由 DNA 制成的强效抗肿瘤免疫刺激生物相容性纳米水凝胶

介绍

含有未甲基化 CpG 基序的细菌 DNA 是非常有前途的疫苗佐剂、抗过敏原、免疫保护剂和抗癌剂 [1]；它可以被免疫系统细胞内的内体上的受体识别，例如树突状细胞 (DC)、巨噬细胞、T 细胞、自然杀伤 (NK) 细胞和 NKT 细胞 [2]。这些先天免疫细胞能够通过将病原体相关分子模式 (PAMP) 识别为病原微生物中的病原体特异性分子，从而对未甲基化的 CpG 基序做出反应。已经证实 CpG 寡核苷酸 (CpG-ODN) 可以被 Toll 样受体 9 (TLR9​​) [3] 识别并通过 Myd88 依赖性信号通路诱导 Th1 型免疫反应 [4]。然而，CpG-ODN 的这些缺点阻碍了它的临床应用，因为它通过蛋白质吸附提前成熟，被血清中的核酸内切酶消化 [5]，以及在体内的不稳定性。这些问题有望通过将单链 (ss) 核酸封装到递送载体中或使其自组装成纳米结构来解决，以提高其在体内的稳定性以及更有效的先天免疫细胞内化率。目前，多种载体如阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）[6]、脂质体[7、8]和微粒[9]被用于递送CpG-ODN；还有一些缺点有待改进，例如其细胞毒性、加载率有限等。

由核酸组成的 DNA 材料显示出用作递送 CpG-ODN 载体的巨大潜力。与ssDNA相比，具有二维或三维结构的DNA材料表现出不同的特性，如易于穿透细胞膜和刺激巨噬细胞分泌细胞因子[10]。 X 形 DNA 被用来传递 CpG 基序，并通过增加细胞摄取成功地增加 CpG-ODN 的免疫刺激活性，而增加的细胞摄取部分是由于 X 形结构 [11]。类似地，可以自组装成具有均匀尺寸的纳米结构的三维 DNA 四面体以非侵入性方式有效地进入 RAW264.7 细胞发挥作用。更重要的是，根据研究[12]，这种四面体被证明是机械稳定且无细胞毒性的。最近，通过滚环扩增（RCA）制备的具有纳米花结构的CpG-RCA水凝胶（CpG-RCA凝胶）已被证明能够传递免疫刺激信号，抵抗核酸酶降解，增加免疫细胞因子的分泌，以及抑制人急性淋巴细胞白血病 T 淋巴细胞 (CCRF-CEM) 细胞的增殖 [13]。上述结果表明DNA材料的形状和结构在增强细胞摄取和提高免疫刺激效率方面发挥了重要作用。由于CCRF-CEM细胞来自人T淋巴细胞白血病，一种血液系统恶性肿瘤，不同于血液系统恶性肿瘤；实体瘤通常围绕着免疫抑制微环境，这会阻碍有效的抗肿瘤免疫 [14]。为此，我们通过多引物链扩增 (MCA) [15] 而不是 RCA [16] 构建了一种包含更多 CpG-ODN 拷贝的 DNA 免疫刺激剂。利用碱基互补配对的原理，在游离dNTPs存在的情况下，将CpG参与的引物和专门设计的模板序列混合到连接酶中，并通过phi29聚合酶进行延伸。 RCA (R) 或 MCA (M) 对 x 反应 或 y 小时数分别表示为 Rx 或 My（图 1）；产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定（图 2a）。基于MCA反应，由于CpG基序拷贝的大量增加，获得的产品我们称为CpG-MCA水凝胶（CpG-MCA凝胶），具有成百上千个串联CpG。 CpG-MCA 凝胶也是一种有效的免疫刺激剂，可显着增加 RAW264.7 细胞细胞因子的分泌，并有效抑制人脑胶质瘤 U251 细胞系的增殖。我们期望这项研究有助于开发一种基于DNA材料的新型纳米水凝胶免疫刺激剂，并促进其在肿瘤免疫治疗中的应用[17]。

CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶的图像。 一 CpG-RCA 凝胶（R12）和 CpG-MCA 凝胶（R4M4 和 R4M8）的琼脂糖凝胶电泳图像。泳道 1，DNA MW 标准标记物 λ-Hind III 消化；车道2，R12；车道3，R4M4；泳道 4，R4M8，泳道 5，DL5000 DNA 标记。 R12 (b ), R4M4 (c ) 和 R4M8 (d ）。 R12 (e ), R4M4 (f ) 和 R4M8 (g ）。黑色比例尺为3 μm；红色比例尺为 1 μm；白色比例尺为 500 nm

用 CpG-ODN、CpG-RCA 凝胶 (R12) 和 CpG-MCA 凝胶（R4M4 和 R4M8）（100 nM CpG 等效物）处理的 RAW 264.7 细胞的共聚焦显微镜图像和平均荧光强度。 CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶通过添加 Cy5-dCTP 用 Cy5（红色）标记以进行细胞摄取。 Cy5标记的CpG-ODN用作对照组。 一 培养 2 小时后，RAW 264.7 细胞的 CpG-RCA 凝胶和 CpG-MCA 凝胶的共聚焦显微镜图像。 b Cy5 在 RAW264.7 细胞中的平均荧光强度。结果表示为三个独立实验的平均值 ± SD。 ****P <0.0001

方法/实验

材料

所有寡核苷酸均购自生工生物技术（上海）有限公司，经高效液相色谱法纯化。 dNTP 组（每组 100 mM）、phi29 DNA 聚合酶 (10 U/μL) 和 10×phi29 DNA 聚合酶反应缓冲液（330 mM Tris-乙酸盐（pH 7.9，37 °C）、100 mM 乙酸镁 0mM 乙酸钾 0mM , 1% (v /v ) Tween 20, 10 mM DTT) 购自 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)。 T4 DNA 连接酶 (400 U/μL)、5'-三磷酸腺苷 (ATP) 和 10×T4 DNA 连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM ATP、10 mM DTT，pH 7.5，°C C) 购自 New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA)。花青 5-dCTP 购自 PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, USA)。 Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置购自 Merck KGaA (Darmstadt, Germany)。本文所用水均采用 Millipore Synergy UV 超纯水净化系统净化。 Gibco 胎牛血清 (FBS)、Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM，含高葡萄糖、L-谷氨酰胺、酚红、丙酮酸钠，不含 HEPES）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和青霉素（10000 U/mL）-链霉素 (10000 μg/mL) 购自 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)。 ELISA 试剂盒购自 R&D Systems, Inc. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 购自 Dojindo (Kumamoto, Japan)。小鼠巨噬细胞样细胞系（RAW264.7 细胞）来自中国科学院（中国上​​海）细胞库。人脑胶质瘤细胞系（U251细胞）来自中国科学院细胞库（中国上海）。

环状 DNA 模板的制备

将在 5' 端具有磷酸化基团的长单链 DNA 与等比例的 CpG-ODN 引物（引物 1）混合在 1×phi29 反应缓冲液中，在 95 °C 下退火 5 分钟，然后在使用热循环仪（Bio-Rad T100，德国）的速率为 - 1 °C/s。退火后，加入 20 U/μL T4 DNA 连接酶与 ATP 和 T4 DNA 连接酶反应缓冲液，并在 4 °C 下孵育过夜。酶在75 °C下10 分钟无活性。

CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶的制备

将环状DNA模板（10 μL）与1×phi29 DNA聚合酶反应缓冲液混合，各4 mM dNTP，加入5 U phi29 DNA聚合酶和无菌DDW，共50 μL。将混合物在 30 °C 下振荡孵育 12 小时 (R12)。对于MCA凝胶形成，在4 小时RCA反应后，然后将500pM的引物2和引物3分别加入到所得混合物中以在30 °C下孵育其余小时而不添加额外试剂（R4M4和R4M8）。 phi29 聚合酶在 65 °C 下灭活 10 分钟。超滤纯化CpG-RCA凝胶和CpG-MCA凝胶。

CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶的浓度

CpG-MCA凝胶和CpG-RCA凝胶的浓度基于治疗组中所有水凝胶中涉及的CpG拷贝数来测量。由于加入反应体系的dNTP各为4 mM，因此一个环状模板含有81个核苷酸和1个CpG拷贝。如果 Abs 是 dNTP 在 260 nm 和 ε 处的吸光度 是 dNTP 在 260 nm 处的消光系数，则可以测量反应中消耗的 dNTP，并通过以下等式计算 CpG 的总拷贝数：CpG 拷贝数 =(4 mM × 4 − Abs/ε × 1,000,000)/81 [13]。 Abs 和 ε NanoDrop 2000c测定dNTP。

琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳用于评估 CpG-MCA 凝胶的形成和降解以及圆形模板的形成。水凝胶在1%琼脂糖凝胶上以100 V运行60 min，圆形模板在3%琼脂糖凝胶上以100 V运行60 min。

CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶的表征

透射电子显微镜（TEM，Hitachi HT7700，日本）用于表征 CpG-MCA 凝胶的内部结构和大致尺寸。 CpG-MCA 凝胶在沉积在铜上并干燥之前通过超声检查 30 分钟。检测在仁济医院中心实验室进行。使用扫描电子显微镜（SEM，Hitachi SU8020，日本）获得 CpG-MCA 凝胶的形态。 CpG-MCA凝胶经超声检测30 min后沉积在干净的硅片上，样品用Au进行金属包覆。

共聚焦显微成像

细胞摄取通过徕卡共聚焦显微镜成像。 RAW264.7细胞以2 × 10 ⁵ 的密度接种在共聚焦培养皿上 细胞/毫升。用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤两次后，将细胞与 100 nM Cy5 标记的 CpG-ODN、CpG-RCA 凝胶和 CpG-MCA 凝胶在新鲜 DMEM 培养基中在 37 ° 温育 2 小时。然后用PBS洗涤细胞3次并用4%多聚甲醛固定30 分钟，然后用FITC-鬼笔环肽和Hoechst 33342染色细胞。所有图像使用Leica激光共聚焦显微镜拍摄。平均荧光强度的半定量由基于Java的图像分析应用Image J计算。

ELISA 检测

RAW264.7细胞以7 × 10 ⁴ 的密度接种 在使用前培养 24 h 的 24 孔板中的细胞数/mL。细胞在CpG-MCA凝胶和其他组存在的情况下在37 °C下孵育TNF-α8 小时，IL-6孵育24 小时；收集上清液。上清液中细胞因子水平采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，按照厂商建议方案进行。

基因表达分析

通过实时定量 PCR (Q-PCR) 测定基因表达水平。 RAW264.7细胞以1 × 10 ⁶ 的密度接种 在使用前培养 24 h 的 6 孔板中的细胞数/mL。细胞在 CpG-MCA 凝胶和其他组的存在下在 37 °C 下孵育 2 小时（对于 TNF-α 和 TLR9）和 8 小时（对于 IL-6 和其他组）。使用 TRIzol 试剂 (Thermo Fisher Scientific) 进行 mRNA 的分离和纯化。提取的 mRNA 由 NanoDrop 2000c 定量。使用带有 gDNA Eraser 的 PrimeScript RT 试剂盒（Takara Bio Inc.）逆转录 1 微克总 RNA；根据制造商的说明，使用 TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) 在 20 μL 的总反应体积中进行扩增。基因引物如下： GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9：F：ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT； R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α：F：GACGTGGAACTGGCAGAAGAG； R：TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG； IL-6：F：CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC； R：CTGTTGTTCAGACTCTCTCCCT； CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206(MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R：CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC。

划痕迁移分析

RAW264.7细胞以5 × 10 ⁵ 的密度接种70 μL 使用前 24 小时在培养插入物中加入细胞/mL。然后，小心取出插入物并洗涤细胞两次，然后用新鲜培养基中的每组处理。在0 h、6 h和24 h收集照片；伤口面积由 ImageJ 测量。每组重复3次，实验重复3次。

