利用酸模根提取物绿色合成Au@Ag核壳纳米颗粒用于抗菌应用

摘要

本研究采用分步法合成金银双金属核壳纳米颗粒（Au@AgNPs）。利用富含儿茶素和芪类的酸模（Rumex hymenosepalus）根提取物（Rh）作为还原剂。透射电镜（TEM）粒径分布显示：Au@AgNPs平均直径36±11 nm，金纳米颗粒（AuNPs）24±4 nm，银纳米颗粒（AgNPs）13±3 nm。形态以准球形为主。银壳厚度约6 nm，表面被活性生物分子覆盖。表征包括高角环形暗场像（HAADF-STEM）、能谱（EDS）、X射线衍射（XRD）、UV-Vis光谱、Zeta电位、动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS），证实纳米颗粒由提取物分子稳定。采用Gompertz模型分析微生物暴露纳米材料的生长动力学。结果表明，AgNPs和Au@AgNPs以剂量依赖方式影响大肠杆菌（E. coli）和白色念珠菌（Candida albicans）的滞后期和生长速率，Au@AgNPs响应更优。

引言

过去25年研究了多种化学法合成纳米材料，但多使用不环保物质、高温或昂贵设备。本研究采用绿色合成法制备金银纳米结构，从源头减少污染，避免有害污染物，开发不威胁健康环境的"洁净"纳米材料。

绿色合成金属纳米颗粒旨在实现与生物系统的正向互作：纳米颗粒与多酚分子自功能化产生的生物互作，与细胞和大分子系统相容。这些互作常用于癌症、糖尿病、神经退行性疾病的纳米医药。银壳/AuNPs核壳系统在光学诊断传感器、分子传感器、光热治疗、抗菌及改进催化过程[1-6]等方面优于单金属NPs。

双金属合成采用顺序或同步法、不同反应器、化学/物理法[7]：超声喷雾热解[8]、声化学法[5]、微流控芯片[9]、顺序纳米流体沉淀[10,11]、微乳液[12]、脂质体[13]；还原剂分化学或绿色化学类。干法材料用于纳米合成如金属氧化物[14]、碳纳米管[15,16]、印刷软电子器件[17]；湿法纳米材料用于生物系统[18-20]、药物载体[21,22]、抗菌[23,24]、传感[25]；计算纳米技术为现代分类[26]。

Khatami等综述植物绿色合成核壳纳米颗粒，用< i>Antigonon leptopus、Diopyros kaki、Azadirachta indica、Potamogeton pectinatus、Anacadium oceidentale合成5-500 nm Au@Ag NPs（非抗菌应用）；Asparagus racemosus根提取物合成Au-Ag合金NPs，在E. coli、B. subtilis、K. pneumoniae、P. aeruginosa、S. aureus中MIC为480 μg/mL[27]。化学合成Au@Ag NPs作抗菌，银含量MIC约2.5 μg/mL[28]；Lu等化学合成Au/AgNPs@Van（NaBH₄还原+万古霉素），双金属NPs在革兰氏阳/阴性菌中MIC 60 nmol/mL[29]。

双金属纳米材料抗菌性随Ag浓度增加而增强[30-34]；反之Au浓度增加降低抗菌性但减弱细胞毒性，即双金属材料生物相容性更好[35]。对比单金属与双金属材料[36-40]，证实双金属间存在协同效应[41]，产生双功能效应[28,42]。

纳米材料功能化受化学环境[43-45]（pH、硫存在、生物相容分子等）影响，进而影响与细胞/微生物互作；故强调绿色化学制备生物材料[46-55]。双金属颗粒化学组成[56-58]决定光学性质[41,59]，源于单金属纳米结构协同效应[60]。

本工作用Rumex hymenosepalus提取物作还原剂合成金银纳米颗粒，该植物含芪类和儿茶素分子，作为强抗氧化剂还原金属离子。AuNPs作核通过顺序法制备Au@Ag核壳双金属NPs。表征涉及HAADF-STEM、TEM-EDS、HRTEM。对比三种纳米颗粒对E. coli、S. aureus和Candida albicans生长动力学的影响。

