配体掺杂的氧代氢氧化铜纳米粒子是有效的抗菌剂

背景

微生物感染导致全球数百万人死亡 [1]。通常，抗菌治疗的低效是由于微生物对常规抗生素产生耐药性 [2,3,4,5]。因此，迫切需要新型抗微生物剂。长期以来，人们都认识到铜的抗菌作用，并且可能比标准抗生素具有更长的临床寿命，因为它似乎通过多种机制来对抗细菌，包括与细菌蛋白质和 DNA 的相互作用、活性氧 (ROS) 的产生和膜完整性的破坏 [6, 7]。出于同样的原因，有人认为病原细菌菌株对铜和其他金属的抗微生物药物耐药性的可能性是有限的 [7,8,9]。此外，铜相对便宜并且对人类的毒性低，因为它在痕量水平的必要性确保了严格的稳态控制的发展 [10,11,12]。因此，这种金属通常用于预防感染措施，主要是为了避免在医院和疗养院等高风险区域的表面形成细菌生物膜 [13, 14]。相比之下，与广泛使用的银不同，铜在局部抗菌制剂中没有发现显着的治疗用途[15]。

细菌对细胞内环境中的铜负载很敏感，铜源的有效性与其释放铜离子的能力有关 [16, 17]。在这方面，基于铜的抗菌剂面临的一个重大挑战是实现浓缩配方，该配方允许将有效浓度的抗菌铜持续释放到伤口渗出液等液体中。这是因为铜是一种水解金属离子，随着其浓度在典型局部制剂的 pH 值（即接近中性）下增加，其诱导水解和形成不溶性羟基氧化物的趋势也会增加 [18]。在生理 pH 值下，这些氧代氢氧化物不是释放可溶或潜在有效的铜离子的良好底物 [16, 19, 20]。

最近，为了寻找一种生物可利用的铁补充剂，通过对初级粒子的结构修饰，解决了在生理条件下从浓缩的羟基氧化物源中有效释放三价铁离子的问题。在这项工作中，铁在掺杂晶体的 GRAS 配体（即己二酸和酒石酸）的存在下沉淀，以故意破坏最终的氧代氢氧化铁结构。该策略具有以下优点：(a) 防止氧代氢氧化铁颗粒的不可逆团聚和 (b) 在适当的生理条件下大大增加它们的不稳定性（易于溶解）。这种材料被称为“酒石酸[氧代-]氢氧化己二酸铁”或 IHAT [21, 22]。以此类推，我们在这里考虑了是否可以合成和配制高浓度的[氧代-]氢氧化己二酸铜（CHAT），但仍能以有效的抗菌水平释放铜离子。特别是，这项工作的目的是开发一种廉价且可扩展的合成工艺，该工艺可生产氢氧化铜纳米颗粒，与之前报道的材料不同，该纳米颗粒在模拟伤口环境中应易于释放杀菌浓度的铜离子。

因此，在这项研究中，我们合成了 CHAT 并表征了其提供生物可利用铜的能力，从而证明了抗菌活性。我们专注于大肠杆菌菌株 作为革兰氏阴性菌的“指示”物种 [19, 23] 但另外还证明了对金黄色葡萄球菌的原理证明作用 ，作为革兰氏阳性菌往往获得多药耐药性。因此，本研究旨在评估进一步开发CHAT在局部抗菌治疗中的临床应用价值。

方法

除非另有说明，所有实验均使用超高纯 (UHP) 水（反渗透纯化；18.2 ΩM/cm）、室温（20 ± 2 °C）进行，所有试剂均购自 Sigma Aldrich。

