用于 CCRF-CEM 开启检测的基于氧化石墨烯的荧光适体传感器

背景

白血病是一种侵袭性、常见的恶性血液病，严重威胁着人类的生存和健康，尤其是对儿童和青少年[1, 2]。它不仅会影响身体的正常造血细胞，还会影响骨髓和免疫系统 [3,4,5]。因此，早期诊断白血病对于治疗和提高患者的生活质量至关重要。目前常用的检测白血病的方法是取外周血细胞和骨髓，经过多种分析[6]，包括细胞形态学、细胞化学[7,8,9]、免疫表型[10、11]、免疫组化[12, 13] 和基于适配体的流式细胞术 [14, 15]，已经进行。这些方法可以检测白血病细胞，但仍存在成本高、灵敏度低、操作复杂等诸多缺点。因此，寻找一种低成本、高灵敏度、简便的白血病检测方法迫在眉睫。

适配体是短单链 DNA (ssDNA) 或 RNA，通过指数富集 (SELEX) 配体系统进化的体外筛选 [16, 17]。基于特殊的三级结构，适配体对靶标具有强大的结合亲和力和高特异性，包括有机小分子、蛋白质甚至细胞 [18,19,20]。此外，适配体还具有易于合成和修饰的特点，因此被广泛用作癌症检测探针[21]。基于适配体的功能化纳米材料用于检测癌症也是近年来的热点[22, 23]，如量子点和二氧化硅纳米粒子[24]。

氧化石墨烯（GO）作为一种新型的二维平面碳纳米材料，由于其独特的性质而受到广泛关注，包括良好的水溶性[25]、大的比表面积和优异的荧光猝灭能力[26, 27]。基于这些特性，GO被认为是荧光共振能量转移（FRET）中优良的能量受体，这使得GO在荧光适体传感器中具有广阔的应用前景[28]。此外，GO可以通过π与适配体结合 -π 堆叠相互作用，但不是双链 DNA 或适体-靶标复合物 [19, 29, 30]。因此，与游离适体探针相比，基于石墨烯的适体传感器可以提高适体的稳定性[31]。

目前，大量研究报道基于氧化石墨烯的荧光适体传感器检测目标的策略是可行的[21, 32]。然而，到目前为止，使用基于 GO 的适体传感器检测白血病细胞的研究很少。在这里，我们设计了一种基于 GO 和羧基荧光素标记的 Sgc8 适配体（FAM-apt）的白血病细胞信号“开启”检测新策略。 GO 和适体分别用作荧光猝灭剂和目标试剂。在没有白血病细胞的情况下，GO 可以与 FAM-apt 相互作用并淬灭几乎所有的荧光，检测信号关闭。然而，当靶细胞存在时，适体主动靶向细胞并从GO脱落，导致检测系统中荧光恢复，检测信号开启。因此，可以根据荧光强度的变化相应地测定靶细胞浓度。

方法

试剂

序列为 5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3' 的 FFAM-apt 由 Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）合成。在这项工作中，使用了自调节 Tris-HCl 缓冲液，包括 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)、5 mM MgCl2 和 100 mM NaCl。本实验中使用的适配体用 Tris-HCl 缓冲液溶解。氧化石墨烯粉末购自咸丰纳米材料科技有限公司（中国南京）。所有溶液均使用从 Milli-Q 纯化系统（Millipore，Bedford，MA，USA）纯化的 18 MΩ 超纯水制备。

细胞

CCRF-CEM（人急性白血病淋巴母细胞系）、Ramos（人伯基特淋巴瘤细胞系）、293T（人胚肾细胞系）和H22（鼠肝细胞癌细胞系）细胞系购自中国细胞库科学院（中国上​​海）。所有细胞系均在 5% 二氧化碳和 37°C 下培养，1640 培养基含有 10% 胎牛血清（FBS；HyClone）和 100 U/mL 青霉素-链霉素（Gibco，Grand Island，NY，USA）。

设备

所有荧光光谱和荧光强度均由 F-7000 荧光分光光度计（日立公司，东京，日本）测量和记录。使用 700 μL 石英比色皿盛放样品溶液。由于羧基荧光素（FAM）的特征峰波长，通过在490 nm激发样品并在518 nm测量发射来监测发光强度。

所有原子力显微镜（AFM）成像均由SPI3800N显微镜（Seiko Instruments Industry Co.，Tokyo，Japan）拍摄。

GO、FAM-apt 和氧化石墨烯-适配体复合物 (GO-apt) 的 Zeta 电位通过纳米颗粒尺寸、zeta 电位和绝对分子量分析仪 (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK) 测定。

