炎症和纳米颗粒易位在调节心血管功能中的可能作用，并支持了肺部暴露于纳米粒子可能直接影响负责自主控制的大脑区域，进而影响心血管功能。

我们的研究表明，MWCNT 诱导的 ANS 改变对心血管系统的影响显然是基于自主神经的分布。在脉管系统中，血管主要由交感神经支配，这些交感神经中的大部分释放去甲肾上腺素 (NE)，该去甲肾上腺素 (NE) 与 α1-肾上腺素能受体结合导致血管收缩。在体内，只有少数类型的血管受副交感神经胆碱能或交感胆碱能神经支配，这两种神经都会释放乙酰胆碱 (ACh)，与毒蕈碱受体结合导致血管扩张。因此，交感神经和副交感神经活动增加的总体效果是通过血管收缩来增加血压。心脏由副交感神经和交感神经纤维支配，它们以相互的方式工作以调节心率（变时性）、收缩力（正性肌力）和松弛（向性）[28, 29]。多巴酚丁胺暴露于 MWCNTs 会导致心率减慢，每搏输出量、每搏功和心输出量减少（图 3、4 和 5），这表明副交感神经系统活动的增加在控制心率和心脏功能方面起主导作用肺暴露于多壁碳纳米管后，即使交感神经活动增加。

本研究首次报道暴露于多壁碳纳米管会引起 ANS 的改变，这会显着影响心血管功能。虽然吸入多壁碳纳米管对血压、心率和心功能的影响主要在暴露期间观察到，并且血压的短暂升高和心脏功能下降在健康动物中迅速适应，但心血管功能的这种短暂变化可能是引发心力衰竭和高血压等心血管疾病患者发生心血管事件的危险因素。最近的体内缺血/再灌注 (I/R) 研究表明，即使在没有明显的循环炎症反应的情况下，肺暴露于 MWCNT 也会显着增加 I/R 损伤 [30]。已有研究表明，自主神经系统的紊乱会增加 I/R 损伤，从而导致心脏缺血期间更多的心脏组织损伤 [31]。在心力衰竭期间，由于心肌虚弱，心脏不能将足够的血液泵送到肺进行氧气交换，也不能泵送到身体其他部位以维持适当的器官功能。在这种受损状态下，通过接触 MWCNTs 进一步增加血压和降低心脏收缩力可能会导致已经中断的心血管功能和器官灌注恶化。我们的研究清楚地表明，接触 MWCNT 可以刺激与心血管功能改变相关的 ANS 活动。我们研究的观察结果可能与美国心脏协会的结论有关，即暴露于环境空气中<2.5 μm 的颗粒物仅数小时或数周即可引发心血管疾病相关的死亡率和发病率。条件[16]。

结论

本研究中的观察结果为支持我们之前的发现和假设肺暴露于纳米颗粒会由于 ANS 活性的改变而影响心血管功能提供了基础证据。总之，我们的研究表明，暴露于 MWCNT 诱导的 ANS 改变会显着影响心血管功能。 Further studies are warranted to investigate whether the transient alterations in cardiovascular function can cause more severe adverse impact on those with pre-existing cardiovascular conditions.

缩写

CNTs:

Carbon nanotubes

CO:

Cardiac output

DBP:

Diastolic blood pressure

EKG:

Electrocardiogram

ENs:

Engineered nanoparticles

人力资源：

Heart rate

HRV:

Heart rate variability

MAP:

Mean blood pressure

MWCNTs：

多壁碳纳米管

SBP:

Systolic blood pressure

SV:

Stroke volume

SW:

Stroke work