铜配方和 CHAT 纳米颗粒

氯化铜储备液（40 mM 铜）通过将 CuCl2·2H2O 溶解在水中来制备。氧化铜纳米颗粒（CuO NPs；Sigma 544868）原料是由商业粉末制备的，该粉末不含杂质，初级粒径为 34 nm（10-50 nm），之前作为抗微生物剂进行了测试 [24， 25,26]。通过在剧烈搅拌下将粉末分散在水中，以 1.3 g/L 铜制备这些原料。 CHAT 纳米颗粒的胶体悬浮液是使用共沉淀法合成的 [27]。简而言之，将氯化铜、酒石酸和己二酸溶解在水中，以达到最终悬浮液中铜/酒石酸/己二酸的摩尔比为 2:1:1 和铜浓度为 2.5 g/L。混合物的初始 pH 值始终低于 2.5，铜完全溶解。然后通过在恒定搅拌下逐滴加入浓 NaOH (5 M) 溶液缓慢增加 pH 值，直至 pH 值 8.2 ± 0.2。

CHAT 暂停的铜含量和相位分布

胶体悬浮液中的铜含量通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES，Jobin Yvon 2000，Horiba）测定。所有样品都在 5% HNO3 (v /v ) 分析前至少 24 小时，以确保铜完全溶解。校准标准品（0.1 至 100 mg/L 铜）在 5% HNO3 中进行基质匹配，并在 324.754 nm 处进行铜定量。通过过滤和超滤 CHAT 原料，将铜分成一定百分比的附聚、纳米颗粒和可溶性铜。过滤悬浮液（200 nm 截止），滞留物被认为是附聚部分。为了分离可溶性铜并将其与纳米微粒铜区分开来，胶体悬浮液通过 3-KDa 过滤器（Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16,000×g , 5 分钟），因为这对应于低于 1 纳米的截止（Zetasizer 软件 7.11，Malvern Instruments Ltd）。通过ICP-OES测定所有馏分（总计，200 nm滤液，3 KDa超滤液）的铜含量，馏分占总铜含量的百分比表示如下：

干 CHAT 纳米颗粒中铜含量和铜配体比的测定

CHAT 纳米粒子团聚并沉淀以能够回收和去除未结合的成分。为了实现这一点，将乙醇以 2:1 的乙醇/悬浮液 (v /v )，并通过离心 (4500×g × 15 分钟，在 Mistral 6000 中）。丢弃含有未结合配体种类的溶液相。固相CHAT中铜含量的测定如下。通过在 45°C 下将乙醇沉淀的颗粒烘干至恒重来生产粉末。然后将其研磨并获得 35.2 ± 0.3 毫克 (n =2) 在 11 ± 1 g 的 70% HNO3 中消解，并记录准确的重量。完全消化后，将该溶液在水中稀释 20 倍，并通过 ICP-OES 确定铜浓度。配体与铜的比率直接从干燥的、乙醇沉淀的 CHAT 附聚物中确定。首先将附聚物重新悬浮在水中至其原始体积，以促进用较低量的 HCl 溶解——这是高效液相色谱 (HPLC) 分析的要求。将等分试样溶解在 5% HNO3 中用于铜的 ICP-OES 分析（如上所述）或溶解在 80 mM HCl 中用于配体（酒石酸和己二酸）的 HPLC 分析。配体分析在标准反相色谱系统（配备 2998 PDA 检测器的 Waters Alliance 2690/5 中的 C18 柱；更多详细信息在附加文件 1 中提供）中进行。

CHAT 悬浮液的物理化学表征

流体动力学粒度分布通过动态光散射（DLS；Zetasizer NanoZS，Malvern Instruments Ltd）确定。将等分试样的 CHAT 胶体悬浮液（2.5 g/L 铜）转移到 1 mL 一次性比色皿中，并测量 (n =3) 在 25 ± 2°C 下进行。同样，附加文件 2 中显示了确切的设置。 CHAT 悬浮液的 zeta 电位是通过激光多普勒微电泳（Zetasizer NanoZS，Malvern Instruments Ltd）使用一次性折叠毛细管细胞 (DTS1070) 确定的，并假设介电常数为 78.5 和0.89 cP 的粘度。将一滴 CHAT 悬浮液应用于多孔碳穿孔网格并在 50°C 下干燥过夜，进行透射电子显微镜 (TEM) 表征。然后在 TEM（FEI-Philips CM100）上以 120 kV 的明场模式对网格成像。

