配体掺杂氧氢氧化铜纳米颗粒：高效抗菌策略

摘要

细菌对抗菌疗法的耐药性日益成为临床难题，外用和全身疗法均面临此问题。外用方面，铜离子可作为高效廉价抗菌剂，通过多途径作用限制细菌耐药机会。然而铜的化学性质不利于在生物相容 pH 下易于释放铜离子的制剂配制。本文开发了纳米级氢氧化铜己二酸酒石酸盐（CHAT），作为一种廉价、安全、易合成的材料，能在感染创口环境中释放抗菌铜离子。

首先合成 CHAT，显示分散水合颗粒尺寸 2–5 nm，平均 ζ 电位 –40 mV。稀释至细菌培养基后，CHAT 对 Escherichia coli 和 Staphylococcus aureus 抗菌功效与氯化铜相似，剂量依赖性活性主要在 12.5–50 mg/L 铜浓度范围。此时 CHAT 极快溶解，经细菌铜生物传感器确认，其细胞内铜加载量与氯化铜源铜离子相同。然而在 250 mg/L 配制羟乙基纤维素外用基质中，CHAT 优势显现：前者在杀菌浓度范围内快速持续释放铜，后者因该浓度和 pH 下形成难溶沉淀，24 h 最大释放仅 10±7 mg/L 铜。

我们提供了一个用于外用铜基抗菌疗法的实用制剂。进一步研究，特别是体内实验，值得开展。

背景

微生物感染导致全球数百万死亡[1]。常因微生物对常规抗生素耐药导致抗菌治疗无效[2–5]，急需新型抗菌剂。铜长期被认可具有抗菌作用，因通过多重机制抗菌——与细菌蛋白和 DNA 相互作用、产生活性氧（ROS）、破坏膜完整性[6,7]——可能比标准抗生素拥有更长临床寿命。同因使致病菌对铜及其他金属的耐药潜力有限[7–9]。此外铜相对廉价，人体微量必需性使其进化出严格稳态控制，毒性低[10–12]。故铜常用于预防感染，主要防止高风险区（医院、养老院）表面细菌生物膜形成[13,14]。相反，铜在外用抗菌制剂中未获显著治疗应用，不像银广泛使用[15]。

细菌对细胞内铜负载敏感，铜源功效与其释放铜离子能力相关[16,17]。此方面，铜基抗菌剂的重大挑战是实现浓缩制剂，使抗菌铜在创口渗出液等流体中以有效浓度持续释放。因铜为水解金属离子，在典型外用制剂 pH（近中性）下，浓度升高越促进水解形成难溶氧氢氧化物[18]。生理 pH 下这些氧氢氧化物非溶性铜离子良好底物，故难释放潜在有效铜离子[16,19,20]。

近期为寻找生物利用度高的铁补充剂，通过结构修饰一级颗粒，解决了生理条件下从浓缩氧氢氧化物源有效释放三价铁离子问题。该工作在 GRAS（公认安全）配体——己二酸和酒石酸——存在下沉淀铁，有目的地破坏最终三价铁氧氢氧化物结构。此策略优势：（a）防止三价铁氧氢氧化物颗粒不可逆团聚；（b）大幅增加其在适当生理条件下的易变性（溶解易度）。该材料称为“铁[氧]氢氧化物己二酸酒石酸盐”（IHAT）[21,22]。类比之下，我们探讨铜[氧]氢氧化物己二酸酒石酸盐（CHAT）能否合成并在高浓度配制下仍释放有效抗菌浓度铜离子。本工作旨在开发廉价可放大合成工艺，生产铜氧氢氧化物纳米颗粒，与先前材料不同，能在模拟创口环境中迅速释放杀菌浓度铜离子。

因此，本研究合成 CHAT 并表征其递送生物可用铜及抗菌活性能力。重点关注 Escherichia coli 作革兰氏阴性菌“指示”菌种[19,23]，并额外展示对 Staphylococcus aureus（常获多重耐药的革兰氏阳性菌）的原理验证效应。旨在评估进一步开发 CHAT 用于外用抗菌临床应用的价值。

方法

除非另有说明，所有实验用超高纯水（反渗透纯化；18.2 ΩM/cm），室温（20±2 °C），试剂购自 Sigma Aldrich。

铜制剂与 CHAT 纳米颗粒

氯化铜储备液（40 mM 铜）溶解 CuCl₂·2H₂O 制备。氧化铜纳米颗粒（CuO NPs；Sigma 544868）储备液用无杂质商业粉末（原级粒径 34 nm，范围 10–50 nm，先前测试过抗菌活性[24–26]）制备，1.3 g/L 铜浓度剧烈搅拌分散。CHAT 纳米颗粒胶体悬浮液采用共沉淀法[27]合成。简述：氯化铜、酒石酸、己二酸溶于水，终悬浮液中铜/酒石酸/己二酸摩尔比 2:1:1，铜浓度 2.5 g/L。初始混合物 pH 总 <2.5，铜完全溶解。滴加浓 NaOH（5 M）恒定搅拌缓慢升 pH 至 8.2±0.2。

