高灵敏度氧化石墨烯荧光适配体传感器快速检测CCRF-CEM白血病细胞

摘要

开发了一种便捷、低成本、高灵敏度的荧光适配体传感器，基于氧化石墨烯-适配体复合物（GO-apt）检测白血病。氧化石墨烯（GO）通过π-π堆积吸附羧基荧光素标记的Sgc8适配体（FAM-apt），并通过荧光共振能量转移（FRET）猝灭荧光。无Sgc8靶细胞CCRF-CEM时，荧光几乎完全被猝灭。反之，加入CCRF-CEM细胞后，被猝灭的荧光可迅速显著恢复。因此，基于荧光信号变化，可在1×10²至1×10⁷ cells/mL宽范围内检测CCRF-CEM细胞数，检测限（LOD）为10 cells/mL。该基于氧化石墨烯的荧光适配体传感器策略在癌症检测中极具前景。

研究背景

白血病是侵袭性常见恶性血液疾病，威胁人类生存与健康，尤其危害儿童和青少年。它不仅影响正常造血细胞，还累及骨髓和免疫系统。因此，白血病早期诊断对治疗和提高患者生活质量至关重要。目前常用检测方法为采集外周血和骨髓，随后进行细胞形态学、细胞化学、免疫表型、免疫组化、适配体基础流式细胞术等多种分析。这些方法虽能检测白血病细胞，但存在成本高、灵敏度低、操作繁琐等缺点。急需寻找低成本、高灵敏、简便的白血病检测新方法。

适配体是通过系统进化配体指数富集（SELEX）筛选的短单链DNA（ssDNA）或RNA。基于特殊三级结构，适配体对包括小分子、蛋白质甚至细胞在内的靶标具有强结合亲和力和高特异性。且适配体易于合成修饰，广泛用作癌症检测探针。基于适配体的功能化纳米材料用于癌症检测也是近年热点，如量子点和二氧化硅纳米颗粒。

氧化石墨烯（GO）作为新型二维平面碳纳米材料，因其良好水溶性、大比表面积和优异荧光猝灭能力受广泛关注。基于这些特性，GO被视为荧光共振能量转移（FRET）中的优秀能量受体，在荧光适配体传感器中应用前景广阔。且GO能通过π-π堆积与适配体结合，但不与双链DNA或适配体-靶标复合物结合。因此，基于石墨烯的适配体传感器比游离适配体探针提高了适配体稳定性。

目前大量研究证实基于GO的荧光适配体传感器检测靶标可行，但鲜有研究利用GO基适配体传感器检测白血病细胞。本文设计基于GO和羧基荧光素标记Sgc8适配体（FAM-apt）的“信号开启”策略检测白血病细胞。GO和适配体分别作为荧光猝灭剂和靶标识别元件。无白血病细胞时，GO与FAM-apt相互作用猝灭几乎所有荧光，检测信号关闭。靶细胞存在时，适配体主动靶向细胞并从GO脱离，导致检测系统荧光恢复，检测信号开启。因此可根据荧光强度变化相应测量靶细胞浓度。

方法

试剂

序列为5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3'的FAM-apt由桑根生物科技有限公司（上海）合成。本工作使用自配Tris-HCl缓冲液，含20 mM Tris-HCl（pH 7.4）、5 mM MgCl₂、100 mM NaCl。适配体用Tris-HCl缓冲液溶解。氧化石墨烯粉末购自南京先锋纳米材料科技有限公司。所有溶液用Milli-Q纯水系统（Millipore，Bedford，MA，USA）制得的18 MΩ超纯水配制。

细胞

CCRF-CEM（人急性淋巴母细胞白血病细胞系）、Ramos（人伯基特淋巴瘤细胞系）、293T（人胚肾细胞系）、H22（小鼠肝癌细胞系）购自中国科学院上海细胞库。所有细胞系在5% CO₂、37°C培养，培养基为含10%胎牛血清（FBS；HyClone）和100 U/mL青霉素-链霉素（Gibco，Grand Island，NY，USA）的RPMI 1640。

仪器

所有荧光光谱和荧光强度由F-7000荧光分光光度计（日立，东京，日本）测定记录。使用700 µL石英比色皿盛样品。基于羧基荧光素（FAM）特征峰波长，以490 nm激发，518 nm检测发射。

原子力显微镜（AFM）成像由SPI3800N显微镜（精工仪器，东京，日本）完成。

GO、FAM-apt和氧化石墨烯-适配体复合物（GO-apt）的Zeta电位由纳米粒度、Zeta电位和绝对分子量分析仪（Zetasizer Nano ZS，Malvern，UK）测定。

GO、FAM-apt和GO-apt的UV-可见吸收光谱在NanoDrop 2000（Thermo，USA）记录。

GO-apt荧光适配体传感器制备

氧化石墨烯粉末溶于Milli-Q纯水并超声分散得1 mg/mL均匀黑色溶液。用20 mM Tris-HCl缓冲液稀释母液，得20 nM FAM-apt。混合1 µL FAM-apt（10 µM）和10 µL GO溶液（1 mg/mL），再用Tris-HCl缓冲液稀释至500 µL。