铜制剂的抗菌活性

测定在重金属 MOPS (HMM) 培养基中进行，这是一种公认​​的金属离子相容培养基（附加文件 3），其中补充有 0.4% 葡萄糖和 0.1% 酪蛋白酸水解物，并将 pH 值调整为 7.2 ± 0.2 [28] .在添加铜化合物之前，大肠杆菌 (NCTC11100) 和 金黄色葡萄球菌 RN4220 [29] 在 Infors HT Minitron 培养箱中以 80 rpm 的速度持续摇动，在 30°C 下生长过夜。之后，将细菌悬液稀释至光密度为 0.05-0.1（约 10 ⁶ 细胞/mL）在 595 nm 处用于 E。大肠杆菌 ( Multiskan RC 351 Labsystem) 或 600 nm for S。金黄色葡萄球菌 （Multiskan 读板机，ThermoFisher Scientific）。接下来，将氯化铜和胶体 CHAT 原液在 HMM 中稀释并添加到细菌悬浮液中以获得介于 0.4 和 100 mg/L 之间的最终铜浓度。然后孵育 6 到 9 小时，通过监测光密度作为细菌生物量的量度来确定细菌生长。

通过将 HMM 中的氯化铜和胶体 CHAT 储备液稀释至 12.5、25 和 50 毫克/升铜，并通过超滤确定 0、2、4 和 8 小时时可溶性铜的分数，确定铜在细菌生长培养基中随时间的溶解度(3 KDa) 和 ICP-OES 分析，如上所述。

铜制剂的细胞内生物利用度

重组生物发光铜感应细菌，E.大肠杆菌 MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux)，通过增加其生物发光来响应亚毒性量的生物可利用铜，用于量化铜化合物的生物利用度 [30]。如抗微生物活性测定所述制备细菌悬浮液，并在 96 孔微孔板上与一系列氯化铜和 CHAT（0 至 50 毫克/升铜）稀释液一起孵育 4 小时。使用 Orion II Plate Luminometer (Berthold Detection Systems) 测量生物发光，生物发光的诱导计算如下：

铜制剂诱导的细胞内压力

铜化合物诱导细胞内超氧阴离子和单链 DNA 断裂的能力用重组生物发光细菌 E.大肠杆菌 K12::soxRSsodAlux 和 E。大肠杆菌 MC1061 (pDEWrecAlux) [17]。如抗微生物试验所述制备细菌培养物，并将细菌暴露于白色 96 孔微孔板上的一系列氯化铜和 CHAT（0 至 50 毫克/升铜）稀释液中 4 小时。通过将细菌暴露于诱导超氧阴离子的化学物质甲萘醌 (0.04–30 μg/L) 或过氧化氢 (0.1–150 mg/L) 中来控制生物传感器的性能，作为 E 的阳性对照。大肠杆菌 K12::soxRSsodAlux 或 E。大肠杆菌 分别是 MC1061 (pDEWrecAlux)。同样，细菌在白色 96 孔微孔板上培养，用 Orion II Plate Luminometer 测量生物发光，如方程式 1 中计算生物发光的诱导。 5.

在羟乙基纤维素凝胶中加入铜制剂

将氯化铜、CHAT 和商业未改性氧化铜纳米粒子 (CuO NP) 的库存在 UHP 水中稀释至 250 mg/L 铜。所得 CHAT 和 CuO NPs 的悬浮液处于接近中性的 pH 值，可以直接掺入凝胶中，但氯化铜溶液在稀释后仍呈酸性，因此将 pH 值调整为 7.0 ± 0.2。然后将羟乙基纤维素 (HEC) 直接溶解 (2% w /v ) 使用滚筒混合器 (Denley Spiramix 5) 加入各种稀释的原料中，直到形成均匀的凝胶。将 10 克每种凝胶转移到 Falcon 管中，并使其静置过夜。接下来，小心地将 10 mL 新鲜制备的 50 mM 碳酸氢钠缓冲液（从 NaHCO3 粉末中溶解并调节至 pH 7.0 ± 0.2）转移到每个管中，以尽量减少凝胶-液体界面处的干扰（7.1 cm² ）。然后收集等分试样并通过 ICP-OES 进行分析，以确定铜随时间的释放。