细胞毒性测定

使用CCK8测定细胞毒性。 RAW264.7细胞接种于96孔板中，每组处理24 h。然后每孔加入10 μL的CCK8溶液，37 °C孵育1-2 小时。 450 nm处测定吸光度，每组重复3次，实验重复3次。

U251 细胞与 RAW264.7 细胞共培养

RAW264.7细胞分别接种在上室和U251细胞分别接种在下室并在处理前孵育24 h。用 PBS 洗涤 3 次后，将新鲜培养基中的 1 μM GpC-ODN、CpG-ODN、CpG-RCA 和 CpG-MCA 凝胶分别加入上、下室中指定的时间。收集下室U251细胞进行平板克隆实验。

平板克隆形成分析

采用平板克隆实验分析与RAW264.7细胞共培养对U251细胞增殖的影响。收集下室的 U251 细胞，用含 15% FBS 的 DMEM 多倍稀释，最终数量为 200 个细胞/孔，在 6 孔培养板上继续培养 2 周，直至可观察到克隆簇。肉眼（超过 50 个细胞/克隆）。用PBS轻轻洗涤后，用4%多聚甲醛固定细胞30 min，然后用结晶紫染色1 h。包含超过 50 个细胞的簇将被包括在计数中作为成功的克隆形成。实验重复3次，每个实验设3个重复孔：克隆形成率 =（克隆形成数/接种细胞数） × 100%。

CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶的稳定性

将冻干的CpG-MCA凝胶或CpG-RCA凝胶分别放入400 μL含10%胎牛血清（10%FBS-DMEM）的DMEM中，37 ℃培养24 h； 1000 rpm离心10 s后，用NanoDrop 2000c测定上清液中DNA浓度。根据上清液中的 DNA 浓度计算剩余的水凝胶。剩余凝胶 =(m − c × V )/米 × 100%，其中 m 是我们添加的凝胶质量，c 是上清液中的 DNA 浓度，V 是上清液的体积。 CpG-MCA凝胶或CpG-RCA凝胶分别放入10% FBS-DMEM或PBS中，并在37 ℃下孵育12 小时或24 小时。孵育后，在 1% 琼脂糖凝胶上以 100 V 跑胶 60 min。

CpG-ODN

单链 CpG-ODN 由 Sangon 公司（中国北京）合成，并使用高效液相色谱 (HPLC) 进行纯化。本研究中使用的CpG-ODN为CpG-ODN 1668 [18]:5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT，非CpG寡核苷酸命名为GpC-ODN [18]:5'-TCCATGAGCTTCCTGATGCT。

统计分析

本研究中的所有数据均表示为来自两个或三个独立实验的平均值±标准偏差（平均值 ± SD）。不同组之间的统计分析是通过学生的t 测试。统计显着性设为P <0.05（95% 置信水平）。

