Ferumoxytol 减弱 MDSC 改善 LPS 诱导的脓毒症免疫抑制的功能

介绍

FMT是美国食品药品监督管理局批准的铁补充剂，已用于治疗慢性肾脏病（CKD）成人缺铁性贫血[1]，FMT也被广泛用作造影剂和药物载体[2] .先前的研究表明 FMT 具有免疫调节特性，例如它能够诱导 M2 巨噬细胞向高 CD86 ⁺ , TNF-α 阳性 M1 巨噬细胞亚型 [3, 4]。然而，FMT对其他免疫细胞的影响尚未研究。

MDSCs 是未成熟髓系细胞的异质群体，具有强大的免疫抑制能力 [5]。在小鼠中，MDSCs 可识别为 Gr-1 ⁺ CD11b ⁺ 细胞，而人类 MDSCs 缺乏 Gr-1 同源物，被定义为 CD14 ^- HLA-DR ^- CD11b ⁺ CD33 ⁺ 或 CD14 ⁺ HLA-DR ^- CD11b ⁺ CD33 ⁺ 细胞 [6]。 MDSCs 由两大类细胞组成，粒细胞或 PMN-MDSCs 和 M-MDSCs，这两个群体都通过产生 iNOS、ROS 和 Arg-1 具有免疫抑制功能。 Arg-1 的活性增加会消耗 L-精氨酸，而 L-精氨酸的缺乏会通过降低 CD3 zeta 链的表达来抑制 T 细胞增殖。 INOS 产生 NO，抑制 T 细胞中 JAK3 和 STAT6 的功能，以及 MHC II 的表达。 ROS 诱导 T 细胞受体的翻译后修饰，并可能导致抗原特异性 T 细胞无反应 [7]。 M-MDSCs 来源于单核细胞前体，在适当的细胞因子条件下可以分化为巨噬细胞和 DCs。我们对 MDSC 的大部分知识都源于癌症研究。近年来，在包括炎症、烧伤和自身免疫性疾病在内的急性和慢性炎症性疾病中也描述了 MDSCs 的扩增 [8, 9]。最近，在成像研究中报道了小鼠食道和脾脏中 MDSC 对荧光纳米颗粒的高水平摄取 [10]。然而，FMT是否改变了参与炎症性疾病发展的MDSCs的功能尚不清楚。

脓毒症是一种对严重感染的失调宿主炎症反应，可导致危及生命的器官功能障碍，是重症监护病房中最常见的死亡原因。脓毒症会引发强烈的促炎反应，如果不及早治疗，会迅速转变为长期免疫抑制。在脓毒症动物模型 [8, 11] 以及脓毒症患者 [12,13,14] 的脾脏和淋巴结中描述了 MDSCs 的扩增。 MDSC 等免疫抑制细胞的激活对于适当控制先天免疫系统的高反应性至关重要，但它们的过度扩增可能导致高免疫抑制，这是晚期败血症继发感染和死亡的主要驱动力。 MDSC 数量的增加与淋巴细胞增殖的抑制相关。据报道，MDSCs 在骨髓中获得它们的表型，然后迁移到次级淋巴器官以抑制 T 细胞反应并抑制它们在 LPS 免疫抑制小鼠中的增殖 [8]。大多数长期脓毒症患者表现出免疫抑制状态，大多数脓毒症死亡是由于晚期脓毒症免疫抑制。通过恢复免疫反应，消除 MDSC 可能对晚期脓毒症产生有益影响 [15]。因此，我们假设FMT可能通过调节MDSCs的功能来减少败血症晚期免疫抑制。

在这里，我们展示了 FMT 对 MDSC 的免疫调节作用。我们利用 FMT 的磁性来揭示 MDSCs 能够在体外吞噬 FMT。此外，我们发现 FMT 通过下调 Arg-1 和 ROS 减弱了 MDSCs 的免疫抑制功能。此外，体内实验证实，FMT 通过削弱 MDSCs 抑制 T 细胞的能力，改善了 LPS 诱导的小鼠败血症晚期。我们的数据表明FMT的免疫调节功能可用于治疗晚期脓毒症的免疫抑制。

材料和方法

小鼠

雄性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄）购自南京大学（中国南京）模型动物研究中心。小鼠在无特定病原体 (SPF) 条件下以 24 小时光/暗循环饲养，并允许自由获取食物和水。所有小鼠实验均经南京大学机构动物护理和使用委员会批准。