在 NanoDrop 2000 (Thermo, USA) 上记录 GO、FAM-apt 和 GO-apt 的紫外可见吸收光谱。

GO-apt 荧光适体传感器的制备

将氧化石墨烯粉末溶解并分散在 Milli-Q 纯净水中，然后通过超声分散，得到浓度为 1 mg/mL 的均匀黑色溶液。用 20 mM Tris-HCl 缓冲液稀释储备溶液，我们获得了 20 nM FAM-apt 的浓度。之后，将制备的 1 μL FAM-apt (10 μM) 和 10 μL GO 溶液 (1 mg/mL) 混合，然后用 Tris-HCl 缓冲液稀释至 500 μL。

细胞成像

CCRF-CEM 和 Ramos 细胞在六孔板（5 × 10 ⁵ 每孔细胞）。细胞用冷磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 洗涤两次，并与 GO-apt 溶液在 4°C 下在黑暗中孵育 30 分钟。然后，将细胞洗涤 3 次并用 4% 聚甲醛固定 20 分钟。细胞再次用 PBS 洗涤，并用 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI；Life Co.，USA）在黑暗中染色 5 分钟。最后用PBS洗涤细胞3次，荧光显微镜检查（Nikon DS-Ri1；Japan）。

CCRF-CEM 细胞检测

CCRF-CEM 细胞通过离心收集并悬浮在 1 mL PBS 中。不同浓度的CCRF-CEM细胞(0～1.0 × 10 ⁷ /mL) 与 GO-apt 荧光适体传感器在 4°C 下在黑暗中孵育 30 分钟。孵育后，CCRF-CEM 细胞在 560-500 nm 波长范围内通过荧光光谱检测。基于 3σ 估计检测限 (LOD) / S 计算，其中σ 是 GO-apt 解决方案的标准偏差 (n =10) 和 S 是线性方程[33]的斜率。

特异性分析

为了研究基于 GO 的荧光适体传感器的特异性，我们用几种不同的细胞测试了该系统，包括拉莫斯细胞、H22 细胞和 293T 细胞。每个100-μL反应系统包括1 × 10 ⁶ 细胞。

统计分析

每个实验重复 3 次。数据由SigmaPlot 12.5软件处理，并使用GraphPad Prism 6.02（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）进行统计分析。所有分析中的显着性阈值为P <0.0001.

结果与讨论

用于检测CCRF-CEM的GO-apt荧光适体传感器原理

在这项研究中，GO 和 FAM-apt 被用来设计一种荧光适体传感器来检测 CCRF-CEM 细胞。荧光传感器检测CCRF-CEM细胞的原理如图1所示。在没有CCRF-CEM细胞的情况下，FAM修饰的适配体通过π吸附到GO表面 -π 堆叠。由于 GO 和荧光团离能量转移太近，所以作为淬灭剂，GO 淬灭了 FAM 的荧光。在 CCRF-CEM 细胞存在的情况下，GO-aptamer 的弱结合力使 aptamer 从 GO 表面脱落并与细胞结合，导致荧光恢复。因此，可以根据FAM荧光强度的恢复来相应检测CCRF-CEM细胞的数量。

GO-apt荧光适体传感器检测CCRF-CEM细胞示意图

荧光淬灭和恢复

这种在 CCRF-CEM 细胞存在下淬灭 GO 荧光和返回荧光的连续过程可以通过荧光分光光度计观察到。基于 GO 荧光适配体的整个传感过程如图 2a 所示。由于 FAM 的存在，FAM-apt 在 25 nM Tris-HCl 缓冲液中的荧光光谱呈现强荧光强度（图 2a，曲线 a）。然而，加入GO后，荧光强度显着降低（图2a，曲线b），表明当GO和适体彼此靠近并吸附在一起时，GO能够有效地猝灭荧光。令人惊讶的是，当 5 × 10 ⁶ 加入CCRF-CEM细胞后，淬灭的荧光能够及时恢复（图2a，曲线c）。然而，当加入 CCRF-CEM 细胞时，没有 GO 缀合的 FAM-apt 的荧光强度没有明显变化（图 2a，曲线 d）。 CCRF-CEM 是一种非荧光细胞（图 2a，曲线 e）；因此，荧光恢复主要是由于适配体从石墨烯表面解离并暴露出荧光基团。这些荧光猝灭和恢复实验清楚地说明CCRF-CEM-适配体复合物（CEM-apt）可以防止FAM-apt被GO淬灭，并且CEM与其适配体的结合亲和力比GO强。由于单链适配体和CEM-适配体复合体的结构差异，GO表面的适配体可以与CEM相互作用，然后转化为CEM-适配体复合体。这种现象也清楚地表明 CEM-适配体复合物与适配体的结合比 GO 弱，从而使适配体从 GO 表面脱落。由于 FAM-apt 远离 GO 表面，能量转移效率降低，荧光恢复。在不同条件下对FAM标记的Sgc8适体和CCRF-CEM的荧光发射光谱进行统计分析（图2b）。

