开发用于潜在伤口愈合应用的电纺壳聚糖-聚氧化乙烯/纤维蛋白原生物复合材料

背景

尽管在伤口管理领域取得了许多进展，但很少有生物活性敷料能够促进愈合过程的商业化。缺乏成功的产品可归因于伤口愈合过程的复杂性，其中涉及许多可溶性介质、血细胞、实质细胞和细胞外基质 (ECM) 成分。生长因子通过促进细胞增殖、迁移和分化在伤口愈合过程中发挥核心作用。然而，体内快速消除和短半衰期 [1,2,3] 限制了临床采用生长因子疗法来促进愈合和组织再生 [4, 5]。目前，需要在体内重复施用生长因子才能达到治疗效果（例如，细胞募集和分化）。能够持续、局部递送生长因子的伤口敷料的开发将显着改善治疗结果并加速临床采用。

血小板衍生生长因子 (PDGF) 作为伤口愈合的引发剂和介质起着至关重要的作用；它作为中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞的趋化剂 [6] 并有助于调节基质沉积。此外，PDGF 可以抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的分化，从而影响伤口收缩并减少疤痕形成 [6]。 PDGF 以 Regranex® 品牌销售，是目前唯一获得 FDA 批准的生长因子，用于治疗下肢糖尿病溃疡。每天一次局部应用 Regranex® 凝胶 (2.2 μg/cm ² 溃疡）已被证明可以使愈合时间加快 30%，并且副作用最小。然而，每天局部应用和去除 Regranex® 不方便，并且会对患者的生活质量产生不利影响。

静电纺丝已被确立为使用具有生物学意义的聚合物制造仿生纳米纤维支架的一项显着技术。许多可生物降解的合成材料（例如聚己内酯）和天然聚合物（例如胶原蛋白）已被电纺成无纺纳米纤维支架，这些支架表现出高表面积体积比和孔隙率特性，这对于药物输送和伤口敷料应用很重要。天然聚合物（例如胶原蛋白、弹性蛋白和纤维蛋白原）由于其生物活性、生物相容性和结合特定生长因子（例如 PDGF）的独特能力而成为特别有吸引力的伤口敷料材料。纤维蛋白原 (Fb) 是一种 340 kDa 的球状血浆蛋白，通过其活化形式纤维蛋白在凝块形成中起主要作用，纤维蛋白作为组织修复和再生的临时基质。缺乏 Fb 和纤维蛋白与伤口愈合缺陷有关 [7]。基于 Fb 的产品表现出可生物降解性、非免疫原性和细胞迁移促进作用，之前已被开发为水凝胶 [8,9,10] 和湿挤压电缆 [11, 12]；然而，这些材料的物理和结构特性限制了它们的临床应用。水凝胶缺乏长期使用的结构和机械完整性，湿挤出纤维的直径尺寸（200-250 微米）比天然 ECM（200-500 纳米）呈指数级大。 Wnek 等人。然而，证明静电纺丝提供了制造与天然 ECM 结构非常相似的 Fb 支架的能力 [13]。尽管所得纳米纤维表现出比水凝胶更好的机械性能，但该结构仍缺乏用于伤口敷料应用的最佳机械性能[14]。

为了提高电纺纤维蛋白原支架的机械性能，可以引入额外的聚合物来增强纳米纤维 [15]。具体来说，壳聚糖 (CS)、N 几丁质的去乙酰化衍生物，已被证明在伤口敷料应用中具有理想的抗菌特性 [16, 17]。除了作为一种有效的抗菌剂外，CS 还被用于各种生物医学应用，包括引导骨再生 [18, 19]、透皮给药 [20]、定向干细胞分化 [21] 和止血剂 [22]。由于壳聚糖的聚阳离子性质，使用普通溶剂进行静电纺丝存在很大困难。为了克服这些困难并提高静电纺丝能力，CS 已与各种其他聚合物混合，例如聚（乙烯基吡咯烷酮）[23]、聚（环氧乙烷）（PEO）[16] 和聚（乙烯醇）[24]。同样，由于强静电相互作用，CS 的聚阳离子性质限制了与 Fb 成功结合到单个支架中。在这项工作中，通过利用多功能双喷嘴静电纺丝系统克服了这一限制。使用各种物理化学表征分析所得纳米纤维支架。我们假设新型组合 CS-Fb 纳米纤维支架将成为一种可行的候选生物活性和仿生伤口敷料，该敷料可以提供 PDGF，并可以有效影响伤口愈合所需的成纤维细胞迁移。