普鲁士蓝染色

根据制造商的说明，使用 Perl 的普鲁士蓝染色试剂盒（Solarbio，China）检测细胞内 FMT 分布。简而言之，将细胞在4%多聚甲醛中固定15 分钟，然后与10%亚铁氰化钾孵育25-30 分钟，然后洗涤并用核固红复染10 分钟。细胞质中含有蓝色颗粒的细胞普鲁士蓝染色阳性。

骨髓衍生 MDSC 的生成

通过冲洗野生型小鼠的股骨和胫骨，然后进行红细胞裂解，获得骨髓细胞。骨髓细胞在含有 10% FBS、1% v/v 青霉素和链霉素 (Gibco, CA)、40 ng/mL 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) (Miltenyi Biotech,德国）和 40 ng/mL IL-6（Miltenyi Biotech，德国）在 37 °C 下在 5% CO2 培养箱中培养 4 天。收集未贴壁细胞用于进一步实验。

细胞活力测定

根据制造商的说明，使用 Cell Counting Kit-8（Dojino，Kumamoto，Japan）分析细胞活力。简而言之，MDSCs (5 × 10 ³ ) 接种到 96 孔培养板中，并在处理前在 37 °C 的 5% CO2 气氛中培养。然后将培养基更换为含有不同浓度 FMT（250、500、1000、2000 μg/mL）的新鲜培养基，持续 24 小时。随后弃去上清液并加入含有 CCK-8 溶液的新鲜培养基。 37 °C孵育3小时后，使用Gen5酶标仪（BioTek，美国）在450 nm处测量吸光度。

总 RNA 的分离和实时 PCR

使用 TRIzol 试剂（Invitrogen，美国）从细胞中提取总 RNA，并使用 Nanodrop 分光光度计（Thermo Scientific，美国）定量，然后使用 HiScript II 第一链 cDNA 合成试剂盒（Vazyme Biotech Co., Ltd，中国）进行逆转录根据制造商的说明。使用 SYBR Green PCR 试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA）在 Applied Biosystems StepOne-Plus 实时 qPCR 系统（Applied Biosystems，Forster City，CA）上进行实时定量聚合酶链反应 (PCR)。使用 2 ^−ΔΔCt 将基因表达标准化为 GAPDH 方法。引物序列列于附加文件1：表S1。

流式细胞术

将组织制备为含有 D 型胶原酶 (1 mg/mL) 和 DNase I (0.1 mg/mL) 在 Hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 中的单细胞悬液，在 37 °C 下保持 30 分钟，然后将脾脏被溶解。将细胞悬液通过 70-μm 细胞过滤器过滤，并通过在 4 °C 下以 300 g 离心 5 分钟收集淋巴细胞。洗涤后，细胞立即准备用于荧光激活细胞分选。单细胞与 FcR 封闭试剂（Miltenyi Biotech，德国）孵育 10 分钟，然后用以下抗体偶联物染色 20 分钟：FITC 标记的抗 CD11b、抗 CD11c、抗 CD4 和抗 CD8； PE标记的抗Ly6G； APC 标记的抗 Ly6C、抗 CD3、抗 F4/80 和抗 MHC II (BioL​​egend, CA)。洗涤后，用 FACS Calibur (BD, CA) 检测细胞，用 FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., USA) 分析数据

H&E 染色

肝和肺组织固定在 4% 磷酸盐缓冲的甲醛中。固定组织石蜡包埋，5 μm厚切片苏木精伊红染色光镜观察。

酶联免疫吸附测定

根据制造商的说明，使用特定的 ELISA 试剂盒（Dakewe，中国）测定 TNFα、MCP-1 和 IL-1β 的血清水平。每个样品重复运行。

检测ROS

根据制造商的说明，使用 2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯 (DCFH-DA) 试剂盒（Beyotime，中国）测量细胞内 ROS。简而言之，将细胞用 PBS 洗涤两次，并与 5 μM DCFH-DA 在 37 °C 下在黑暗中孵育 30 分钟，然后用 RPMI-1640 培养基洗涤并重悬于 PBS 中。使用流式细胞仪（BD，CA）分析细胞内的绿色荧光。