实验部分

材料

Rumex hymenosepalus根购自当地商业机构。前驱体HAuCl₄和AgNO₃（99%纯度）购自Sigma-Aldrich。脑心浸出液（BHI）肉汤和马铃薯葡萄糖肉汤（PDB）用于微生物实验，购自Sigma-Aldrich。乙醇（99%）用于纳米颗粒清洗，购自Fermont；超纯水（Milli-Q）用于实验。

酸模提取物制备

150 g切片脱水根浸泡于1000 mL 70/30 (V/V) 乙醇/水混合液。室温避光密封玻璃容器中浸提21天，监测吸光度稳定后终止。依次用8 μm、2 μm沃特曼滤纸和0.22 μm针式滤器过滤。旋转蒸发除乙醇，水相浓缩液-80°C冷冻，冻干（Labconco FreeZone 1L）得粉末，避光室温无菌容器保存备用。

AuNPs合成

冻干粉配制10 mg/mL水溶液。16 mL提取液混合32 mL超纯水，1000 rpm搅拌下缓慢加入16 mL HAuCl₄（0.01 M）。室温室内光照反应1 h。UV-Vis监测表面等离子共振（λSPR=540 nm）强度随时间变化，无变化视为反应结束。12,000 rpm离心，上清替换为超纯水，超声1 h重分散，重复3次（前两次水、最后一次乙醇）。乙醇分散液离心，沉淀40°C对流烘箱干燥，最终配制2300 μg/mL AuNPs水分散液。

Au@AgNPs合成

无菌玻璃培养管中加入2 mL AuNPs水分散液（2300 μg/mL）、0.8 mL AgNO₃（0.1 M）、0.8 mL提取液（10 mg/mL）。超声清洗器（Branson 2510）超声3 h。12,000 rpm离心1 h，固体重分散于超纯水得1000 μg/mL浓度。

AgNPs合成

16 mL提取液（10 mg/mL）混合64 mL超纯水，加8 mL AgNO₃（0.1 M）。25°C室内光照反应1 h，UV-Vis监测λSPR=440 nm随时间变化。同AuNPs纯化流程：离心、换水超声、重复3次（前两次水、最后乙醇），乙醇分散液离心干燥，最终超纯水超声重分散得2000 μg/mL胶体分散液。

表征方法

UV-Vis吸收谱：PerkinElmer Lambda 45双光束光谱仪，狭缝0.5 nm，扫描速度480 nm/min，200-900 nm。纳米颗粒50 μL，提取物仅5 μL，超纯水定容3 mL石英比色皿。

Zeta电位：Zetasizer-Nano ZS（Malvern，UK），室温25°C三次测定，浓度1、10、50、100 μg/mL。

DLS：同仪器，633 nm He-Ne激光，同条件测定。多分散指数(PDI)= (σ/D̄)²，D为平均直径，σ为标准差。PDI≤0.1视为高度单分散[62]。

光学带隙：Tauc方程计算AgNPs、AuNPs、Au@AgNPs带隙。α = c/hν (hν - Eg)^(1/n) （式1），α为吸收系数（α=2.303 A/d，A吸光度，d比色皿宽度），Eg为光学带隙，hν光子能量。n=2对应允许直接跃迁[63]，可线性拟合求得[64]。n取1/2、2、3/2、3分别对应允许直接、允许间接、禁阻直接、禁阻间接跃迁[65]。

FTIR：PerkinElmer Spectrum Two，分辨率4 cm⁻¹，16次扫描，4000-900 cm⁻¹。

XPS：PerkinElmer PHI 5100，Mg/Al双靶，300 W，15 kV。Mg Kα线（1253.6 eV）用于AgNPs、AuNPs、Au@AgNPs和Rh。真空2×10⁻⁹ Torr[66]。MultiPak软件分析。样品滴加于载玻片干燥，重复≥5次成薄膜后表征。

HAADF-STEM：像差修正HAADF-STEM提供原子分辨率化学敏感性和空间分辨率[67,68]。JEOL-JEMARM200（200 kV，CEOS球差校正器），32-36 mrad聚敛角，9 pA探针。BF和HAADF同步记录。

