静电纺丝壳聚糖-聚乙烯氧化物/纤维蛋白原支架用于PDGF持续释放与促进伤口愈合

摘要

伤口愈合是由生长因子、细胞迁移和细胞外基质重塑共同调控的多面向过程。尽管生物活性敷料取得进展，但因递送挑战，极少进入临床实践。我们利用双喷头静电纺丝平台，制备由壳聚糖（CS）、聚乙烯氧化物（PEO）和纤维蛋白原（Fb）组成的纳米纤维支架。所得CS-PEO/Fb复合材料呈现纳米级纤维、均匀聚合物分布和良好力学完整性。血小板源性生长因子（PDGF）的掺入未损失生物活性，释放研究显示双相特征：首小时释放21.6% PDGF，随后48小时持续释放。体外成纤维细胞迁移实验证实，支架释放的PDGF效力等同于单次50 ng mL⁻¹剂量，而Fb成分单独也适度促进迁移。复合材料的水蒸气透过率（≈807 g m⁻² day⁻¹）和拉伸强度（≈0.3 MPa）符合临床伤口敷料标准。综上，CS-PEO/Fb静电纺丝支架为持续生长因子递送和加速伤口愈合提供了稳健、生物活性平台。

研究背景

尽管伤口护理取得进展，生物活性敷料的临床转化仍受限。伤口愈合级联反应依赖细胞因子、免疫细胞和基质蛋白的协同互作。生长因子虽效力强，但清除快、半衰期短，需重复给药，增加患者负担。一种能实现持续、局部递送的敷料将显著改善预后和依从性。

PDGF是关键趋化因子，动员中性粒细胞、单核细胞和成纤维细胞，调节基质沉积和疤痕形成。FDA批准的Regranex®凝胶（2.2 µg cm⁻²）可使糖尿病溃疡愈合加速~30%，但每日使用不便。因此，持续释放系统极具吸引力。

静电纺丝提供多功能路线制备模拟天然细胞外基质的纳米纤维膜。胶原、弹性蛋白、纤维蛋白原等天然聚合物具有内在生物活性和生长因子亲和力。然而，纤维蛋白原单独缺乏长期敷料应用所需的力学强度。壳聚糖作为脱乙酰几丁质衍生物，提供抗菌活性，与PEO共混可静电纺丝。CS的多阳离子特性使其难与带负电的Fb共混，但双喷头静电纺丝机克服了静电不相容性，实现均匀复合材料制备。

方法

材料

所有试剂（乙酸、CS、PEO、Fb、HFIP、BSA、DMSO）和细胞系（人真皮成纤维细胞PCS-201-012）购自Sigma-Aldrich或ATCC，现用现取。重组人PDGF-BB购自PeproTech。

支架制备

CS-PEO溶液（5.5 wt%，CS:PEO=2:1）以1%乙酸溶解，含0.5% BSA和10% DMSO。Fb溶于1:9（v/v）HFIP/10×EMEM混合液，浓度110 mg mL⁻¹。PDGF于纺丝前即时加入。双喷头静电纺丝（NE-1000注射泵，18号针头）采用0.7 mL h⁻¹（CS-PEO）和1.0 mL h⁻¹（Fb）流速，电压28 kV和22 kV，25 RPM旋转收集器，距离分别22 cm（CS-PEO）和12.5 cm（Fb）。35–45%相对湿度下纺丝3 h。

形貌

FESEM（Zeiss Sigma VP-40）对镀金样品成像，ImageJ统计纤维直径（n=100/支架）。CS-PEO/Fb纤维平均202±113 nm，细于单独CS-PEO（270±68 nm）和Fb（351±102 nm）。

表面化学

ToF-SIMS（Bi₃²⁺，30 kV）在50×50 µm区域映射特征离子（CNO⁻、CN⁻、C₂H₅O⁺），确认CS-PEO和Fb均匀分布。

水接触角

按ASTM D7334-08测2 µL蒸馏水。CS-PEO/Fb亲水角61.4±7.6°，介于CS-PEO（44.2±5.1°）和Fb（115.7±16.2°）之间。

力学测试

单轴拉伸（Instron E3000，1 mm min⁻¹）测40×25 mm条样（厚度94±7 µm）得应力-应变曲线。CS-PEO/Fb峰值应力0.31±0.02 MPa，超越单独Fb（0.12±0.01 MPa）。

水蒸气透过率

按ASTM E96用硅胶干燥剂法测定；CS-PEO/Fb达806.5±56.1 g m⁻² day⁻¹，处于临床理想范围（≈2000 g m⁻² day⁻¹）。

细胞毒性

间接WST-1实验（ISO 10993-5）120 h显示48 h无显著增殖抑制，72 h轻微下降，可能因CS乙酰化度。

细胞附着

Live/Dead和鬼笔环肽-DAPI染色显示成纤维细胞在支架表面形态健康、附着牢固，与纤维连接蛋白包被对照相当。

降解

支架在FBM（37°C，5% CO₂）中孵育，经初始1 h爆发性失重后呈线性质量损失，≥48 h保持完整性。

PDGF释放

ELISA定量累积释放：2、4、8 µg mL⁻¹负载量下，2、4、8 h释放量分别为1.8±0.7、4.4±1.8、11.4±4.8 ng mg⁻¹。双相模式：首小时释放21.6%。

成纤维细胞迁移

ORIS™迁移实验证实，PDGF负载支架洗脱液诱导的迁移效力等同于单次50 ng mL⁻¹ PDGF，持续效应达48 h。Fb单独也适度促进迁移。

结果与讨论

双喷头静电纺丝成功将CS-PEO和Fb融合为均匀纳米纤维基质，克服静电不相容性。复合材料纤维直径减小归因于喷射排斥增加、沉积时间延长和弯曲不稳定性诱导更细纤维。

ToF-SIMS映射确认表面组分均匀，水接触角显示亲水表面，抑制细菌附着同时支持蛋白吸附。力学测试表明CS-PEO整合恢复了适合伤口敷料的拉伸强度，解决了Fb固有的脆弱性。

WVTR测量将CS-PEO/Fb置于湿性伤口环境的治疗窗口，平衡渗出物管理和氧气渗透性。细胞毒性实验提示残留HFIP或高DA CS浓度极低；支架生物安全性可接受，利于临床转化。

PDGF释放曲线呈理想双相模式：早期爆发释放~21%剂量，随后受控线性释放维持生物相关浓度达48 h。这种持续递送免除了Regranex®所需的每日换药，潜在改善患者依从性。

功能实验证实释放的PDGF保留趋化活性，实现等同于单次高剂量处理的成纤维细胞迁移。Fb内在趋化特性的叠加效应进一步增强细胞招募，提示协同机制。

结论

静电纺丝CS-PEO/Fb纳米纤维支架结合壳聚糖的抗菌和力学优势与纤维蛋白原的生物活性，实现持续、功能性的PDGF递送。其纳米级架构、适宜WVTR和力学稳健性，使其成为下一代伤口敷料的有力候选，可加速成纤维细胞招募和愈合，免除生长因子重复应用的不便。