结果与讨论

通过MCA反应成功构建了DNA免疫刺激剂[16]。在该反应中，等温扩增前的第一步也是重要的一步是长单链 (ss) 模板的环化反应（方案 1）。我们使用琼脂糖凝胶电泳来确认在退火和与引物连接后形成环状 DNA（附加文件 1：图 S1）。引物与长ssDNA模板之间的迁移距离变短，因为模板变成一个循环并与引物连接后结构发生了变化。 MCA 反应包含一串串联的重复单元，由于连续缠绕，很容易导致纳米花的出现（方案 1）。琼脂糖凝胶电泳结果表明成功获得了RCA反应（CpG-RCA凝胶或R12）和MCA反应（CpG-MCA凝胶或R4M4/R4M8）的产物（图1a）。 CpG-RCA 凝胶和 CpG-MCA 凝胶难以通过琼脂糖凝胶迁移并保持在原位。两种凝胶都太粘，所以当我们移液时，它们被拉出丝状（附加文件 1：图 S2A-C）。这些结果表明，DNA 模板与游离 dNTP 呈指数扩增以形成水凝胶 [15]。值得一提的是，CpG-RCA凝胶和CpG-MCA凝胶之间的迁移距离没有显着差异。此外，SEM 和 TEM 结果进一步表明，CpG-RCA 凝胶（图 1b、e）和 CpG-MCA 凝胶（图 1c、d、f 和 g）的直径范围从纳米级到微米级，并且表现出纳米花的形态。 CpG-ODN 需要被内化到 TLR9 阳性免疫细胞中，并与定位在免疫细胞内体中的 TLR9 相互作用以执行其免疫刺激活性。为此，我们使用 Cy5 标记的 CpG-ODN、CpG-RCA 凝胶和 CpG-MCA 凝胶，使用共聚焦显微镜研究它们在 RAW264.7 细胞中的吸收。如图 2a 所示，Cy5 标记的 CpG-MCA 凝胶有效内化并分布在 RAW264.7 细胞的细胞质中。根据测量的平均荧光强度，CpG-MCA凝胶的摄取效率显着增加（P <0.0001）与CpG-ODN（图2b）相比，证明了CpG-MCA凝胶的有效吸收，有利于发挥更强的免疫刺激作用。据报道，通过设计不同的 DNA 纳米结构，小鼠巨噬细胞 RAW264.7 细胞对 DNA 的吸收增加。如四足类结构DNA（tetrapodna）、四面体DNA（tetrahedron）和四方DNA（tetragon）[19]。同样，X 形 DNA、Y 形 DNA 和 X-DNA 水凝胶也被证明可以增加细胞对 DNA 的吸收 [20, 21]。这些结果表明，DNA 的高阶结构是递送功能化 DNA 片段的更有效形式。因此，我们推测 CpG-MCA 凝胶的高细胞摄取源于 CpG-MCA 凝胶形状通过凝胶形成的变化。然后我们测试了 CpG-MCA 凝胶的稳定性。 CpG-MCA 凝胶在不同溶液中在 37°C 下孵育不同时间。琼脂糖凝胶电泳结果显示 CpG-MCA 凝胶在 PBS 溶液中相对稳定，并且在含有血清的培养基中部分降解（附加文件 1：图 S3A）。 CpG-MCA 凝胶仍然显示为阶梯状，而不是单条带，这表明降解不完全。我们随后研究了凝胶在 10% FBS-DMEM 中的稳定性。 TEM 结果证实 CpG-MCA 凝胶被部分消化，不再看起来像花，但仍保持形状（附加文件 1：图 S2D-F）。通过检测 24 h 内上清液中的 DNA 浓度绘制 CpG-MCA 凝胶的降解曲线（附加文件 1：图 S3B）。结果表明，在 10% FBS-DMEM 中孵育 24 h 后，R12 保留了近 80%，而 R4M4 和 R4M8 保留了近 85%，这与琼脂糖凝胶电泳的结果相符。为了确认凝胶的降解，将 CpG-MCA 凝胶在 37°C 下在血清中孵育最多 48 小时，并在琼脂糖凝胶电泳中运行降解的产生（附加文件 1：图 S4）。凝胶不再像梯子，因为它们被血清中的酶消化成碎片，失去粘性，甚至变成单核苷酸碎片，这表明 CpG-MCA 凝胶是可生物降解的，因为它们可以在胎牛血清存在下被消化。 FBS）。因此，CpG-MCA 凝胶可在 24 h 内有效抵抗血清消化，并最终完全降解。抗降解能力强，有助于提高其免疫刺激效率； RAW264.7细胞上清液中TNF-α和IL-6的表达水平也清楚地表明CpG-MCA凝胶能有效刺激细胞产生免疫细胞因子。