CHAT 悬浮液铜含量与相分布

胶体悬浮液铜含量用电感耦合等离子体-光发射光谱（ICP-OES，Jobin Yvon 2000，Horiba）测定。所有样品稀释至 100 mg/L 以下于 5% HNO₃（v/v）中，至少 24 h 前分析确保铜完全溶解。校准标准（0.1–100 mg/L 铜）在 5% HNO₃ 中基质匹配，324.754 nm 定量铜。通过过滤和超滤将铜分级为团聚、纳米颗粒态、可溶态百分比。悬浮液过滤（200 nm 截留），滞留液为团聚部分。为分离可溶铜与纳米颗粒态铜，胶体悬浮液经 3 kDa 滤器（Sartorius Vivaspin 500 VS0192；16,000×g，5 min）超滤，对应 1 nm 以下截留（Zetasizer Software 7.11，Malvern）。所有组分（总、200 nm 滤液、3 kDa 超滤液）铜含量经 ICP-OES 测定，百分比计算如下：

$$ {\displaystyle \begin{array}{l}\%\mathrm{Soluble}\ \mathrm{Copper}\ \left(<1\mathrm{nm}\right)\%\kern0.5em =\frac{\kern0.5em {Cu}_{3\mathrm{KDa}}}{Cu_{\mathrm{Total}}}\times 100\\ {}\%\mathrm{Agglomerated}\ \mathrm{Copper}=\frac{\ {Cu}_{\mathrm{Total}}-{Cu}_{<200\mathrm{nm}}\kern0.5em }{Cu_{\mathrm{Total}}}\kern0.5em \times 100\\ {}\%\mathrm{Nanoparticulate}\kern0.5em \mathrm{Copper}\kern0.5em =100-\%\mathrm{Agglomerated}\ \mathrm{copper}-\%\mathrm{Soluble}\ \mathrm{copper}\end{array}} $$

干燥 CHAT 纳米颗粒铜含量与铜配体比

CHAT 纳米颗粒团聚沉淀以回收并去除未结合成分。向 CHAT 胶体悬浮液（2.5 g/L 铜）加乙醇，体积比 2:1 乙醇/悬浮液，离心（4500×g×15 min，Mistral 6000）回收 CHAT 团聚体，弃上清液（含未结合配体）。固相 CHAT 铜含量测定：烘箱 45 °C 干燥乙醇沉淀团聚体至恒重，研磨，取 35.2±0.3 mg（n=2）于 11±1 g 70% HNO₃ 中消解，准确记录重量。完全消解后稀释 20 倍水中，ICP-OES 测铜浓度。配体铜摩尔比直接从干燥乙醇沉淀 CHAT 团聚体测定。团聚体先复溶至原始体积水中，便于用较少 HCl 溶解——高效液相色谱（HPLC）分析配体（酒石酸、己二酸）所需。分取部分用 5% HNO₃ 溶解 ICP-OES 测铜（如上），或用 80 mM HCl 溶解 HPLC 测配体。反相色谱系统（C18 柱，Waters Alliance 2690/5，2998 PDA 检测器）分析配体（详见附件 1）。

CHAT 悬浮液理化表征

动态光散射（DLS；Zetasizer NanoZS，Malvern）测流体动力学粒径分布。取 CHAT 胶体悬浮液（2.5 g/L 铜）1 mL 进样池，25±2 °C 测定（n=3）。ζ 电位用激光多普勒微电泳（Zetasizer NanoZS）测定，用一次性折叠毛细管池（DTS1070），介电常数 78.5，粘度 0.89 cP。透射电镜（TEM）表征：滴加 CHAT 悬浮液于多孔碳膜网格，50 °C 过夜干燥。FEI-Philips CM100，120 kV 明场成像。

铜制剂抗菌活性

重金属 MOPS（HMM）培养基（公认金属离子相容培养基，附件 3）补充 0.4% 葡萄糖、0.1% 酪蛋白酸水解物，pH 调 7.2±0.2[28]。加铜化合物前，Escherichia coli（NCTC11100）和 Staphylococcus aureus RN4220[29] 在 30 °C、80 rpm 振荡培养过夜（Infors HT Minitron）。稀释菌悬液至 OD 0.05–0.1（~10⁶ cells/mL），E. coli 595 nm，S. aureus 600 nm（Multiskan 板式读数仪）。氯化铜和胶体 CHAT 储备液稀释于 HMM，加入菌悬液得终铜浓度 0.4–100 mg/L。孵育 6–9 h，监测 OD 作细菌生物量指标。