电镜样品制备：10 μL Au@AgNPs悬浮液滴加300目厚碳膜铜网，室温干燥，真空室放置24 h。

TEM：JEOL 2010F（1.9 Å，200 kV）。EDS：QUANTAX 200-TEM X射线谱仪（Bruker，XFlash 4010探测器）。HRTEM：>100,000X放大，Digital Micrograph 3.0 (Gatan)分析晶面间距。制样同STEM。

XRD：Bruker D8 QUEST，多层膜单色器，Cu Kα微焦点封闭管（λ=1.54178 Å）。300 K下ω/φ扫描收集帧，处理得强度-2Theta衍射图。High Score Plus软件处理，ICSD粉末衍射数据库检索匹配相位鉴定。

抗菌活性测定

测试菌株：E. coli (ATCC 25922)、S. aureus (ATCC 5538P)、C. albicans（成年男性尿路感染尿液分离，遵循赫尔辛基宣言）。BHI和PDB配制细菌和酵母菌悬液，37°C过夜培养。UV-Vis测OD540（细菌）和OD600（酵母）确定CFU/mL。浓度分别为4×10⁸、7.8×10⁸、2.5×10⁶ CFU/mL。96孔板液体培养基加纳米颗粒和微生物，37°C培养，三次重复。Synergy HTX Biotek多模式酶标仪（Gen5软件）测吸光度。Origin Lab 8.0分析生长曲线。步骤：70 μL新鲜培养基混合纳米颗粒加孔，后加30 μL菌液混匀，终体积100 μL/孔。接种后即时读数，37°C圆周振荡（每读数前振荡15 min），周期15 min。OD测定生长速率。

Gompertz模型分析生长曲线

Gompertz模型良好描述微生物种群生长[69]，可量化适应期（滞后期）和种群生长速率。研究滞后期行为对抑制治疗至关重要，可提供微生物适应性响应信息，甚至提示耐药性发展[69]。Zwietering等[70]描述修正Gompertz模型，Li等[69]及其他作者[71-78]改良适配生长曲线：

y = A exp{-exp[μe/A (λ - t) + 1]} （式2）

A为细胞数（OD540对S. aureus/E. coli，OD600对C. albicans），μ为指数期生长速率，e为自然对数底，λ为滞后期。Origin 9.1软件拟合分析AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs对三种微生物的影响。

纳米颗粒对E. coli、S. aureus、C. albicans生长的影响

E. coli和S. aureus接种BHI，C. albicans接种PDB，36°C过夜。调整吸光度至1、0.7、1（λ=540 nm）。三种纳米颗粒调至50 μg/mL。96孔板按7:3体积比混合培养物和纳米颗粒，终体积200 μL/孔。同条件设无菌水对照。对照组含新鲜培养基和无菌纳米颗粒悬液。1、7、13、19 h取样，梯度稀释涂布Müller-Hinton平板，36°C培养24 h计数CFU/mL。

最小杀菌浓度（MBC）测定

三菌株分别接种Müller-Hinton肉汤，36°C过夜，调至0.5 McFarland浊度。MIC测定用微量稀释法：96孔板每菌5孔各加160 μL调菌液。配制1000 μg/mL纳米颗粒母液，稀释得750、500、250 μg/mL。无菌水作0 μg/mL对照。各浓度40 μL加入160 μL菌液，终浓度200、150、100、50、0 μg/mL。36°C培养24 h，各孔取样涂布平板同条件培养。观察无生长信号的浓度记为MBC值。

结果与讨论

表征

图1a显示合成纳米材料UV-Vis吸收谱，吸光度按各纳米颗粒体系局域表面等离子共振（LSPR）最大值归一化。

Au@AgNPs吸收谱（图1a）单峰居中474 nm，位于AgNPs LSPR（445 nm）和AuNPs LSPR（544 nm）之间。Au@AgNPs无金特征吸收峰，提示顺序合成得核壳结构。文献[79,80]指出核壳体系壳厚3-4 nm时吸收谱含双峰；壳更厚时核吸收消失，仅剩单峰，峰位取决于壳厚/核尺寸比。Samal等[81]控制核尺寸和壳厚合成Au@Ag核壳NPs，本结果与其32 nm金核、银壳>15 nm时结果一致：单吸收带（~450 nm），Au表面等离子体被抑制。

