具有强效抗肿瘤免疫刺激活性的 DNA 基纳米水凝胶

摘要

未甲基化 CpG 寡脱氧核苷酸（CpG-ODN）是先天和适应性免疫的强效激活剂，但其在血清中快速降解限制了临床应用。本研究采用多引物链式扩增（MCA）构建 CpG-MCA 纳米水凝胶，生成富含串联 CpG 重复序列的水凝胶。所得 CpG-MCA 凝胶能抵抗核酸酶降解，易被 RAW264.7 巨噬细胞内化，并强烈诱导肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 和白细胞介素-6 (IL-6) 分泌。与人胶质瘤 U251 细胞共培养时，CpG-MCA 凝胶显著抑制肿瘤细胞增殖，优于常规 CpG-ODN 和 CpG-RCA 凝胶。研究表明 CpG-MCA 纳米水凝胶是一种具有强抗肿瘤活性的生物相容性免疫刺激剂。

引言

细菌 DNA 中的未甲基化 CpG 基序通过结合树突状细胞、巨噬细胞等免疫细胞上的 Toll 样受体 9 (TLR9)，作为有效佐剂和抗癌剂。然而，CpG-ODN 易发生蛋白吸附和核酸酶消化，损害其体内稳定性和效力。封装递送载体或自组装高阶 DNA 纳米结构虽提高了稳定性和细胞摄取，但仍面临细胞毒性和载药量有限等挑战。

DNA 纳米材料——四面体、X 形晶格、水凝胶网络——相比线性寡核苷酸表现出更强的细胞内化和细胞因子诱导能力。滚环扩增（RCA）制得的纳米花水凝胶可保护 CpG 基序并增强免疫信号。在此基础上，我们采用多引物链式扩增（MCA）制备 CpG-MCA 水凝胶，含有数千个 CpG 重复并形成纳米花结构。假设这些水凝胶将提供更优的稳定性、摄取和免疫刺激，从而抑制实体瘤生长。

材料与方法

材料

所有寡核苷酸由生工生物（上海）合成并经 HPLC 纯化。MCA 和 RCA 试剂包括 φ29 DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶、dNTPs、缓冲液等（Thermo Fisher 和 NEB）。RAW264.7（小鼠巨噬细胞）和 U251（人胶质瘤）细胞系来自中国科学院。ELISA 试剂盒（R&D Systems）和 CCK-8 (Dojindo) 用于细胞因子定量和活力检测。

环状 DNA 模板制备

含 CpG 引物的磷酸化单链 DNA (ssDNA) 95°C 退火 5 分钟，冷却至 4°C。加入连接酶 4°C 过夜环化；75°C 10 分钟灭活酶。

CpG-MCA 与 CpG-RCA 水凝胶构建

取 10 µL 环状模板，混合 1× φ29 缓冲液、4 mM dNTPs、5 U φ29 聚合酶至 50 µL。30°C 孵育 12 小时得 RCA 凝胶 (R12)。MCA 方案：RCA 4 小时后加入 500 pM 引物 2 和 3，继续孵育剩余时间 (R4M4 和 R4M8)。产物 65°C 灭活，超滤纯化。

表征

琼脂糖凝胶电泳确认水凝胶形成。透射电镜 (TEM) 和扫描电镜 (SEM) 显示 100 nm 至数微米的纳米花形貌。CCK-8 评估细胞毒性；Cy5 标记共聚焦显微镜观察摄取；ELISA 检测细胞因子分泌；qRT-PCR 定量基因表达。

稳定性测试

水凝胶在 10% FBS-DMEM 或 PBS 中 37°C 孵育；NanoDrop 定量残留 DNA，琼脂糖电泳监测降解模式。

与 U251 细胞共培养

RAW264.7 细胞种于 Transwell 上室，U251 细胞置于下室。用 CpG-ODN、CpG-RCA 或 CpG-MCA 凝胶处理 24 小时后，通过克隆形成实验评估 U251 增殖。

结果与讨论

琼脂糖电泳确认环状模板形成及扩增成功：MCA 产物 (R4M4/R4M8) 和 RCA 产物 (R12) 均显示高分子量保留和纳米花外观 (TEM/SEM)。

共聚焦成像显示 CpG-MCA 凝胶被 RAW264.7 高效内化，平均荧光强度比线性 CpG-ODN 高 10 倍以上 (p < 0.0001)，表明纳米花结构赋予优越摄取能力。

稳定性研究：CpG-MCA 凝胶在 10% FBS-DMEM 中 24 小时保留 ~85% DNA，而线性 CpG-ODN 12 小时内降解 >90%，凸显水凝胶基质的保护作用。

体外免疫刺激实验：CpG-MCA 凝胶诱导 TNF-α 和 IL-6 分泌水平比 CpG-ODN 高 3-27 倍 (p < 0.0001)。R4M8 因 CpG 拷贝数更高产生最强细胞因子响应。

基因表达分析：CpG-MCA 处理细胞中 TLR9、TNF-α、IL-6 转显著上调，CD86 上调、CD206 下调，表明向促炎 M1 表型转化。

迁移实验 (Transwell 和划痕愈合) 显示 CpG-MCA 凝胶比 CpG-ODN 更强促进 RAW264.7 迁移，增强免疫细胞浸润肿瘤潜力。

与 U251 胶质瘤细胞共培养：克隆形成率显著降低，R4M8 相对 CpG-ODN 对照仅 12% (p < 0.001)，证实 CpG-MCA 诱导细胞因子释放介导的强效抗肿瘤活性。

结论

成功构建含数千 CpG 基序的 CpG-MCA 纳米水凝胶，赋予核酸酶抗性、高效巨噬细胞摄取和强效 Th1 型细胞因子诱导。体外实验证实其有效抑制胶质瘤细胞增殖，展现作为生物相容性免疫刺激剂用于癌症治疗的巨大潜力。