细菌培养基中铜溶解度随时间变化：氯化铜和胶体 CHAT 稀释于 HMM 至 12.5、25、50 mg/L 铜，0、2、4、8 h 超滤（3 kDa）+ICP-OES 分析可溶铜分数。

铜制剂细胞内生物利用度

重组生物发光 Cu 感应菌 E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) 用于量化铜化合物生物利用度，亚毒性细胞内铜诱导生物发光增加[30]。菌悬液制备同抗菌实验，96 孔板中与 0–50 mg/L 铜氯化铜和 CHAT 系列稀释液孵育 4 h。Orion II 板式发光计（Berthold）测生物发光，诱导倍数计算：

$$ Bioluminescence\ in duction, Fold\ Change=\frac{ Bioluminescen ce\ in\ Cu\ exposure}{Bioluminescen\mathrm{ce}\ without\ Cu\ } $$

铜制剂诱导细胞内应激

重组生物发光菌 E. coli K12::soxRSsodAlux 和 E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) 分别评估铜化合物诱导细胞内超氧阴离子和单链 DNA 断裂能力[17]。菌培养同抗菌实验，白色 96 孔板中暴露于 0–50 mg/L 铜氯化铜和 CHAT 系列稀释液 4 h。生物传感器性能用亚硝基甲烷（0.04–30 µg/L）诱导超氧阴离子、过氧化氢（0.1–150 mg/L）诱导 DNA 损伤作阳性对照。同样孵育，Orion II 测生物发光，按式（5）计算诱导倍数。

铜制剂掺入羟乙基纤维素凝胶

氯化铜、CHAT、商业未改性氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）储备液稀释至 250 mg/L 铜。CHAT 和 CuO NPs 悬浮液近中性 pH 可直接入凝胶，氯化铜稀释后仍酸性，故调 pH 7.0±0.2。羟乙基纤维素（HEC）直接溶解（2% w/v）于各稀释液中，辊式混合器（Denley Spiramix 5）混匀成凝胶。各凝胶 10 g 转入 Falcon 管静置过夜。小心加入 10 mL 新配 50 mM 碳酸氢钠缓冲液（NaHCO₃ 溶解、pH 7.0±0.2），最小化凝胶-液界面扰动（比表面积 7.1 cm²）。取样经 ICP-OES 分析铜释放随时间变化。

结果

按“方法”节描述，CHAT 仿照铁类似物 IHAT[21,22] 合成，以酒石酸和己二酸掺杂铜氧氢氧化物（2.5 g/L 铜）。得稳定胶体悬浮液，所有铜通过 200 nm 滤器，极少（5%）通过 3 kDa 滤器。表明大部分铜为纳米颗粒态（95%；图 1a），极少“游离”铜，无可检大团聚——同 IHAT 类似物[21,22]。乙醇沉淀去除未结合配体后干燥，ICP-OES 测定 CHAT 含铜 31±1%（w/w）。HPLC 测配体铜摩尔比：铜/酒石酸 2:1，铜/己二酸 2:0.3。TEM 成像 CHAT 颗粒近单分散，直径 2–3 nm（图 1b）。与水合壳 DLS 数据一致：UHP 水中体积中位直径 3.4 nm（图 1c），分布窄（80% 体积 2.4–5.6 nm）。平均 ζ 电位 –39 mV（图 1d），符合稳定水合分散纳米颗粒[27]，CHAT 储备液稳定数年（附件 4）。

稀释至抗菌相关铜浓度考察 CHAT 抗菌活性。CHAT 和氯化铜对 E. coli 和 S. aureus 抑菌曲线极其相似，主要活性在 12.5–50 mg/L 总铜范围（图 2）。18.8（CuCl₂）和 25（CHAT）mg/L 铜完全抑制 E. coli 生长；S. aureus 完全抑制需 75（CuCl₂）和 100（CHAT）mg/L 铜（图 2；百分比抑制率见附件 5）。

抗菌浓度下，CHAT 至少 94% 在 15 min 内快速溶解（超滤+ICP-OES 判定，图 3a）。预期抗菌功效关联此化学易变性，纳米颗粒快速溶解使细菌细胞内获取铜离子。用 Cu 感应 E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) 验证：0–50 mg/L 铜作为 CHAT 或氯化铜挑战，两者铜浓度增加均导致生物发光增加（图 3b），符合细胞内铜上升。剂量-反应曲线斜率至 6.25 mg/L 相同，确证 CHAT 生物可用铜与完全溶解源相当。至 50 mg/L 发光不再增因两铜化合物毒性（图 3b）。

并行研究细胞内超氧阴离子和 DNA 损伤（图 3c、d），除阳性对照（过氧化氢、亚硝基甲烷）外，两铜源均无显著可观效应。三生物传感器对不同化学形式铜溶液等效响应，强力支持：两种情况下细菌暴露于相同可溶铜，虽一制剂起始为纳米颗粒态。