图1a中280 nm处吸收（蓝色高亮区）对应Rumex hymenosepalus提取物分子（补充图S1）。提取液特征带278 nm，归属多酚类芳香环与羰基共轭电子跃迁[82]。纳米颗粒谱中此带表明产物含残留提取物分子。Rivero-Cruz等[83]从R. hymenosepalus分离4种芪类、2种黄烷-3-醇、3种蒽醌；Rodríguez-León等[61]核磁共振确定含芪糖苷、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等重要分子。这些分子作为还原剂参与合成：酚羟基去质子化形成羰基，多酚氧化释放电子还原Ag⁺/Au³⁺生成Au⁰/Ag⁰。

Zeta电位（图1b）：全浓度范围纳米颗粒电位均<-30 mV，100 μg/mL时AuNPs和Au@AgNPs达-40 mV，AgNPs -38 mV。高负值表明颗粒间强排斥防止团聚，胶体长期稳定[84-86]。结合UV-Vis，高负电位可能源于提取物多酚分子表面络合[87]。

生物应用需单分散尺寸群体[88]。DLS平均直径和PDI（图1c,d）：Au@AgNPs平均~250 nm随浓度恒定；AuNPs和AgNPs分别~122和135 nm。PDI单金属~0.3，Au@AgNPs~0.2。尺寸随浓度不变表明各体系稳定性好，呈中等多分散性（0.2≤PDI≤0.3）。

Tauc图计算光学带隙（补充图S2）。半导体导带Eg<3 eV（参考：Ge<0.7 eV，Si=1.1 eV[89]）。本研究Au@AgNPs、AuNPs、AgNPs带隙分别1.93、2.03、2.33 eV，属半导体性质，量子限域效应增大带隙，可用于传感器、电池、光电器件[64]。

XPS和FTIR确认有机物存在（图2）。全谱扫描（图2a）：所有纳米体系均呈现碳(C 1s, 284.6 eV)和氧(O 1s, 532.2 eV)特征信号，来自提取物，证实有机分子存在于纳米材料中。高分辨XPS分析Ag、Au氧化态（补充图S3）。AgNPs：373.76和367.76 eV（ΔBE=6.0 eV）对应3d3/2和3d5/2，属金属银Ag⁰。AuNPs：4f5/2峰87.65 eV，4f7/2峰83.98 eV，强度比(I4f7/2>I4f5/2)、位置和分离(ΔBE=3.67 eV)确认Au³⁺完全还原为Au⁰[90]。Au@AgNPs银和金高分辨谱（补充图S3C,D）行为同单金属对应物，证实核壳结构中银金均为零价。

FTIR（图2b）：3296 cm⁻¹羟基，2974 cm⁻¹芳香环C-H，1689 cm⁻¹羰基C=O伸缩，1689-1400 cm⁻¹羧酸盐C-O和C-C伸缩，1212 cm⁻¹与AuNPs络合的酚C-O伸缩，1049 cm⁻¹儿茶酯C-O伸缩[88-90]，799 cm⁻¹酚平面外弯曲，964.4和829.39 cm⁻¹白藜芦醇特征[91]在Rh提取物中移至1031和867 cm⁻¹，AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs也相应位移，指示Rh提取物多酚分子与纳米颗粒络合。

STEM表征核壳结构（图3）。低倍明场（图3a，标尺100 nm）显示无团聚、准球形颗粒群。同区暗场HAADF（图3b）清晰显示核壳结构：Au核因原子序数大显更亮，Ag壳对比度较弱。高倍明/暗场（图3c,d，标尺20 nm）清晰显示闪亮Au核和浅对比Ag壳，壳厚3-5 nm变化。补充图S4展示单颗粒图库，Ag壳均匀。