方法

材料

乙酸（冰醋酸，≥ 99.85%），CS（低分子量，75–85% 脱乙酰），PEO（MW 300,000 g/mol），Fb（IS 型，65–85% 蛋白质），1,1,1， 3,3,3-六氟异丙醇 (HFIP) 和牛血清白蛋白（BSA，≥ 96%）购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。二甲基亚砜 (DMSO) 购自 EMD Millipore (Billerica, MA, USA)。人真皮成纤维细胞 (PCS-201-012) 和细胞培养试剂购自美国典型培养物保藏中心 (Manassas, VA, USA)。无载体重组人血小板衍生生长因子-BB (rhPDGF-BB) 购自 PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA)。所有试剂均为试剂级，未经进一步纯化或修饰使用。

电纺壳聚糖-聚氧化乙烯/纤维蛋白原复合支架的制备

壳聚糖-PEO 储备溶液是通过将 CS 和 PEO 溶解在 1% 乙酸和 BSA (0.5% v /v ) 和 DMSO (10% v /v ) 以获得 5.5 wt.% 的总聚合物含量，CS 与 PEO 的质量比为 2:1。如前所述，加入聚环氧乙烷以提高静电纺 CS 的能力 [16]。纤维蛋白原原液 (110 mg/mL) 是通过将 Fb 溶解在一份 10× Eagle 最低必需培养基 (EMEM) 和九份 HFIP 中制成的。 CS-PEO 和 Fb 原液在室温下搅拌直至完全溶解。对于负载支架，在静电纺丝前立即将 PDGF 混合到每个聚合物溶液中。静电纺 CS-PEO/Fb 复合纳米纤维支架是使用多喷嘴静电纺丝系统制造的（图 1）。使用一次性注射器将溶液单独加载并机械泵入系统，连接到 18 号喷丝头和 NE-1000 注射泵（New Era Pump Systems，Farmingdale，NY），流速为 0.7 和 1.0 mL h ⁻¹ 分别用于 CS-PEO 和 Fb。心轴收集器以 25 RPM 旋转，位于喷丝头之间，距离 CS-PEO 22 厘米，距离 Fb 12.5 厘米。在制造过程中，分别对 CS-PEO 和 Fb 聚合物溶液的喷丝头施加 28 和 22 kV 的直流电压。制造的纳米纤维支架要么收集在 18 厘米玻璃盖玻片上用于生物测定，要么直接从心轴上切下用于渗透性和拉伸强度分析。所有静电纺丝实验均在室温和 35-45% 的相对湿度下进行 3 小时。含有PDGF的样品在- 20°C下保存在干燥器中，而未加载的支架在制造后在室温下保存在干燥器中。

双喷丝头静电纺丝机原理图

纳米纤维形态和直径

电纺纳米纤维支架用金溅射涂覆，并使用场发射扫描电子显微镜（FESEM）（Zeiss Sigma VP-40，德国）观察。每个支架拍摄 20 张显微照片，每个配方分析三个单独旋转的支架。平均纳米纤维直径是通过使用 ImageJ (NIH, Bethesda, MD) 测量每个显微照片的五个随机点来计算的。每个支架配方共进行 100 次测量。

表面化学表征

飞行时间离子质谱 (ToF-SIMS) 用于分析支架中的表面化学和聚合物组分的贡献。 ToF-SIMS 是一种灵敏而深入的表面分析方法，它通过用高能 Bi3 ²⁺ 轰击来评估材料顶部纳米层的化学成分 超高真空下的团簇 [25, 26]。然后根据原子质荷比 (m/z) 分析从材料表面喷出的二次离子碎片，并用于推断整体表面化学成分。

