费鲁米托降低MDSC活性缓解脓毒症晚期LPS诱导的免疫抑制

摘要

脓毒症诱导的免疫抑制是治疗失败的主要原因之一。髓系源性抑制细胞（MDSC）在脓毒症中扩增，具有强免疫抑制功能。费鲁米托（FMT）是FDA批准的铁补充剂，在肿瘤中显示免疫调节作用，但其是否通过改变MDSC功能减轻晚期脓毒症免疫抑制尚不清楚。本研究首次证实FMT通过抑制MDSC扩增、下调Arg-1、S100A8、S100A9、p47phox表达及ROS产生，促进MDSC向巨噬细胞分化，减少肺部白细胞浸润和肝脏坏死，降低脾脏G-MDSC和M-MDSC比例，逆转其对T细胞的抑制功能，显著改善LPS诱导的晚期脓毒症小鼠免疫抑制。机制上，FMT通过降低Arg-1和ROS抑制MDSC免疫抑制功能，为晚期脓毒症免疫抑制治疗提供新策略。

引言

费鲁米托（FMT）作为FDA批准的铁剂，用于慢性肾病贫血治疗，也广泛用作MRI造影剂和药物载体。既往研究显示FMT能诱导M2巨噬细胞向M1表型转化，具有免疫调节潜力，但其对其他免疫细胞（特别是MDSC）的影响未被探明。

MDSC是具有强免疫抑制功能的未成熟髓系细胞异质群，小鼠标记为Gr-1⁺CD11b⁺，人类为CD14⁻HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺或CD14⁺HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺。分为粒细胞性（G-MDSC/PMN-MDSC）和单核性（M-MDSC）两大亚群，均通过iNOS、ROS、Arg-1抑制T细胞。Arg-1消耗L-精氨酸抑制T细胞增殖；iNOS产生的NO抑制JAK3/STAT6及MHC II；ROS导致TCR翻译后修饰致抗原特异性T细胞无反应。M-MDSC可在细胞因子诱导下向巨噬细胞和DC分化。

MDSC扩增见于癌症、急慢性炎症、烧伤、自身免疫病及脓毒症模型和患者。脓毒症早期过度炎症若不控制，快速转为长期免疫抑制，MDSC过度扩增导致继发感染和晚期死亡。消除MDSC可恢复免疫应答，改善晚期脓毒症预后。本研究假设FMT可调节MDSC功能减轻晚期免疫抑制。

材料与方法

动物

8-10周雄性C57BL/6小鼠，SPF级饲养，南京大学动物实验伦理委员会批准。

普鲁士蓝染色

检测细胞内铁含量，4%多聚甲醛固定，10%亚铁氰化钾孵育25-30 min，核固红复染，胞浆蓝色颗粒为阳性。

骨髓源性MDSC制备

股骨/胫骨冲出骨髓细胞，裂解红细胞后，含GM-CSF和IL-6（各40 ng/mL）的RPMI-1640完全培养基培养4天，收集非贴壁细胞。

细胞活力检测

CCK-8法，MDSC接种96孔板，FMT浓度250-2000 μg/mL处理24h检测。

实时PCR

TRIzol提取RNA，HiScript II逆转录，SYBR Green qPCR，GAPDH内参，2⁻ΔΔCt法分析。

流式细胞术

组织单细胞悬液制备，抗体染色：FITC抗CD11b/CD11c/CD4/CD8，PE抗Ly6G，APC抗Ly6C/CD3/F4/80/MHC II，FACS Calibur检测，FlowJo分析。

H&E染色

肝肺组织石蜡切片，苏木精-伊红染色光镜观察。

ELISA

检测血清TNF-α、MCP-1、IL-1β。

ROS检测

DCFH-DA探针，流式细胞术检测绿色荧光。

T细胞增殖实验

脾脏CD3⁺ T细胞分离，CFSE标记，抗CD3/CD28激活。分选脾脏G-MDSC（Gr-1^high Ly-6G⁺）和M-MDSC（Gr-1^dim Ly-6G⁻），1:1共培养3天，流式检测CFSE稀释度评估增殖。