TEM形貌及粒径分布（图4）。AuNPs、AgNPs、Au@AgNPs均呈球状、分离良好（图4a,c,e），提取物分子作间隔层防止团聚。500颗粒统计直方图（图4b,d,f）呈高斯分布：AuNPs 24±4 nm，AgNPs 13±3 nm，Au@AgNPs 36±11 nm。DLS与TEM尺寸差异源于微环境：DLS测含水合层和溶剂的体系直径，TEM测干燥金属核；络合分子作分散剂致DLS结果偏大[91]。

HAADF-HRTEM单颗粒分析（图5）。单颗粒Au核Ag壳界面清晰（图5a），原子序数变化可HAADF量化[67]。红框放大得壳部HRTEM（图5b），数字微影软件分析周边区（虚线框）晶体结构：FFT图（图5c），反变换得层间距2.3、2.0、1.4 Å（图5d），分别对应面心立方(fcc)银(111)、(200)、(220)晶面（ICSD数据库[92]或JEMS软件）。单金属NPs HRTEM（补充图S5,S6）亦为fcc结构。

EDS化学分析（图6）。TEM视野一组Au@AgNPs（图6a）原子重量%：Ag 77%（壳）、Au 23%（核）（图6b）。单颗粒（图6c）约Ag 80%、Au 20%（图6d）。按准球形近似估算原子百分比：AuNPs TEM平均径24 nm估核体积(V_Au)；Au@AgNPs平均径36 nm估核壳体积(V_Au@Ag)；壳体积V_Ag=V_Au@Ag-V_Au。考虑fcc结构（4原子/晶胞），Au、Ag晶格常数分别4.0783、4.0862 Å[93]计算原子含量：Ag 70%、Au 30%，与EDS测值差10%。图7展示壳厚增加时原子含量理论变化（核径固定24 nm），Au@AgNPs直径>30.2 nm时Ag原子含量超Au。补充材料详述计算过程。考虑其他核径变化估算（补充图S7A,B）。

XRD图谱（图8）：所有产物均为fcc结构，与电镜一致。Au@AgNPs衍射峰位于2θ=38.25°、44.4°、64.9°、77.85°、81.25°。AgNPs和AuNPs峰位相同±0.5°，因Au、Ag晶格常数极近，fcc衍射图谱近似相同[94-96]。按JCPDS 4-0783和4-0784分配为Au/Ag fcc结构(111)、(200)、(220)、(311)、(222)晶面。

抗菌活性

单金属(AgNPs、AuNPs)和双金属(Au@AgNPs)四浓度（1、10、50、100 μg/mL）测试。菌株：酵母C. albicans、革兰氏阳性S. aureus、革兰氏阴性E. coli。24 h生长动力学曲线（图9）。

白色念珠菌

AuNPs 10 h前无影响（图9a），随后剂量依赖性降低终点吸光度。≥50 μg/mL时10 h后斜率陡降，24 h降幅45%，提示抗真菌效应。可能因AuNPs与真菌相关蛋白（如H⁺-ATPase）相互作用影响质子泵活性，萎缩营养摄取致死[61]。AgNPs和Au@AgNPs（图9b,c）自10 μg/mL抑制酵母生长。剂量-反应曲线估算MIC50（补充图S8）：AgNPs 2.21 μg/mL，Au@AgNPs 2.37 μg/mL。但EDS显示Au@AgNPs银质量分数64.85%，故其MIC50对应银浓度1.53 μg/mL，比AgNPs低30%。Padmos等[35]证实AgNPs抗菌但对哺乳动物细胞细胞毒性大，双金属尤其是Au核可降低毒性。

大肠杆菌

AuNPs对E. coli无显著抑制(<15%)，不影响生长动力学（图9d）。AgNPs（图9e）低浓度滞后期不变但生长率显著下降（斜率减小）；50 μg/mL滞后期延至16 h，24 h存活率仅20%；100 μg/mL无明显生长期分离。Au@AgNPs（图9f）前两浓度生长期不变但相对对照延迟2 h；50 μg/mL滞后期长达21 h；100 μg/mL无显性生长行为。