ToF-SIMS 分析由 Evans Analytics Group (EAG, Sunnyvale, CA) 使用带有铋液态金属离子枪 (30 kV) 的 ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmBH, Germany) 进行。该仪器在离子微探针模式下运行，其中从每个样品中获取三个正离子和负离子光谱。选定的正离子和负离子以 2048 × 2048 像素的图像分辨率映射到 50 × 50-μm 的光栅区域，以提供支架的聚合物组分映射。为每个碎片报告了归一化强度，定义为每个次级离子的计数除以记录的离子总数乘以 10,000。分析了六个独立制造的样品表面三个不同位置的平均值（n =6)。 ToF-SIMs分析的CS-PEO和Fb聚合物分布代表整个支架。

CS-PEO、CS-PEO/Fb 和 Fb 支架的水接触角根据美国测试方法标准 (ASTM) D7334-08 确定。纳米纤维支架被电纺到玻璃盖玻片上。将一滴蒸馏水 (2 μL) 施加到支架表面，并在 30 秒内使用 Krüss DSA10 MK2 液滴形状分析仪（Krüss，Hamburg，Germany）测量接触角。每个样品在不同位置重复测量 3 次，并计算平均接触角。分析了六个独立的静电纺丝支架 (n =6).

机械单轴抗拉强度

使用配备 250-N 称重传感器的 Instron® E3000 ElectroPuls（Instron，Canton，MA）在室温下测量电纺支架的机械性能，应变速率为 1 mm min ^-1 .通过 Keyence 3D 激光扫描显微镜 VK-200（Keyence, Itasca, IL）在六个随机位置测量样品的厚度。用于拉伸试验的支架厚度为 93.8 ± 7.4 μm。试验前，将支架切成40 × 25mm的矩形试样。获得的数据被报告并绘制为应力-应变曲线，其中拉伸应力定义为力与试样横截面积的比率，而应变定义为原始长度上的长度变化。杨氏模量、拉伸应力和断裂应变计算是从每个配方平均十个样品的应力-应变曲线中获得的。

水蒸气传输率

CS-PEO/Fb 支架的水蒸气传输速率根据 ASTM E96/E96M 干燥剂方法进行测量。每个配方总共制备六个独立的电纺样品，并在室温和 58.2 ± 5.2% 的相对平均湿度下放置在含有可重复使用的硅胶干燥剂的测试容器的开口上。水蒸气透过率 (WVTR) 是根据 48 小时内不同时间点测量的测试容器的重量计算得出的：

其中 G 表示测试容器的重量变化，t 是经过的时间，A 是支架的横截面积。

体外细胞活力

基于改编自 ISO10993-5 标准测试方法的方法评估支架的间接细胞毒性 [27, 28]。人真皮成纤维细胞在 37°C 和 5% CO2 的无血清成纤维细胞培养基中培养，每 3 天更新一次。一旦细胞达到汇合，它们就被胰蛋白酶消化并接种到 12 孔板中（10,000 个细胞/mL）。第二天，补充培养基并引入纳米纤维支架。使用 2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑钠 (WST-1) 细胞增殖试验监测细胞增殖 120 小时。

成纤维细胞的可视化

人真皮成纤维细胞被胰蛋白酶消化并接种到 CS-PEO、Fb 和 CS-PEO/Fb 支架上。在 37°C 和 5% CO2 下孵育 24 小时后，根据制造商的说明，用 LIVE/DEAD™ 细胞活力试剂盒（ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA）洗涤和染色细胞。此外，根据制造商的规格，通过用鬼笔环肽-Atto 565（Sigma Aldrich 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI；ThermoFisher Scientific）染色来评估人成纤维细胞对支架的粘附和附着。观察图像并使用倒置共聚焦显微镜（Nikon C1，C1EZ，Melville，NY，USA）拍摄。