T 细胞增殖试验

总 CD3 ⁺ 使用 CD3ε MicroBead 试剂盒（Miltenyi Biotech，德国）从野生型小鼠的脾脏中富集 T 细胞，并孵育 CFSE 染色剂（Invitrogen，美国）。对于抗 CD3/CD28 抗体诱导的 T 细胞增殖，用抗 CD3 抗体 (1 μg/mL) 和抗 CD28 抗体 (1 μg/mL) 激活 T 细胞。 G-MDSCs（Gr-1 ^高 Ly-6G ⁺ ) 和 M-MDSCs (Gr-1 ^dim Ly-6G ⁻ ) 使用髓样衍生抑制细胞分离试剂盒 (Miltenyi Biotech, Germany) 根据制造商说明从 FMT 处理或载体处理的小鼠的脾脏中分离。 MDSCs以1:1的比例与CFSE标记的CD3 ⁺ 共培养 T 细胞在 96 孔平底板中放置 3 天。 CFSE 在每次分裂的子细胞中均分；因此，通过流式细胞术测定增殖。分选后细胞纯度>90%。

统计和数据分析

所有统计数据均使用 GraphPad Prism 6 软件 (GraphPad Software, CA) 计算，并表示为平均值 ± 标准偏差 (SD)。 Mann-Whitney U 分析了两组之间的差异 测试或未配对，双尾学生的 t 测试。单向方差分析用于多组的比较。所有实验至少重复 3 次。与 p 的区别 值 <0.05 被认为具有统计学意义。

结果

大量 MDSC 摄取 FMT

为了验证内化 FMT 的细胞是否被 MACS MicroBeads 分离，我们使用普鲁士蓝染色检测用 FMT (1000 ng/mL) 处理 24 h 的巨噬细胞中的细胞内铁含量。将细胞分为三组：磁分离前，磁选（FMT+）的FMT阳性细胞和未磁分离的（FMT-）。普鲁士蓝染色表明大多数磁性选择的细胞是普鲁士蓝阳性的（图 1a）。为了比较 MDSCs、巨噬细胞和 DCs 之间吞噬 FMT 的能力，我们从用 FMT 处理 6 h、12 h、24 h 和 48 h 的幼稚 C57BL/6 小鼠中分离出脾细胞。脾细胞分为两个亚群：磁分离前和 FMT 阳性细胞。流式细胞术分析显示，近 60% 的 MDSCs 和超过 60% 的巨噬细胞在 12-48 h 后积累了 FMT（图 1b、c）。只有大约 40% 的 DC 在 24 h 时 FMT 呈阳性。这些数据表明，与巨噬细胞一样，MDSCs 可以摄取 FMT，提示 FMT 可能影响 MDSC 的功能。

MDSCs、巨噬细胞和 DCs 吸收 FMT 的能力。 一 巨噬细胞用 FMT (1000 ng/mL) 处理 24 h，然后用普鲁士蓝染色以确定三组细胞中铁的存在和沉积：磁分离前，磁选 (FMT+)，未磁分离 (FMT-) . b 来自幼稚 C57BL/6 小鼠的脾细胞与 FMT 孵育 6 小时、12 小时、24 小时和 48 小时。两个亚组中 MDSC、巨噬细胞和 DC 百分比的 FACS 分析：磁分离前，FMT 阳性细胞。 c FMT 阳性细胞与磁分离前细胞的比率。所有数据代表每个实验组的三个独立实验，并显示为平均值±标准偏差

FMT 在体外抑制 MDSCs 的扩增

据报道，FMT 诱导 M2 巨噬细胞的表型转变为高 CD86 ⁺ , TNF-α 阳性 M1 巨噬细胞亚型 [3]。由于有大量的 MDSCs 可以占用 FMT，我们假设 FMT 可能会改变 MDSCs 的功能。首先，通过 CCK8 细胞活力测定法评估 FMT 在 250、500、1000 和 2000 μg/mL 对 MDSC 的细胞毒性作用。结果表明，FMT 在低剂量下对细胞活力没有影响，仅在 2000 μg/mL 的最大剂量下表现出中等的细胞毒性（图 2a）。然后我们测试了不同浓度的 FMT 是否会影响 MDSCs 的产生。从幼稚 C57BL/6 小鼠分离的骨髓细胞用中等或不同浓度的 FMT（250、500、1000 和 2000 μg/mL）处理 4 天，然后在第 4 天通过流式细胞术进行表征。GM-CSF 和在第0天加入IL-6。三个独立实验的结果表明，FMT在1000和2000 μg/mL时显着降低了MDSCs的扩增（图2b、c）。