金黄色葡萄球菌

50 μg/mL下三材料滞后期再生长对比（图9g,i）。100 μg/mL完全抑制。1和10 μg/mL三材料斜率均较对照变化。AuNPs与革兰氏阳性菌静电相互作用破坏膜结构。类似结果见菠萝果提取物[98]和蓝绿藻蛋白[99]合成AuNPs。Yang等报告S. aureus MIC>500 μg/mL[100]，本研究AuNPs抑制浓度低10倍，关键协同作用源于表面多酚分子包覆稳定。ROS产生强度依次：AuNPs<多酚S. aureus反应[102]为最可行机制。Penders等报道250-500 μg/mL AuNPs延长S. aureus滞后期并抗菌[61,98,99]。

AgNPs抑制机制：表面电荷促进静电相互作用[104]积累渗透破坏细菌膜[103]，类似E. coli生物膜与AgNPs相互作用[105]。

Au@AgNPs结果与其他研究组相当[100,101]；但不同作者提示抑制与壳厚直接相关[100,101]。核壳NPs在NIH-3T3成纤维细胞低细胞毒性[35]。较低比例银壳显示类似AgNPs结果[100]，Au核增强抗菌并最小化细胞毒性。

修正Gompertz模型分析生长曲线

定量分析生长速率(μ)和滞后期(λ)随纳米材料浓度变化（图10），Gompertz模型拟合（式2）。

图10a：所有纳米材料随浓度增加降低S. aureus复制率，AuNPs灵敏度略高。50 μg/mL生长率仅对照30%（补充表S1-S24）；100 μg/mL全抑制。图10b：S. aureus适应期行为，材料间无显著差异，50 μg/mL滞后期较对照延长近5倍（补充表S1-S24）。总体：各纳米材料剂量依赖性降低复制率、延迟适应期至100 μg/mL抑制。

图10c：AuNPs不影响E. coli生长率μ；AgNPs降低μ，50 μg/mL降至对照19%（补充表S52）；Au@AgNPs在100 μg/mL完全抑制E. coli生长。图10d：E. coli滞后期响应各材料特异性。AuNPs无影响；AgNPs和Au@AgNPs剂量依赖性影响滞后期，Au@AgNPs突出。确立：AuNPs对E. coli无显著效应，Au@AgNPs可抑制复制并无限期延迟滞后期。有趣的是，AgNPs净银含量更高却未达此效果，提示核壳结构双金属协同增强抗菌活性。Feng等报道核壳/合金结构Au向Ag电子补偿现象增强细胞毒性但保留抗菌性[106]，假设Au-Ag协同效应，但需更多研究。

菌落直接计数（图11）重现生长动力学结果（图7a,e,i）。图11a：仅19 h AuNPs杀灭92%C. albicans。含银NPs（图11b,c）种群下降更显著。Au@AgNPs 50 μg/mL在7 h近乎完全抑制S. aureus（杀菌99.5%），但后期菌群再生长。测试浓度范围未得MBC（补充图S9-11），实验观察需更高浓度(>200 μg/mL)。但C. albicans暴露AgNPs显示MBC 50 μg/mL（补充表S55）。

结论

首次报道用Rumex hymenosepalus根提取物还原剂制备金纳米颗粒和核壳Au@Ag。提出两步顺序法得中等多分散、均匀银壳颗粒。Gompertz模型生长曲线参数揭示纳米材料对微生物不同抑制效应。AuNPs对S. aureus抑制浓度比其他工艺合成AuNPs低5倍，揭示合成工艺和表面环境的重要性。AgNPs和Au@AgNPs显著延长滞后期(>12 h)，但亚抑制浓度下细菌可适应再生长，有产生耐药风险，凸显覆盖适当周期动力学研究的重要性以排除延迟生长。有趣的是，Gompertz分析显示Au@AgNPs对微生物生长动力学影响大于单金属NPs，归因于核壳结构双金属协同效应。仅AgNPs对C. albicans达杀菌效果。需在更高浓度范围(>200 μg/mL)进一步实验测定研究菌株MBC。