细胞成像

CCRF-CEM和Ramos细胞在六孔板（每孔5×10⁵细胞）培养12 h。用冷磷酸缓冲液（PBS）洗涤两次，在4°C避光下与GO-apt溶液孵育30 min。再洗三次，用4%聚甲醛固定20 min。再次PBS洗涤后，用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI；Life Co.，USA）避光染色5 min。最后PBS洗三次，荧光显微镜（Nikon DS-Ri1；日本）观察。

CCRF-CEM细胞检测

CCRF-CEM细胞离心收集，悬浮于1 mL PBS中。不同浓度CCRF-CEM细胞（0至1.0×10⁷/mL）与GO-apt荧光适配体传感器在4°C避光孵育30 min。孵育后，在560–500 nm波长范围荧光光谱检测。检测限（LOD）按3σ/S估算，σ为GO-apt溶液标准差（n=10），S为线性方程斜率。

特异性实验

为考察GO基荧光适配体传感器特异性，测试Ramos、H22、293T等不同细胞。每100 µL反应体系含1×10⁶细胞。

统计分析

每个实验重复三次。数据用SigmaPlot 12.5处理，GraphPad Prism 6.02（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）统计分析。所有分析显著性阈值P<0.0001。

结果与讨论

GO-apt荧光适配体传感器检测CCRF-CEM的原理

本研究利用GO和FAM-apt设计荧光适配体传感器检测CCRF-CEM细胞。检测原理如图1所示。无CCRF-CEM细胞时，FAM修饰适配体通过π-π堆积吸附于GO表面。因GO与荧光基团距离极近发生能量转移，作为猝灭剂，GO猝灭FAM荧光。有CCRF-CEM细胞时，GO-适配体弱结合力使适配体脱离GO表面并结合细胞，导致荧光恢复。因此可根据FAM荧光强度恢复相应检测CCRF-CEM细胞数。

GO-apt荧光适配体传感器检测CCRF-CEM细胞示意图

荧光猝灭与恢复

GO猝灭荧光及CCRF-CEM细胞存在下荧光恢复的连续过程可用荧光分光光度计观察。基于GO-荧光适配体的完整传感过程见图2a。25 nM Tris-HCl缓冲液中FAM-apt荧光光谱因FAM存在呈强荧光强度（图2a，曲线a)。但加入GO后，荧光强度显著降低（图2a，曲线b），表明GO在与适配体紧密吸附时能高效猝灭荧光。惊人地，加入5×10⁶ CCRF-CEM细胞后，被猝灭荧光及时恢复（图2a，曲线c）。然而，无GO结合的FAM-apt加入CCRF-CEM细胞后荧光强度无明显变化（图2a，曲线d）。CCRF-CEM为非荧光细胞（图2a，曲线e）；因此荧光恢复主要因适配体从石墨烯表面解离并暴露荧光基团。这些荧光猝灭恢复实验清楚说明CCRF-CEM-适配体复合物（CEM-apt）可防止FAM-apt被GO猝灭，且CEM对其适配体的结合亲和力强于GO。得益于单链适配体与CEM-适配体复合物的结构差异，GO表面适配体可与CEM相互作用并转化为CEM-适配体复合物。此现象也清晰表明CEM-适配体复合物对适配体的结合弱于GO，从而允许适配体脱离GO表面。因FAM-apt远离GO表面，能量转移效率降低，荧光得以恢复。在不同条件下对FAM标记Sgc8适配体和CCRF-CEM的荧光发射光谱进行统计分析（图2b）。

GO-apt检测CEM细胞可行性。a 不同条件下FAM-apt和CCRF-CEM细胞荧光发射光谱：(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 μg/mL); CCRF-CEM (1×10⁶ cells). 激发490 nm. b 不同条件下FAM-apt和CCRF-CEM荧光发射光谱统计分析. NS无显著差异. ****P<0.0001

GO-apt荧光适配体传感器表征

为验证设计，获得均匀分散GO。图3a显示厚度1.17 nm的GO片呈典型二维外观（AFM）。而厚度1.94 nm的GO-apt显示FAM-apt成功吸附于GO表面。FAM-apt和GO的Zeta电位分别为-11.35和-23.90 mV，但GO与FAM-apt非共价相互作用后，Zeta电位绝对值增加（图3b）。这些结果表明适配体传感器构建成功。图3c显示GO在234 nm处有强吸收，归因于芳香C=C键的π-π*跃迁。FAM-apt以DNA序列（260 nm）和FAM（503 nm）吸收带为特征，而向FAM-apt溶液加入GO导致红移且503 nm处FAM吸收增加。可能原因是FAM-apt吸附于GO表面，指示GO与染料两个π体系在基态下的电子相互作用。因此结果表明GO-apt构建成功。