结果

如“方法”部分所述，CHAT 的合成方式与其铁类似物 IHAT [21, 22] 类似，方法是用酒石酸和己二酸掺杂羟基氧化铜（2.5 g/L 铜）。这产生了稳定的胶体悬浮液，其中所有铜通过 200 nm 过滤器，但很少 (5%) 通过 3-KDa 过滤器。这表明大多数铜是纳米颗粒（95%；图 1a），几乎没有“游离”铜，也没有可检测到的大团块——再次像 IHAT 类似物 [21, 22]。当在乙醇中沉淀以去除未结合的配体种类，然后干燥时，CHAT 含有 31 ± 1% 的铜 (w /w ) 通过 ICP-OES 分析。铜与配体摩尔比，后者由 HPLC 测定，铜与酒石酸盐为 2:1，铜与己二酸为 2:0.3。通过 TEM 成像，CHAT 颗粒看起来几乎是单分散的，直径为 2-3 nm（图 1b）。这些发现与 CHAT 加水合壳的流体动力学尺寸数据一致，因为 UHP 水中的体积中值直径为 3.4 nm（图 1c）并且尺寸分布很窄（80% 的体积为 2.4-5.6 nm）用动态光散射评估。平均 zeta 电位为 - 39 mV（图 1d），与形成稳定水分散体的纳米粒子一致 [27]，并且事实上，CHAT 悬浮液显示稳定数年（附加文件 4）。

CHAT 原液的表征。 一 2.5 g/L CHAT 时的铜相分布：可溶 (<3 KDa) 和纳米颗粒百分比。 b TEM 纳米粒子分散成像。 c 新鲜制备的颗粒的流体动力学粒度分布，由动态光散射测定。 d Zeta 电位分布 (n =3;误差棒代表标准偏差）

接下来，我们考虑了当股票悬浮液在细菌生长培养基中稀释到与铜盐的抗菌活性相关的浓度时 CHAT 的抗菌活性。对于 CHAT 和氯化铜，两种大肠杆菌的生长抑制曲线非常相似。大肠杆菌 和S。金黄色葡萄球菌 大多数活性发生在总铜浓度介于 12.5 和 50 毫克/升之间（图 2）。完成E。大肠杆菌 在与 18.8 (CuCl 2 ) 和 25 (CHAT) mg/L 铜一起温育时观察到生长抑制，而对于S。金黄色葡萄球菌 ，在 75 (CuCl2) 和 100 (CHAT) mg/L 铜下获得了完全的生长抑制（图 2；附加文件 5 中提供了生长抑制百分比与铜浓度的关系）。

大肠杆菌 （顶部）和金黄色葡萄球菌 （底部）在补充 HMM 中暴露于不同浓度的氯化铜（左）或 CHAT（右）后的生长曲线，此处表示为光密度。

事实上，在这些抗菌浓度下，至少 94% 的 CHAT 被快速溶解（在 15 分钟内），再次通过超滤和 ICP-OES 分析判断（图 3a）。因此，我们预计 CHAT 的抗菌效力与这种化学不稳定性有关，纳米粒子的快速溶解允许细胞内细菌获得铜离子。为了测试这一点，我们挑战了 Cu 传感 E。大肠杆菌 , MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux)，其中生物发光随着细胞内铜离子的亚毒性浓度而增加 [30]，含有 0 至 50 mg/L 的铜，如 CHAT 或氯化铜。两种铜源在培养基中的浓度增加导致大肠杆菌中的生物发光增加。大肠杆菌 铜传感器应变（图 3b），与细胞内铜的升高一致。两种铜来源的剂量反应曲线的斜率相同，高达 6.25 毫克/升，证实来自 CHAT 的生物可利用铜与完全溶解的来源相当。此后，在铜浓度高达 50 毫克/升时，由于两种铜化合物的毒性，发光没有增加（图 3b）。