体外降解

CS-PEO/Fb 纳米纤维支架的降解在 37°C 和 5% CO2 的成纤维细胞基础培养基（FBM，ATCC）中进行。将支架浸入 FBM 中并孵育 1、6、24 或 48 小时。记录每个支架的初始干重；在每个时间点，将支架清洗、冻干并再次称重。支架的降解由下式计算：

其中 W 0 是脚手架的初始权重，W t 为各时间点支架的重量。

PDGF 发布和检测

在体外降解实验期间从特定时间点收集的洗脱液使用 rhPDGF-BB 特异性 ELISA 试剂盒（R&D System, Minneapolis, MN）进行分析。将检测到的吸光度值与标准品进行比较，如制造商确定 PDGF 浓度的说明所指定。将检测到的PDGF量标准化为相应支架的重量（mg）。

释放的血小板衍生生长因子的迁移特性

使用 ORIS™ 细胞迁移测定试剂盒（Platypus Technologies, Madison, WI）评估人真皮成纤维细胞的迁移以评估 PDGF 生物活性。简而言之，用丝裂霉素 C（Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州）处理的成纤维细胞被胰蛋白酶消化并接种到含有制造商提供的塞子的 96 孔板中，并在 37 ° 下孵育 C 和 5% CO2 过夜。第二天，移除塞子形成迁移区，向其中添加在不同时间点收集的 100 μL 洗脱液并再孵育 24 小时。新鲜制备的 50 ng mL ⁻¹ PDGF 和基础成纤维细胞培养基分别用作阳性和阴性对照。与 50 ng mL ^-1 引起的迁移相比，成纤维细胞迁移表示为倍数变化 PDGF 治疗。在三个独立实验中对三个加载浓度（2、4 和 8 μg/mL）进行了三次重复研究。

统计分析

连续数据表示为平均值 ± 标准偏差。使用单向方差分析（ANOVA）分析组平均值之间的差异。 Tukey 的多重比较检验用于确定一组均值中的哪​​些均值具有统计学差异。统计显着性设为α =0.05。所有数据均使用 GraphPad Prism（美国加利福尼亚州圣地亚哥）进行分析。

结果与讨论

各种聚合物的组合已被证明可以显着改善所得复合材料的性能 [29, 30]。组合聚合物系统可有效调节支架强度、柔韧性、生物降解和药物释放动力学，这些都是伤口敷料应用的重要参数。然而，独特的复合材料的创建可能会受到组成聚合物之间固有的化学相互作用的限制。例如，当混合带负电荷的 Fb 和带正电荷的 CS 时，观察到形成聚合物沉淀；对于在各种溶剂条件下具有强静电相互作用的分子，这一观察得到了充分证明 [31,32,33]。因此，制备 CS-Fb 聚合物复合支架需要使用双挤出静电纺丝技术，如前所述 [34]。

CS-PEO/Fb 纳米纤维的形态

CS-PEO、CS-PEO/Fb 和 Fb 支架的平均纤维直径分别为 269.9 ± 68.4、202.3 ± 113.2 和 351.1 ± 101.7 nm（图 2）。有趣的是，CS-PEO/Fb 复合支架表现出比 CS-PEO 或 Fb 支架更薄的纳米纤维。纤维直径尺寸的减小可能是由于同时带电的聚合物射流产生的额外静电力 [35,36,37]。因此，由这些力引起的聚合物射流相互排斥会增加喷丝头之间的距离和沉积时间。由此产生的延长沉积时间与增加的弯曲不稳定性相关，已知弯曲不稳定性会导致纤维伸长和形成更细的纤维。

电纺支架的代表性 FESEM 显微照片。 一 CS-PEO，平均直径 269.9 ± 68.4 nm。 b CS-PEO/Fb，平均直径 202.3 ± 113.2 nm。 c Fb，平均直径 351.1 ± 101.7 nm (n =100)