CD11b ⁺ 百分比的流式细胞术定量 Gr-1 ⁺ 在体外用 FMT 以 250、500、1000、2000 μg/mL 处理后的细胞。 一 在用不同浓度的 FMT 处理 24 h 后，使用 CCK8 测定法检测 MDSC 细胞活力。 b , c 从 C57BL/6 小鼠中分离的骨髓细胞在不同浓度 FMT 存在下与 GM-CSF 和 IL-6 培养 4 天，并通过流式细胞术评估细胞表型。所有数据代表每个实验组的三个独立实验，并显示为平均值±标准偏差。 *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001 由未配对学生的 t 确定 测试与单独用赋形剂处理的细胞对比

FMT 降低 MDSCs 的免疫抑制能力

MDSCs 使用多种机制来抑制 T 细胞的增殖和效应器功能，最好的描述是产生 ROS 和 Arg-1。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (NOX) 复合物的 p47phox 组分的表达是 MDSC 中 ROS 产生的原因 [5]。据报道，S100A8/A9 由 MDSC 在自分泌炎症环中合成和分泌，这在抑制小鼠模型中的树突细胞功能方面很重要 [16]。为了确定 FMT 是否可以改变 MDSCs 的功能，我们如前所述获得了 BM 衍生的 MDSCs，并使用 RT-PCR 来测量 FMT 处理的 MDSCs 与未处理的对照中的 mRNA 表达。结果显示，与未处理的 MDSC 相比，FMT 处理的 MDSC 显着下调了 Arg-1、S100A8、S100A9 和 p47phox 的表达水平（图 3a-h）。接下来，我们评估了对照 MDSC 和 FMT 处理的 MDSC 中的 ROS 水平。结果表明，FMT 处理的 MDSC 显示出显着低于对照细胞的 ROS 水平（图 3i，j）。我们随后比较了 FMT 治疗组和未治疗组中 MDSC 亚群的变化。结果表明，FMT 降低了 G-MDSCs 的百分比，同时观察到 M-MDSCs 略有增加（图 3k，l）。

FMT 在体外改变 MDSCs 的功能。用载体或 FMT 处理骨髓来源的 MDSC 24 小时。 一 –h 通过定量 RT-PCR 测量，来自处理过的 MDSC 的 Arg-1、S100A8、S100A9 和 p47phox 基因表达。 我 BM 衍生的 MDSC 与 FMT 一起孵育 24 h，并通过 FCM 检测 ROS 的产生。 j i的定量数据 . k FMT 治疗组和对照组中 MDSCs 的亚群。 我 G-MDSCs 和 M-MDSCs 百分比的 FACS 分析。所有数据代表每个实验组的三个独立实验，并显示为平均值±标准偏差。 *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001 由未配对学生的 t 确定 测试与单独用赋形剂处理的细胞对比

FMT 促进 MDSCs 分化为巨噬细胞

为了确定 FMT 是否刺激 MDSC 最终分化为巨噬细胞，我们在第 0 天用 1000 μg/mL FMT 处理细胞，并在第 1、3 和 5 天对巨噬细胞相关标志物 CD11b 和 F4/80 进行流式细胞术。结果表明，加入1000 μg/mL FMT后1天，巨噬细胞的比例与未经处理的细胞相比显着增加了2倍以上。同样，FMT处理后3天和5天，巨噬细胞的比例也显着增加（图4a，b）。

FMT对MDSCs分化的影响。 一 , b 用或不用 1000 μg/mL FMT 处理骨髓来源的 MDSC，并在 1 天、3 天和 5 天后通过 FACS 评估巨噬细胞的数量。所有数据代表每个实验组的三个独立实验，并显示为平均值±标准偏差。 *p <0.05，与单独用载体处理的细胞相比