一 CHAT 在 12.5、25 和 50 mg/L 铜的补充 HMM 中的溶出曲线。重组发光细菌生物发光诱导的剂量反应：b 细胞内铜离子反应 E.大肠杆菌 MC1061 pSLcueR/pDNPcopAlux 细菌，c DNA 损伤反应 E.大肠杆菌 MC1061 (pDEWrecAlux) 和 d 超氧阴离子响应E.大肠杆菌 K12::soxRSsodAlux 在补充的 HMM 中暴露于氯化铜、CHAT（以 mg Cu/L 为单位的浓度）和相应对照（c 中的甲萘醌）中 4 小时后 和 d 中的 H2O2 )

与在E中研究细胞内铜平行。大肠杆菌 暴露于用 CHAT 或氯化铜制备的溶液中，我们还测试了这些溶液在不同大肠杆菌中触发细胞内超氧阴离子或引起细菌 DNA 损伤的能力。大肠杆菌 基于生物传感器。尽管传感器分别响应相关的阳性对照，即过氧化氢和甲萘醌（图 3c、d），但在这两种情况下都没有明显的可观察效果。总之，三种细菌生物传感器对由不同化学形式的铜制备的溶液的等效响应强烈支持这样一种观点，即在这两种情况下，细菌都暴露于相同的可溶性铜中，尽管一种配方最初是纳米颗粒。

最后，如上所述，CHAT 相对于可溶性铜盐的优势只有在浓缩制剂允许前者与后者不同而保持其化学不稳定性时才会明显。使用羟乙基纤维素 (HEC)，一种用于局部制剂的常见水性基质 [31,32,33]，我们将 250 mg/L 铜作为氯化铜、CHAT 或作为商业 CuO NPs 加入。当将 10 mL 的 50 mM NaHCO3 缓冲液（作为简化的伤口渗出液）添加到 10 g 每种掺铜 HEC 凝胶（即 2.5 mg 铜）中时，含 CHAT 的制剂中会持续释放铜，从而24 小时后大于 60 毫克/升（图 4）。此外，释放速度相对较快，抗菌活性浓度在 2-4 小时内达到。相比之下，pH 中和的氯化铜是铜释放的不良底物，正如预期的那样，它倾向于水解并形成氧合铜的附聚物，因此到 24 小时，溶液中仅达到 10 ± 7 毫克/升的铜（图 4）。商业化的 CuO NPs 根本没有产生可辨别的铜释放（图 4）。

铜从含有 CHAT、氯化铜或氧化铜纳米颗粒 (CuO NPs) 的 HEC 基质中释放，铜含量均为 250 毫克/升

讨论

我们在这里展示了一种铜基纳米材料，即 CHAT，可以以高浓度配制，与之前描述的铜基纳米颗粒 [34, 35] 不同，同时保留其作为具有抗菌功效的生物可利用铜的不稳定来源的特性。如上所述，CHAT 的合成受到了之前对铁类似物 IHAT 多年工作的启发 [21, 22]。反过来，这受到大自然解决体内矿物质快速周转的启发，以有效回收必需的金属离子，从而使用有机分子破坏原生矿物颗粒的晶体结构 [21, 22]。在合成版本中，当 GRAS 配体在溶液中由交联聚合物形成时，它们被掺入金属氧代氢氧化物中 [21, 22]。通过结构不稳定，这确保了最终矿物相的不稳定性，并产生了高度负性的纳米粒子——正如 zeta 电位测量所证明的那样——它们排斥团聚和聚集，从而产生稳定多年的纳米粒子悬浮液。在这里，正如之前对 IHAT 所显示的那样，酒石酸盐是实现这些对羟基氧化铜结构的物理化学变化的主要配体，因为它的掺入时间约为。比己二酸高 3 倍——后者在合成过程中更能作为缓冲剂 [21, 22]。