通过 ToF-SIMS 和水接触角表征表面化学

CS、Fb 和 PEO 支架的 ToF-SIMS 光谱如图 3 所示。通常，独特的化学指纹种类可用于区分单个聚合物成分。然而，由于 CS 和 Fb 之间的化学相似性，存在许多含氮物质 (C3H6NO ⁺ , CH4N ⁺ , CN ⁻ , 和 CNO ⁻ ) 存在于两个光谱中，因此很难将聚合物彼此区分开来。然而，当 Fb 被纳入支架时，CN ^- 的总数 和 CNO ⁻ 物种增加而其他片段保持不变或减少。因此，检查 CN ⁻ 中的变化 和 CNO ⁻ 片段强度允许间接检测 Fb。同理，C2H5O ⁺ 的增加 (45 m/z) 离子用于鉴定复合支架中 PEO 的环氧乙烷碎片。

代表a 正面和b 原始 CS（顶部）、Fb（中间）和 PEO（底部）的负离子 ToF-SIMS 光谱。利用带圆圈的离子碎片作为唯一指纹来识别化合物

为了阐明复合支架内 Fb 组分的存在和分布，CNO ⁻ 和 CN ⁻ 离子被映射到原始和复合支架的 50 × 50-μm 光栅上以获得热图（图 4a，b）。在 C2H5O ⁺ 上进行了相同的映射技术 以确定 PEO 分布（图 4c）。增加的热图强度与较高的 Fb 或 PEO 聚合物含量相关。我们观察到 CNO ⁻ 的强度 , CN ⁻ , 和 C2H5O ⁺ 均匀分布在复合支架的 50 × 50-μm 光栅区域。由于支架的厚度 (93.8 ± 7.4 μm) 和逐层纤维沉积，预计表面成分将代表整个支架。因此，ToF-SIM 数据表明，当使用双喷丝头静电纺丝制造 CS-PEO/Fb 纳米纤维支架时，各个组分均匀沉积在整个复合支架上。

a 的 ToF-SIMS 映射 CNO ⁻ , b CN ⁻ , 和 c C2H5O ⁺ 50 × 50-μm光栅区域内各种支架上的离子碎片

电纺 CS-PEO、CS-PEO/Fb 和 Fb 纤维支架的水接触角分别测定为 44.2°±5.1°、61.4°±7.6° 和 115.7°±16.2°（图 5）。基于水接触角，CS-PEO 和 CS-PEO/Fb 支架是亲水的 (> 90°)，而 Fb 支架是疏水的 (<90°)。 CS-PEO/Fb 复合支架的水接触角表现出介于其组件之间的表面特征，这表明 CS-PEO 和 Fb 在制造过程中均匀沉积。聚合物表面的表面特性在蛋白质和粘附因子的沉积中起着重要作用。具体而言，已知重要的细菌粘附因子更容易出现在疏水表面上，从而促进细菌定植 [38]。因此，CS-PEO/Fb 的亲水性可能有助于阻止细菌附着。

去离子水在玻璃基板、CS-PEO、CS-PEO/Fb和Fb支架表面的行为

CS-PEO/Fb 支架的机械单轴拉伸强度

在平均厚度为 93.8 ± 7.4 μm 的纳米纤维支架上进行单轴拉伸测试。结果汇总见表 1，相应的应力-应变曲线如图 6 所示。通常，复合材料的机械性能与其最弱的成分相关。结果表明，仅含 Fb 的支架不具有用于伤口敷料应用的理想机械性能。这强调了加入 CS-PEO 以获得更机械稳定的产品的重要性。

CS-PEO、CS-PEO/Fb 和 Fb 支架的应力-应变曲线。数据代表十个独立生产的支架

CS-PEO/Fb 支架的水蒸气转移率

WVTR 在维持伤口环境的理想湿度方面起着至关重要的作用，这对细胞肉芽形成和上皮形成有积极影响 [39, 40]。由于蒸发和渗出，较高的 WVTR 值与伤口快速脱水相关，这会不利地降低体温并增加新陈代谢。相反，极低的 WVTR 值与渗出液积累、愈合抑制和感染风险增加相关。兰克等人。报告正常皮肤的 WVTR 为 204 ± 12 g m ⁻² 天 ⁻¹ 279 到 5138 g m ⁻² 天 ⁻¹ 对于受伤的皮肤，取决于伤口的状况 [41, 42]。对于伤口上皮化和愈合增强，理想的 WVTR 为 2028.3 ± 237.8 g m ⁻² 天 ⁻¹ 已报道[43]。 CS-PEO 和 Fb 支架的 WVTR 分别为 693.2 ± 95.7 和 686.1 ± 44.17 g m ^-2 天 ⁻¹ ， 分别。尽管比原始支架更接近理想的 WVTR，但 CS-PEO/Fb 支架 (806.5 ± 56.1 g m ⁻² 天 ⁻¹ ) 仍低于理想的 WVTR（图 7）。对支架物理参数的操作可以提高 WVTRs 以更好地模拟报告的理想速率。