CpG-MCA 凝胶和 CpG-RCA 凝胶的制备和细胞摄取示意图。在 5' 末端具有磷酸化基团的长单链 DNA 与由 CpG 基序组成的引物混合，首先退火并通过 T4 DNA 连接酶连接以形成环状模板。 RCA和MCA反应由phi29 DNA聚合酶进行，产生大量连续的串联DNA，像许多纳米花一样旋转。然后凝胶可以被巨噬细胞摄取并刺激细胞因子的分泌

进一步评估了 CpG-MCA 凝胶的免疫刺激功效，我们用 GpC-ODN（序列从效应 GACGTT 变为 GAGCTT）[22]、CpG-ODN、CpG-RCA 凝胶和 CpG-处理 RAW264.7 巨噬细胞MCA 凝胶，然后检测 TNF-α 和 IL-6 的表达。与 CpG-RCA 凝胶（R12）和 CpG-MCA 凝胶（R4M4 和 R4M8）孵育 8 h 的 RAW264.7 细胞上清液中 TNF-α 的浓度引起比 CpG-ODN 高得多的 TNF-α 水平。相同的处理浓度（图 3a）。对于 CpG-MCA 凝胶，R4M8 而不是 R4M4 诱导更高水平的 TNF-α 分泌（P <0.001)，表明 TNF-α 分泌随着拷贝数的增加而增强。此外，R4M8 诱导显着 (P <0.001) TNF-α 的浓度高于 R12，表明当总反应时间相等时，CpG-MCA 凝胶是比 CpG-RCA 凝胶更强大的刺激剂。在 IL-6 的检测中也发现了相同的趋势（图 3d）。 CpG-MCA凝胶和CpG-RCA凝胶刺激的IL-6分泌显着增加。 R12、R4M4和R4M8组IL-6的分泌为2.97倍(P <0.0001), 4.39 倍 (P <0.0001) 和 27.81 倍 (P <0.0001) 分别为 CpG-ODN 组。 R4M8组IL-6的分泌为6.33倍(P <0.0001) 在 R4M4 组和 9.36 倍 (P <0.001) 的 R12 组。值得一提的是，IL-6的分泌在CpG-ODN、GpC-ODN和对照组之间没有显着差异。这些结果证实，从用 CpG-MCA 凝胶而不是从 CpG-ODN 处理的 RAW264.7 细胞中观察到更高的 TNF-α 和 IL-6 释放效率。此外，还研究了不同浓度的 CpG-MCA 凝胶对细胞因子分泌的影响，我们发现 TNF-α 和 IL-6 的分泌随着凝胶浓度的增加而增加（图 3b、e）。非 CpG 凝胶（在图 3c 中表示为 R12-C、R4M4-C 和 R4M8-C）和 GpC-ODN 的免疫刺激能力结果表明它们几乎不诱导 TNF-α 的分泌（图 3c）。 3c)，表明CpG-MCA凝胶诱导的免疫反应是由CpG基序引起的。

使用 ELISA 试剂盒检测由 CpG-ODN、CpG-RCA 凝胶和 CpG-MCA 凝胶刺激的 RAW264.7 细胞释放的细胞因子。 一 RAW264.7 细胞分泌 TNF-α。 b 用不同浓度的 CpG-MCA 凝胶处理后，RAW264.7 细胞分泌 TNF-α。 c 检测 CpG 凝胶和非 CpG 凝胶（R12-C、R4M4-C 和 R4M8-C）的免疫刺激能力。 d 从 RAW264.7 细胞分泌 IL-6。 e 用不同浓度的 MCA 凝胶处理后，RAW264.7 细胞分泌 IL-6。结果表示为两个独立实验的平均值 ± SD。 **P <0.01, ***P <0.001, ****P <0.0001

接下来，我们测试了细胞因子、细胞表面标志物和 TLR-9 的 mRNA 表达。 CpG-ODN组TNF-α mRNA表达量是对照组的1.25倍，R12、R4M4和R4M8组的倍数变化为3.28倍（P <0.01), 2.53 倍 (P <0.05) 和 4.57 倍 (P <0.001) 分别在 CpG-ODN 组中测试（附加文件 1：图 S5A）。CpG-ODN 组中 IL-6 的 mRNA 表达是对照组的 1.01 倍。 R12、R4M4和R4M8组IL-6 mRNA表达量分别为3.87倍(P <0.01), 4.63 倍 (P <0.05) 和 23.04 倍 (P <0.0001) 分别与 CpG-ODN 组中的相同（附加文件 1：图 S5B）。