在没有改性的情况下，新沉淀的金属氧代氢氧化物将附聚和聚集并开始老化，从而冷凝并逐渐增加其结晶度。这些尺寸和矿物相变降低了结构参与逆反应（即重新溶解）的能力。因此，毫不奇怪，当氯化铜溶液的 pH 值中和新鲜形成氧合氢氧化铜时，我们的凝胶释放试验中至少会释放一些可溶性铜（图 4），而对于商业化的 CuO NP，附聚并包含更浓缩的矿物相（即氧化铜），释放出检测不到的铜。商业 30 nm 纳米粒子不溶解——无论它们的聚集状态如何，都会呈现出较大的溶解表面积——表明矿物相是铜离子释放的关键驱动因素，并且如上所述，改性在此通过配体掺杂实现的矿物初级颗粒的分离，确实需要带来溶解特性的显着转变。此外，CHAT 的合成是在室温下进行的，因为高合成温度有利于较少的无定形相，因此可能会降低溶解速率。此外，室温合成还有利于降低大规模制造时的能源成本。

虽然可能有其他方法来配制高、稳定浓度的铜，以便在需要时能够持续释放和快速溶解离子，但我们无法设想另一种如此简单且商品（反应物）成本如此低的合成方法。这些都是重要的因素，因为局部感染和细菌耐药性问题绝不仅限于发达国家。发展中国家越来越受到细菌耐药性问题的困扰，因此迫切需要负担得起的有效解决方案 [36, 37]。尽管没有足够的研究来得出具体的解决方案，但有证据表明，细菌对有毒金属离子的抗性比对常规抗生素的抗性更难实现 [7]。该理论基于以下观点：铜和银可能没有独立的抗菌活性途径，而是可以影响包括各种酶系统在内的多个目标，从而破坏整个细菌细胞结构 [17, 19, 38]。事实上，尽管暴露了几个世纪，细菌仍然对铜和某些其他金属离子敏感 [6, 7, 39]。有趣的是，最近有证据表明，尽管先前存在耐药性，但基于金属的抗菌剂甚至可以使细菌对常规抗生素的敏感性恢复[40, 41]。

结论

在这里，我们已经证明，在生理 pH 值和高浓度下，生物可利用铜离子的问题可以通过用有机酸掺杂铜纳米矿物质来解决，其策略与之前用于铁类似物的策略类似 [21, 22]。这些铜基纳米粒子（称为 CHAT）容易溶解在细菌培养基中，显示出与可溶性铜盐相当的细胞内铜吸收和抗菌活性。然而，关键的是，与简单的铜盐不同的是，CHAT 可以浓缩在 pH 中性的配方中，并在铜离子释放方面保持其不稳定性。事实上，CHAT 释放的铜离子在杀菌范围内，因此可以作为一种新型的局部抗菌剂的基础，可以单独使用，也可以增强抗抗生素的功效。随着抗生素耐药性的增加，需要新的局部抗微生物剂，而 CHAT 价格低廉、易于合成，并且使用通常被认为是安全的 (GRAS) 成分。体内研究是值得的。

缩写

聊天：

[氧代]-氢氧化己二酸酒石酸铜纳米颗粒

CuO 纳米颗粒：

氧化铜纳米粒子

DLS：

动态光散射

大肠杆菌 ：

E。大肠杆菌

GRAS：

一般认为是安全的

HEC：

羟乙基纤维素

HMM：

重金属MOPS培养基

HPLC：

高效液相色谱

ICP-OES：

电感耦合等离子体光发射光谱法

IHAT：

[氧代]-氢氧化己二酸酒石酸铁纳米颗粒

MOPS：

3-(N -morpholino)丙磺酸

金黄色葡萄球菌 ：

S。金黄色葡萄球菌

超高压：

超高纯度