电纺 CS-PEO、CS-PEO/Fb 和 Fb 支架的水蒸气转移率。误差棒代表标准偏差 (n =6, *p <0.05 与 CS-PEO/Fb 支架相比）

人真皮成纤维细胞的体外细胞活力

壳聚糖-PEO/Fb 支架在最初的 48 小时内对人成纤维细胞没有表现出显着的增殖作用（图 8）；然而，与无支架对照相比，在 72 小时时延长暴露时间产生了统计学上显着的增殖减少。结果表明支架显示出对细胞增殖的抑制作用，这种抑制作用可能会随着时间的推移而累积。

暴露于 Fb 和 CS-PEO/Fb 电纺支架时人真皮成纤维细胞增殖的比较 (n =9, *p <0.05 与每个时间点的“无支架对照”对比）

增殖能力降低可能是由于与 CS 相关的乙酰化 (DA) 程度，已显示其通过其正电荷具有强烈的细胞相互作用 [44]。尤尼斯等人。证明用 CS (> 50% DA) 处理的膀胱癌细胞在 24 小时后显着降低了生存能力，表明 CS 细胞毒性与其 DA 直接相关，DA 会影响增殖 [45]。这种影响也可能与体外实验条件有关；先前的研究表明 CS 在体内是无毒的，因为其生物降解产物可以通过代谢途径清除 [46]。静电纺丝过程中残留的 HFIP 也可能导致观察到的细胞毒性。然而，在同样在 HFIP 中制备的电纺纯 Fb 支架中未观察到相同的细胞毒性。由于其高挥发性，HFIP 可能在制造过程中从电纺支架中消除。如果在定时暴露于人皮肤成纤维细胞期间释放掺入纤维系统的残留 HFIP，则细胞活力会明显降低。

LIVE/DEAD 检测和细胞附着

图 9a-c 显示了接种在纤连蛋白包被的玻璃、未加载的 CS-PEO/Fb 支架和加载了 PDGF (4 μg/mL) CS-PEO/Fb 支架表面的真皮成纤维细胞的分布和活力。培养 24 小时后，与活细胞相比，观察到最少的死细胞。未发现加载 PDGF 和未加载支架之间存在明显差异。

接种在 a 上的成纤维细胞的共聚焦显微照片 , d fibronectin-coated glass; b , e unloaded CS-PEO/Fb scaffold;和 c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)

Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.

In Vitro Degradation of Electrospun CS-PEO/Fb Scaffolds

Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.

Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n  = 6)

In Vitro Release of PDGF

Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).

PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n  = 10, *p  < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, ^# p  < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)

During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].

Effects of Released PDGF on Fibroblast Migration

Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.

Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n  = 8, *p  < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)

Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.

Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.

Conclusion

The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.

缩写

CS:

Chitosan

DA:

Degree of acetylation

DMSO：

二甲亚砜

ECM:

Extracellular matrix

EMEM:

Eagle’s minimum essential media

Fb:

Fibrinogen

FBM:

Fibroblast blast media

FESEM:

Field emission scanning electron microscope

FGF:

Fibroblast growth factor

HFIP:

1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol

PDGF:

Platelet-derived growth factor

PEO：

聚环氧乙烷

PLGA:

Poly(lactide-co-glycolide)

TGF-β:

Transforming growth factor beta

ToF-SIMS:

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry

VEGF:

Vascular endothelial growth factor

WVTR:

Water vapor transfer rate