与对照组相比，细胞内 CpG 受体 TLR-9 的 mRNA 表达 [4] 在所有组中也有所增加，但与 CpG 相比，CpG-MCA 凝胶组显着增强了 TLR-9 的 mRNA 表达-ODN 组（附加文件 1：图 S5C）。除了细胞因子和 TLR9，我们还检测了共刺激分子 (CD) CD86 和 CD206，它们分别用于标记促炎 (M1) 和促进生长 (M2) 巨噬细胞 [23]。发现 CpG-ODN 组和对照组之间在 CD86 或 CD206 中没有显着差异（附加文件 1：图 S5D、E）。与CpG-RCA凝胶组相比，CpG-MCA凝胶组CD86不同程度升高，而CD206不同程度降低，R4M8组升高和降低幅度最大，提示CpG-MCA凝胶处理RAW264.7细胞CD86表面标志物容易分化为M1群体，进一步验证了CpG-MCA凝胶的免疫刺激能力。

巨噬细胞分泌细胞因子对免疫刺激的反应以及巨噬细胞的增殖和迁移极为重要。用 CpG-ODN 刺激巨噬细胞会通过 TLR9 依赖性途径增加抗炎细胞因子的产生。 CpG-ODN 诱导的细胞因子通过下调细胞周期负调节因子的表达来增加巨噬细胞的迁移并促进巨噬细胞的增殖 [24]。 CpG-ODN 还诱导巨噬细胞中 1 型纤溶酶原激活剂抑制剂 (PAI-1) 的表达，从而导致通过玻连蛋白的迁移增强 [25]。我们还进一步研究了 CpG-MCA 凝胶促进巨噬细胞迁移的能力并评估了它们的细胞毒性。 RAW264.7 细胞的迁移由 CpG-MCA 凝胶在 transwell 迁移系统（图 4a）和划痕迁移测定（图 4b）中诱导。在存在或不存在 CpG-MCA 凝胶的情况下培养 RAW264.7 细胞，并使其迁移 24 小时。 CpG-MCA凝胶组中巨噬细胞的迁移数量远多于CpG-ODN组（图4a）。然后，我们继续进行划痕迁移试验；允许细胞迁移24 h，并在0 h、6 h和24 h时拍照。结果表明，随着伤口愈合，划痕面积减少。 6 h 时巨噬细胞的迁移表明 CpG-MCA 凝胶比 CpG-ODN 组更有效，因为伤口愈合率更高，但在 R12、R4M4 和 R4M8 组之间没有明显意义（附加文件 1：图 S6A、B)。 24 h划痕区证实CpG-ODN组划痕区愈合率为1.70倍(P <0.05),R12、R4M4、R4M8组愈合率为1.63倍(P <0.001), 1.63 倍 (P <0.0001) 和 2.23 倍 (P  < 0.0001) of that measured in the CpG-ODN group separately. The healing rate in the R4M8 group was 1.36 times (P  < 0.01) of that in the R12 group. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).

The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. 一 The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P <0.01, ***P  < 0.001, ****P  < 0.0001

For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P  < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P  < 0.01), 15.3% (P  < 0.001), and 12.0% (P  < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.

The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P <0.01, ***P  < 0.001

Conclusions

In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.

数据和材料的可用性

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求向相应作者索取。

缩写

CpG-MCA gels:

CpG-MCA hydrogel

CpG-RCA gel:

CpG-RCA hydrogel

MCA/M:

Multi-primed chain amplification

R12:

CpG-RCA gel

R12-C, R4M4-C, R4M8-C:

Hydrogels not containing CpG motifs

R4M4, R4M8:

CpG-MCA gels

RCA/R:

Rolling circle amplification