Go-apt 检测 CEM 细胞的可行性。 一 FAM-apt 和 CCRF-CEM 细胞在不同条件下的荧光发射光谱：（a）FAM-apt，（b）FAM-apt + GO，（c）FAM-apt + GO + CCFF-CEM，（d）FAM- apt + CCFF-CEM，和 (e) CCRF-CEM； FAM-apt (20 nM)； GO (25 μg/mL)； CCRF-CEM (1 × 10 ⁶ 细胞）。激发波长 490 nm。 b 不同条件下FAM-apt和CCRF-CEM荧光发射光谱的统计分析。 NS 不显着。 ****P <0.0001

GO-apt 荧光适体传感器的表征

为了验证设计，获得了统一和分散的 GO。从图 3a，我们知道厚度为 1.17 nm 的 GO 片具有典型的 AFM 二维外观。然而，厚度为 1.94 nm 的 GO-apt 表明 FAM-apt 已成功吸附到 GO 表面。 FAM-apt 和 GO 的 zeta 电位分别为 - 11.35 和 - 23.90 mV，但是当 GO 与 FAM-apt 非共价相互作用时，zeta 电位的绝对值增加（图 3b）。这些结果表明适体传感器已成功构建。从图 3c，我们知道 GO 在 234 nm 处显示出强吸收，这归因于 π -π * 芳香族 C=C 键的转变。 FAM-apt 的特征在于 DNA 序列 (260 nm) 和 FAM (503 nm) 的吸收带，而将 GO 添加到 FAM-apt 溶液中会导致红移，并且 FAM 在 503 nm 处的吸光度增加。可能的原因是 FAM-apt 吸附在 GO 表面，表明两个 π 之间存在电子相互作用 GO 和基态染料的系统。因此，结果表明GO-apt构建成功。

GO-apt 的表征。 一 GO 和 CEM-apt 的 AFM 图像。 b FAM-apt、GO 和 CEM-apt 的表面 zeta 电位。误差棒表示 ± SD (n =3)。 c (a) GO、(b) FAM-apt 和 (c) GO-apt 的紫外可见吸收光谱

细胞荧光显微镜

为了在细胞水平上直接可视化 FAM-apt 结合的特异性，我们将 CCRF-CEM 和 Ramos 细胞与 Go-apt 一起孵育，然后使用荧光显微镜对其进行分析。与荧光光谱实验一致，FAM-apt可以从Go-apt上脱落，然后与CCRF-CEM细胞结合进行荧光染色，但不能与Ramos细胞结合（图4）。

CCRF-CEM 和 Ramos 细胞与 GO-apt 混合后的荧光显微照片。细胞核用 DAPI 染色。比例尺表示 25 μm

CCRF-CEM检测实验条件优化

为了获得荧光适体传感器的优异性能，对荧光猝灭和恢复时间进行了优化。 FAM-apt 和 GO 的动力学行为，以及 FAM-apt 在具有 CCRF-CEM 细胞的均质 GO 溶液中的动力学行为，通过监测作为淬灭和恢复时间函数的荧光强度来研究（图 5a、b）。如图 5a 所示，可以观察到 FAM-apt 在 GO 存在下作为孵育时间的函数的荧光猝灭。 FAM-apt 迅速吸附到 GO 表面，然后进行能量转移，同时荧光强度显着降低，并在 2 分钟后趋于减慢。相比之下，CEM-apt 形成且从 GO 表面释放较慢。当孵育时间高于 30 分钟时，荧光强度达到平台（图 5b）。这些时间依赖性实验表明，GO作为一种优良的猝灭剂，可以快速猝灭FAM-apt荧光，并在CEM存在下逐渐恢复荧光。