最后，如前所述，CHAT 优势仅在浓缩制剂下显现：前者保持化学易变性，后者不。用羟乙基纤维素（HEC，常用外用制剂水性基质[31–33]）掺入 250 mg/L 铜作为氯化铜、CHAT 或商业 CuO NPs。向 10 g 各铜掺入 HEC 凝胶加 10 mL 50 mM NaHCO₃ 缓冲液（模拟创口渗出液，即 2.5 mg 铜），CHAT 制剂持续释放铜，24 h 达 >60 mg/L（图 4）。释放较快，2–4 h 达抗菌活性浓度。相反，pH 中和氯化铜因水解团聚成铜氧氢氧化物，24 h 仅达 10±7 mg/L 铜（图 4）。商业 CuO NPs 无可辨铜释放（图 4）。

讨论

我们展示了一种铜基纳米材料 CHAT，可高浓度配制，不同于先前铜基纳米颗粒[34,35]，同时保持作为生物可用铜易变源的抗菌功效。CHAT 合成灵感源于多年铁类似物 IHAT 研究[21,22]，后者受自然界体内快速矿物周转、利用有机分子破坏一级矿物晶体结构以高效循环必需金属离子启发[21,22]。合成版本中，GRAS 配体在溶液中交联聚合物形成金属氧氢氧化物时掺入[21,22]。结构破坏确保终矿物相易变性，并产生高负电荷纳米颗粒——ζ 电位证实——排斥团聚，制得稳定数年的纳米颗粒悬浮液。此处及 IHAT 中，酒石酸酯为实现这些理化变化的主导配体，其掺入量约为己二酸 3 倍——后者在合成中更多作缓冲剂[21,22]。

无修饰时，新沉淀金属氧氢氧化物将团聚并老化，逐渐增大尺寸和结晶度，降低参与逆反应（再溶解）能力。故氯化铜溶液 pH 中和新形成铜氧氢氧化物在凝胶释放实验中仍释放部分可溶铜（图 4），而商业 CuO NPs 为团聚且更冷凝矿相（氧化铜），不可测铜释放。商业 30 nm 纳米颗粒无论团聚状态如何，均呈大比表面积可供溶解，却无溶解，说明矿相是驱动铜离子释放关键因素，且如上所述，通过配体掺杂修饰矿物一级颗粒，才能显著改变溶解特性。此外 CHAT 室温合成，高温倾向低非晶相可能降低溶解速率；室温合成亦降低规模化制造能耗成本。

虽可能有其他方法配制高稳定铜浓度实现持续释放和快速溶解，但难以想象比这更直接、原料成本更低的合成。这些因素重要，因外用感染和细菌耐药不限于发达国家。发展中国家日益遭受细菌耐药困扰，亟需负担得起的有效方案[36,37]。虽研究不足以得出定论，但有证据表明对有毒金属离子耐药比对常规抗生素更难[7]。理论基于铜银可能无离散抗菌途径，而影响多靶点包括各种酶系统，从而破坏整体细菌细胞结构[17,19,38]。已证实细菌经世纪暴露仍对铜及某些金属离子敏感[6,7,39]。有趣的是，近期证据显示金属抗菌剂甚至可恢复耐药菌对常规抗生素敏感性[40,41]。

结论

我们证明了在生理 pH 和高浓度下生物可用铜离子问题，可通过用有机酸掺杂铜纳米矿物解决，策略同前用于铁类似物[21,22]。这些铜基纳米颗粒（称 CHAT）在细菌培养基中迅速溶解，显示与可溶铜盐相当的细胞内铜摄取和抗菌活性。关键在于，与简单铜盐不同，CHAT 可在中性 pH 浓缩配制并保持铜离子释放易变性。确实，CHAT 在杀菌范围内释放铜离子，可作为新型外用抗菌剂单独或增强耐药抗生素疗效。随抗生素耐药增加，需要新型外用抗菌剂，CHAT 成分廉价、易合成、GRAS。值得开展体内研究。

缩写

CHAT:

铜[氧]氢氧化物己二酸酒石酸盐纳米颗粒

CuO NPs:

氧化铜纳米颗粒

DLS:

动态光散射

Escherichia coli:

E. coli

GRAS:

公认安全

HEC:

羟乙基纤维素

HMM:

重金属 MOPS 培养基

HPLC:

高效液相色谱

ICP-OES:

电感耦合等离子体-光发射光谱

IHAT:

铁[氧]氢氧化物己二酸酒石酸盐纳米颗粒

MOPS:

3-(N-吗啉基)丙烷磺酸

Staphylococcus aureus:

S. aureus

UHP:

超高纯度