FMT 改善 LPS 诱导的败血症小鼠的症状

据报道，败血症与组织损伤有关，并导致器官衰竭和内皮功能障碍 [17]。为了研究 FMT 是否减少晚期败血症症状，10 天后评估了实验小鼠器官损伤的程度。 LPS 诱导的败血症肺组织病理学检查表明，与载体处理的小鼠相比，FMT 减少了白细胞募集和肺泡壁增厚。 H&E 染色还显示，与载体处理的小鼠相比，FMT 处理的小鼠的肝坏死面积更小（图 5a、b）。此外，作为这些动物肝功能障碍生化标志物的天冬氨酸转氨酶血清水平在 FMT 处理的小鼠肝脏中显着低于对照（图 5c）。然而，FMT 不影响丙氨酸氨基转移酶的水平（图 5d）。此外，脓毒症被认为与不良后果有关，例如炎症细胞因子的产生增加；因此，我们评估了血清中促炎细胞因子水平的变化。在 LPS 注射后 3 小时，FMT 处理的小鼠血清中的 TNF-α 水平略有降低，但不显着降低，并且在 FMT 处理的小鼠和载体之间未观察到 MCP-1 或 IL-1β 水平的差异处理的小鼠（图 5e-g）。

FMT 可改善 LPS 诱导的败血症小鼠的肝损伤。 一 小鼠接受 PBS 或 i.p.在第 0 天注射 5 mg/kg 体重的细菌 LPS。在 1 h 和 5 天后，通过尾静脉给予 FMT，剂量为 10 mg/kg 或 100 μL 生理盐水。小鼠被分为四组（n =6)：控制、接收车辆； LPS，只接收LPS； FMT，只接收FMT；和 LPS + FMT，接收 LPS 和 FMT。 b 肺和肝组织用苏木精和伊红染色。 c-d 测量血清转氨酶（ALT 和 AST） (n =6）。通过ELISA测量细胞因子水平（TNF-α、IL-1β和MCP-1）。 e -g LPS 诱导的败血症对媒介物或 ferumoxytol 处理的小鼠中细胞因子产生的影响。在 i.p. 后通过 ELISA 测量载体或 ferumoxytol 处理的小鼠血清中的细胞因子水平。 LPS 攻击（50 mg/kg）。 **p <0.01 由未配对学生的 t 确定 测试

FMT 减少 LPS 诱导的败血症小鼠脾脏中 MDSC 的数量

越来越多的证据支持败血症相关的免疫抑制会增加死亡率 [18]，并且 MDSC 被认为是免疫抑制网络的主要组成部分 [8]。据报道，G-MDSCs 在脓毒症患者中更具体地扩增，似乎是脓毒症诱导的免疫抑制的主要参与者 [12]。为了确定 FMT 是否调节野生型小鼠的 MDSC 群，在第 1 小时和第 5 天通过尾静脉对 C57BL/6 小鼠进行 FMT。结果表明，在脾脏或骨骼中未检测到 MDSC 百分比的显着差异对照和 FMT 处理的小鼠之间的骨髓（图 6a、e）。值得注意的是，FMT 降低了 CD11b ⁺ 的 LPS 依赖性扩增 Gr-1 ⁺ 骨髓和脾脏中的细胞（图 6a，e），这与体外研究一致。此外，FMT 还降低了脾脏中 G-MDSCs 和 M-MDSCs 的百分比，而骨髓中仅 G-MDSCs 的百分比降低（图 6c，g）。这些数据表明FMT减少了LPS诱导的脓毒症小鼠脾脏中MDSCs的数量。

FMT 减少了 LPS 诱导的败血症小鼠中 MDSC 的数量。小鼠被分为四组（n =6)：控制、接收车辆； LPS，只接收LPS； FMT，只接收FMT；和 LPS + FMT，接收 LPS 和 FMT。 一 CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ FACS 检测骨髓中的细胞群。 b a的定量数据 . c 门控 CD11b ⁺ 中 Ly6C 和 Ly6G 表达的流式细胞术点图 来自脾脏的细胞。 d 粒细胞和单核细胞亚群百分比的量化。 e CD11b ⁺ Gr-1 ⁺ 通过 FCM 检测脾脏中的细胞群。 f e的定量数据 . g 来自脾脏的门控 CD11b+ 细胞中 Ly6C 和 Ly6G 表达的流式细胞术点图。 h 粒细胞和单核细胞亚群百分比的量化。 *p <0.05 由未配对学生的 t 确定 测试