统计学

GraphPad Prism 6，均数±SD，Mann-Whitney U检验或t检验，单因素ANOVA多组比较，p<0.05为显著差异，实验重复≥3次。

结果

大量MDSC摄取FMT

普鲁士蓝染色证实磁选分离的巨噬细胞多为铁阳性。流式分析显示，天真小鼠脾脏细胞孵育FMT 12-48h后，约60% MDSC和>60%巨噬细胞摄取FMT，而DC仅约40%（24h）。提示FMT可能影响MDSC功能。

FMT体外抑制MDSC扩增

CCK-8显示低剂量FMT无细胞毒性，仅2000 μg/mL轻度细胞毒性。骨髓细胞培养中加入FMT，1000和2000 μg/mL显著减少CD11b⁺Gr-1⁺细胞比例，抑制MDSC扩增。

FMT降低MDSC免疫抑制能力

qPCR显示FMT处理MDSC显著下调Arg-1、S100A8、S100A9、p47phox mRNA。流式检测ROS水平显著降低。亚群分析显示FMT降低G-MDSC比例，M-MDSC轻度增加。

FMT促进MDSC向巨噬细胞分化

1000 μg/mL FMT处理骨髓源MDSC，第1、3、5天流式检测CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞比例显著升高（>2倍），促进终末分化。

FMT改善LPS脓毒症小鼠症状

LPS（5 mg/kg腹腔注射）建模，1h和5天尾静脉注射FMT（10 mg/kg）。10天后病理检查：FMT减少肺部白细胞浸润和肺泡壁增厚，减小肝脏坏死面积。血清AST显著降低，ALT无变化。早期炎症因子（TNF-α、MCP-1、IL-1β）水平FMT组无显著差异，提示FMT不加重早期炎症。

FMT减少脓毒症小鼠脾脏MDSC数量

FMT（1h和5天给药）不影响正常小鼠脾脏/骨髓MDSC比例，但显著抑制LPS诱导的CD11b⁺Gr-1⁺细胞扩增（脾脏和骨髓）。脾脏中G-MDSC和M-MDSC比例均下降，骨髓仅G-MDSC下降。

FMT体内逆转MDSC对T细胞的抑制

LPS组脾脏CD4⁺/CD8⁺ T细胞比例降低，FMT治疗显著升高。分选脾脏G-MDSC和M-MDSC与CD3⁺ T细胞共培养，FMT组两亚群抑制T细胞增殖能力均减弱。脾脏CD11b⁺Gr-1⁺细胞中Arg-1和p47phox mRNA显著下调。证实FMT通过降低Arg-1和ROS减轻MDSC免疫抑制，改善晚期脓毒症免疫抑制。

讨论

FMT作为FDA批准药物，安全性明确（铁核包裹碳水化合物壳，低毒性、溶酶体降解、代谢周期约2个月，无肝毒性）。本研究首证FMT减弱MDSC免疫抑制功能：下调Arg-1/ROS，促进MDSC向巨噬细胞分化（推测为促炎M1型），减少MDSC数量。脓毒症早期MDSC可能有保护作用（如减轻细胞因子风暴），但晚期过度扩增导致持续免疫抑制、继发感染和死亡。区分脓毒症早晚期研究MDSC角色至关重要。FMT不增加早期炎症因子，提示其可用于脓毒症治疗。铁剂种类理化性质差异大，生物学效应不同，FMT独特结构赋予其免疫调节优势。

结论

研究发现FMT新型免疫调节特性：抑制MDSC扩增与功能，促进其分化，改善晚期脓毒症免疫抑制。针对MDSC的FMT治疗为脓毒症相关免疫抑制提供新治疗策略，但机制需进一步阐明。