优化实验条件。 一 GO 在 Tris-HCl 缓冲液中对 FAM-apt (20 nM) 的荧光猝灭作为时间的函数。 b CCRF-CEM对GO溶液中FAM-apt的荧光修复（1 × 10 ⁶ ) 作为时间的函数。 c 1 × 10 ⁶ 不存在（曲线a）和存在（曲线b）时GO浓度对FAM-apt荧光强度的影响 CCRF-CEM 细胞。 d 荧光强度率（F /F 0) FAM-apt 由 1 × 10 ⁶ CCRF-CEM 细胞作为 GO 浓度的函数。激发 490 nm

为了使荧光适体传感器对CCRF-CEM的检测更加灵敏，用于优化GO浓度的反应体系变得不可或缺。图 5c 清楚地说明了我们的策略，显示了在 CCRF 不存在（图 5c，曲线 a）和存在（图 5c，曲线 b）的情况下，不同浓度的 GO 对 FAM-apt 荧光强度的影响-CEM。正如我们从图 5c 中看到的，加入 GO 后，荧光信号背景显着降低。图 5d 显示了 FAM-apt 恢复的荧光 1 × 10 ⁶ CEM 细胞作为 GO 浓度的函数。从图 5d，我们可以发现当 GO 浓度为 20 μg/mL 时，F /F 0（其中 F 0 和 F 分别是不存在和存在 CCRF-CEM 时 FAM 在 518 nm 处的荧光强度）获得最高值，即 13.0354。因此，20 μg/mL 被认为是最佳的 GO 浓度。

使用 GO-apt 荧光适体传感器进行 CCRF-CEM 检测

为了获得良好的实验结果，采用最佳实验条件来检测CCRF-CEM。图 6a 显示随着 CCRF-CEM 数量从 0 增加到 1 × 10 ⁷ ，荧光强度也相应增加。此外，F /F 0 显示了在 1 × 10 ² 范围内对 CCRF-CEM 数量的明显线性依赖性 –1 × 10 ⁷ （图 6b）。线性回归方程为 Y (F /F 0) =3.2608 × log C − 5.1892（其中 C 是 CCRF-CEM 的数量），回归系数为 R ² =0.9922。检测限被视为少于十个细胞。因此，基于GO的荧光适体传感具有广泛的检测范围，可作为检测CCRF-CEM的理想生物传感器。与其他方法相比，该方法具有更高的灵敏度（表 1）[34,35,36,37,38,39]。

CEM 细胞的 Go-apt 检测。 一 在不同浓度的 CCRF-CEM 细胞存在下 GO-apt 荧光适体传感器的荧光发射光谱。 b 荧光强度率（F /F 0)和CCRF-CEM细胞浓度

GO-apt 荧光适体传感器的特异性

为了研究 GO-apt 荧光接头的特异性，使用了几种不同的细胞来测试系统，例如 Ramos 细胞、H22 细胞和 293T 细胞。每个100-μL反应系统包括1 × 10 ⁶ 细胞。图 7 显示 CCRF-CEM 获得比其他对照组更高的荧光强度。结果也清楚地表明所设计的荧光适体传感器具有高度特异性。

CEM 荧光适体传感器的特异性。荧光强度率（F /F 0) GO-apt 荧光适体传感器分别在 CEM 细胞、Ramos 细胞、H22 细胞和 293T 细胞存在下 (1 × 10 ⁶ )，其中 F 0 和 F 是在 518 nm 没有和有检测细胞的情况下的荧光强度。激发 490 nm

结论

我们开发了一种方便、低成本、高灵敏度的荧光适体传感器，用于检测 CCRF-CEM 细胞。这种策略巧妙地利用了 π 的非共价键相互作用 -π 石墨烯和单链 DNA 之间的堆叠以及石墨烯淬灭荧光的优越性能。与适配体相比，CEM-适配体复合物与GO的结合较弱，因此被石墨烯猝灭的荧光可以逐渐恢复。在优化条件下，检测限被视为小于 100 个细胞。因此，荧光适体传感器以其优异的性能在肿瘤细胞检测中具有广阔的前景。

更改历史

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

CEM-apt：

CCRF-CEM-适配体复合物

FAM-apt：

FAM标记的Sgc8适体

烦恼：

荧光共振能量转移

开始：

氧化石墨烯

GO-apt：

氧化石墨烯-适配体复合物

PBS：

磷酸盐缓冲盐水