FMT 在体内降低 MDSC 的 T 细胞免疫抑制特性

多种免疫细胞群（包括 CD4 和 CD8 T 细胞）的数量减少是败血症后适应性免疫反应的主要特征。它与死亡风险增加以及其他不良结局相关 [19, 20]。已经表明，MDSCs 通过削弱脓毒症患者中 T 细胞 zeta 链的表达来抑制 T 细胞增殖 [21]。为了评估晚期败血症中淋巴细胞的比例，我们测量了鼠败血症模型中 CD4 和 CD8 T 细胞的比例。结果表明，FMT 导致 LPS 诱导小鼠脾脏中 CD4 和 CD8 T 细胞的增加（图 7a、b）。与对照小鼠相比，FMT 处理的小鼠脾脏中 CD4 和 CD8 T 细胞的百分比没有差异（图 7a、b）。为了进一步证实 MDSCs 在体内抑制 T 细胞增殖的作用，通过 MACS 从载体或 FMT 处理的 LPS 攻击小鼠的脾脏中分离 G-MDSCs 和 M-MDSCs，并与 CD3 T 细胞以 1:1 的比例共培养比率。我们的结果表明 FMT 处理降低了 G-MDSCs 和 M-MDSCs 的 T 细胞免疫抑制功能（图 7e，f）。此外，我们还测量了从小鼠脾脏中分离的 MDSC 中 Arg-1 和 p47phox 的表达水平。正如预期的那样，脾脏 CD11b ⁺ 中 Arg-1 和 p47phox 基因的表达显着降低 Gr-1 ⁺ 与 LPS 攻击的小鼠相比，从 FMT 处理的 LPS 攻击的小鼠中分离的细胞（图 7g，h）。这些数据表明FMT通过减少Arg-1和ROS的产生来降低MDSCs的免疫抑制功能，提示FMT可能减轻晚期败血症的长期免疫抑制作用。

FMT 降低了 MDSC 的免疫抑制特性。 一 CD3 ⁺ CD4 ⁺ 通过FACS检测脾脏中的细胞群。 b a的定量数据 . c CD3 ⁺ CD8 ⁺ 通过FACS检测脾脏中的细胞群。 d a的定量数据 . e FACS 测定小鼠 G-MDSCs 抑制抗 CD3/CD28 刺激诱导的 T 细胞增殖的能力 (n =每组 3 个）。显示了代表性的直方图。 f 通过 FACS 测量来自媒介物或 FMT 处理的 LPS 攻击小鼠的 M-MDSCs 抑制抗 CD3/CD28 刺激诱导的 T 细胞增殖的能力（n =每组 3 个）。显示了代表性的直方图。 g , h 载体或经 FMT 处理的 LPS 攻击小鼠 MDSCs 中 Arg-1 和 p47phox mRNA 的表达

讨论

FDA 批准的铁补充剂 FMT 已被广泛用作 MRI 扫描中的药物载体和造影剂。发现 FMT 通过诱导具有 M1 巨噬细胞极化的促炎免疫反应来抑制癌症生长 [3]，表明 FMT 具有免疫调节功能。在这项研究中，我们通过比较 FMT 处理的 MDSC 与对照未处理的 MDSC 的表型和功能来评估 FMT 对 MDSC 的影响。先前的研究表明 MDSCs 能够吸收磁性纳米粒子 [10]，我们的数据进一步证明 FMT 通过下调 Arg-1 和 ROS 减弱脾脏中 MDSCs 的免疫抑制功能。我们的数据还表明 FMT 对 MDSC 分化有直接影响，在体外实验中，大约五分之一的细胞在 5 天后均匀分化为巨噬细胞。虽然我们没有研究暴露于 FMT 的巨噬细胞的表型，但我们假设它们属于促炎 M1 亚型。结果清楚地表明，FMT 改善了 MDSCs 的分化和成熟，因此表明这是我们在败血症晚期观察到的 MDSC 数量减少的基础。

脓毒症引发复杂的免疫反应，随着时间的推移而变化，并伴有促炎和抗炎反应。先前的研究表明，脓毒症早期的死亡是由于过度的炎症。 Derive 及其同事报告称，将第 10 天的 MDSC 过继转移到脓毒症小鼠中可减弱腹膜细胞因子的产生并提高存活率 [22]。最近，Namkoog 等人。观察到克拉霉素预处理通过扩大 CD11b ⁺ 提高了 LPS 诱导休克小鼠模型的存活率 Gr-1 ⁺ 细胞群[23]。他们描述了 MDSCs 在败血症中发挥保护作用，但是，应该指出的是，他们关注败血症的早期阶段。 Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.

Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.

结论

This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.

数据和材料的可用性

当前研究中使用和/或分析的数据集可根据合理要求向相应作者索取。

缩写

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS：

Phosphate-buffered saline solution

ROS：

活性氧

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α