GO-apt表征。a GO和CEM-apt的AFM图像。b FAM-apt、GO和CEM-apt的表面Zeta电位。误差棒表示±SD（n=3）。c (a) GO, (b) FAM-apt, (c) GO-apt的UV-可见吸收光谱

细胞荧光显微成像

为直接可视化脱离FAM-apt在细胞水平的特异性结合，将CCRF-CEM和Ramos细胞与GO-apt孵育后荧光显微镜分析。与荧光光谱实验一致，FAM-apt可从GO-apt脱离并结合CCRF-CEM细胞进行荧光染色，但不结合Ramos细胞（图4）。

CCRF-CEM和Ramos细胞与GO-apt孵育后的荧光显微图像。细胞核用DAPI染色。比例尺25 μm

CCRF-CEM检测实验条件优化

为获得优异荧光适配体传感器性能，优化荧光猝灭和恢复时间。通过监测荧光强度随猝灭和恢复时间的函数，考察FAM-apt与GO以及含CCRF-CEM细胞均匀GO溶液中FAM-apt的动力学行为（图5a,b）。图5a显示FAM-apt在GO存在下荧光猝灭随孵育时间的函数。FAM-apt快速吸附于GO表面，随之发生能量转移，荧光强度显著降低并在2 min后趋缓。相反，CEM-apt形成并从GO表面释放较慢。孵育时间>30 min时荧光强度达平台（图5b）。这些时间依赖实验显示GO作为优秀猝灭剂快速猝灭FAM-apt荧光，在CEM存在下逐渐恢复荧光。

实验条件优化。a GO随时间猝灭FAM-apt (20 nM) 在Tris-HCl缓冲液中的荧光。b CCRF-CEM (1×10⁶) 使GO溶液中FAM-apt荧光恢复随时间变化。c 不同GO浓度对无（曲线a）和有（曲线b）1×10⁶ CCRF-CEM细胞时FAM-apt荧光强度的影响。d 1×10⁶ CCRF-CEM细胞使FAM-apt荧光强度比(F/F₀)随GO浓度变化。激发490 nm

为使荧光适配体传感器对CCRF-CEM检测更灵敏，优化反应体系GO浓度必不可少。图5c清晰展示策略：不同GO浓度下无（图5c曲线a）和有（图5c曲线b）CCRF-CEM时FAM-apt荧光强度。由图5c可见，加入GO后荧光背景信号显著降低。图5d显示1×10⁶ CEM细胞恢复FAM-apt荧光随GO浓度变化。由图5d可知，GO浓度20 µg/mL时，F/F₀比值（F₀和F分别为无和有CCRF-CEM时518 nm处FAM荧光强度）达最高值13.0354。因此20 µg/mL为最佳GO浓度。

GO-apt荧光适配体传感器检测CCRF-CEM

为获良好实验结果，采用最优条件检测CCRF-CEM。图6a显示随CCRF-CEM数量从0增至1×10⁷，荧光强度相应增加。此外，F/F₀在1×10²–1×10⁷范围内与CCRF-CEM数量呈明显线性依赖（图6b）。线性回归方程：Y(F/F₀)=3.2608×log C−5.1892（C为CCRF-CEM数量），回归系数R²=0.9922。检测限视为<10个细胞。因此，基于GO的荧光适配体传感具备宽检测范围，可作为理想生物传感器检测CCRF-CEM。与其他方法相比，本法灵敏度更高（表1）。

GO-apt检测CEM细胞。a 不同浓度CCRF-CEM细胞存在下GO-apt荧光适配体传感器荧光发射光谱。b 荧光强度比(F/F₀)与CCRF-CEM细胞浓度的线性关系

GO-apt荧光适配体传感器特异性

为考察GO-apt荧光适配体特异性，用Ramos、H22、293T等不同细胞测试体系。每100 µL反应体系含1×10⁶细胞。图7显示CCRF-CEM荧光强度高于其他对照组。结果清楚表明设计的荧光适配体传感器具有高特异性。

荧光适配体传感器对CEM的特异性。GO-apt荧光适配体传感器在CEM、Ramos、H22、293T细胞存在下（均1×10⁶）的荧光强度比(F/F₀)，F₀和F分别为无和有检测细胞时518 nm荧光强度。激发490 nm

结论

我们开发了一种便捷、低成本、高灵敏度的荧光适配体传感器检测CCRF-CEM细胞。该策略巧妙利用石墨烯与单链DNA间π-π堆积的非共价键相互作用及石墨烯猝灭荧光的优异性能。与适配体相比，CEM-适配体复合物对GO结合较弱，使被石墨烯猝灭的荧光逐渐恢复。优化条件下，检测限视为<100个细胞。基于其优异性能，该荧光适配体传感器在肿瘤细胞检测中具有广阔前景。

修订历史

缩写

AFM

原子力显微镜

CEM-apt

CCRF-CEM-适配体复合物

FAM-apt

FAM标记Sgc8适配体

FRET

荧光共振能量转移

GO

氧化石墨烯

GO-apt

氧化石墨烯-适配体复合物

PBS

磷酸缓冲液