提高阳极 TaO x 纳米管阵列的生物相容性

背景

钽 (Ta) 是一种稀有、坚硬、高度耐腐蚀且具有生物惰性的金属 [1,2,3]。钽材料的氧化，通过在其表面形成非常薄的、不可穿透的氧化膜，有助于其生物相容性。钽的高柔韧性和生物相容性使其可用于临床应用，例如牙科植入物、骨科植入物和骨重建 [4,5,6]。最近，发现钽具有比钛更好的生物相容性，例如更丰富的细胞外基质形成、优异的细胞粘附和生长以及更高的表面活细胞密度 [7,8,9]。另一方面，多项研究证明，纳米结构表面几何形状独特的物理化学性质是影响细胞行为的主要因素 [10,11,12]。理想的生物材料表面应该能够为细胞向内生长提供最佳环境。鲁克等人。证明与平坦表面相比，阳极氧化的 Ta 纳米管为增强的骨整合提供了基材 [13]。最近开发的多孔钽材料模仿骨骼的特性，允许软组织和骨骼向内生长，从而提供良好的生物固定 [14,15,16,17]。多孔钽的高稳定性和愈合潜力有助于在重建手术期间融合骨结构之间的间隙。由于与其他移植物相比，多孔钽具有多种优势，例如无供体发病率、高稳定性、优异的骨整合特性以及预防传染病传播的潜在风险，因此在生物材料领域重新引起了人们的广泛兴趣 [18,19,20 ,21]。最近的一项临床评价表明，与使用羟基磷灰石涂层钛 (Ti) 杯的患者相比，接受多孔钽髋臼杯的患者具有更高的种植体固定程度 [22,23,24,25]。

最近，我们利用电化学阳极氧化方法开发了具有不同直径的自组织 TiO2 纳米管 [26, 27]。我们发现人类成纤维细胞在超临界 CO2 (ScCO2) 处理的纳米管上比在阳极氧化的纳米管上表现出更明显的直径特异性行为 [27]。我们进一步通过电子束蒸发法制备了Ag修饰的TiO2纳米管，发现直径最小（25nm）的Ag修饰的纳米管在促进人成纤维细胞和人鼻上皮的粘附和增殖方面表现出最明显的生物活性。细胞 [26]。在这项研究中，我们制造了 TaO x 通过类似的电化学阳极氧化方法制备不同直径的纳米管。细胞行为，包括细胞粘附和增殖，响应于 TaO x 的直径 纳米管进行了研究。本研究的目的是研究自组织 TaO x 的生物相容性 电化学阳极氧化制备不同直径的纳米管阵列。

方法

准备 TaO x 纳米管

Ta 片购自 ECHO Chemical（厚度 0.127 毫米，纯度 99.7%，CAS 编号 7440-25-7）。在阳极氧化过程之前，Ta 片材在丙酮、异丙醇、乙醇和水中进行超声波清洗。所有阳极氧化实验均在 20 °C 下在含有 4.9 wt% HF 的硫酸溶液中进行，该溶液由试剂级化学品和去离子水制备。采用 Ta 为阳极、Pt 为对电极的双电极电化学电池。将电压从 10 V 调整到 40 V 以得到 TaO x 纳米管直径范围从 20 到 90 纳米。低强度紫外线照射（约 2 mW/cm ² ) 在 TaO x 上带有荧光黑灯泡 在生物相容性测试之前进行了 8 小时的纳米管样品。

材料表征

TaOx的表面形貌、内外径、壁厚和长度 通过扫描电子显微镜（SEM）表征纳米管。采用 X 射线衍射 (XRD) 和配备能量色散光谱仪 (EDS) 的透射电子显微镜 (TEM) 来检查 TaO x 的晶体结构 纳米管阵列。进行接触角测量以评估 TaO x 的表面润湿性 使用带量角器目镜的水平显微镜通过延伸法制备纳米管样品。水和培养基作为测试液体进行测量。

人类成纤维细胞培养

MRC-5 人成纤维细胞（BRCC，台湾新竹生物资源采集研究中心，BCRC No. 60023）接种于 10 厘米的组织培养板中，并用含有 10% 胎牛血清（FBS）的 Eagle 最低必需培养基（Gibco）培养)、2 mM l-谷氨酰胺、1.5 g/L 碳酸氢钠、0.1 mM 非必需氨基酸和 1.0 mM 丙酮酸钠和 5% CO2，37°C。然后将细胞接种到高压灭菌的 TaO x 置于 12 孔培养板 (Falcon) 底部以备进一步研究。

细胞粘附测定

在每个 TaO x 上接种细胞 密度为 2.5 × 10 ³ 细胞/cm ² 并在 5% CO2 中在 37°C 下孵育 3 天，然后用 PBS 冲洗两次。基板上的贴壁细胞在室温下在 4% 多聚甲醛中固定 1 小时，然后在磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中洗涤两次并在 PBS 中用 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) 透化 15 分钟4°C。用 PBS 洗涤后，通过与罗丹明鬼笔环肽 (Life Technologies) 在室温下孵育 15 分钟来标记肌动蛋白丝。然后通过与二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) (Thermo FisherScientific) 一起孵育 5 分钟对细胞核进行染色。在荧光显微镜（AX80，Olympus）下分析细胞以检查细胞粘附形态和细胞骨架排列。对于 SEM 观察，细胞在室温下用 2.5% 戊二醛溶液 (Merck) 固定 1 小时，然后在 PBS 溶液中冲洗两次，在一系列乙醇（40、50、60、70、80、90 和 100 %) 并用临界点干燥器 (CPD 030, Leica) 干燥临界点。扫描电镜观察前，样品表面镀有一层薄的铂膜。

细胞增殖分析

在每个 TO x 上接种细胞 基板密度为 1 × 10 ⁴ 细胞/cm ² 并培养 1 周。 1 周后，用 PBS 冲洗样品两次，并使用 WST-1 试剂盒（Roche，Penzberg，Germany）评估细胞增殖。将含有 10% WST-1 细胞增殖试剂的培养基添加到每个样本中，并在 5% CO2 的潮湿气氛中在 37°C 下孵育 2 小时。将每个孔的溶液转移到 96 孔板中。使用分光光度计 (Spectral Max250) 在 450 nm 处测量溶液的吸光度。

统计分析

所有实验一式三份进行，并且至少进行了三个独立的实验。数据表示为平均值 ± 标准偏差 (SD)，并使用 SPSS 12.0 软件 (SPSS Inc.) 通过方差分析 (ANOVA) 进行分析。一个 p <0.05 的值被认为具有统计学意义。

结果与讨论

图 1a-e 显示了扁平 Ta 箔和阳极氧化后的 TaO x 的 SEM 图像 平均纳米管直径分别为 20、35、65 和 90 nm 的纳米管阵列。所有阳极氧化的 TaO x 纳米管表现出明确的纳米管结构，它们的纳米管直径几乎与施加的电压成正比。在这些样品中，直径为 20 nm 的纳米管显示出相对不清晰的纳米管状表面，如图 1b 中的放大区域所示。这一观察结果可归因于阳极氧化过程中低电压操作下较弱的场强。图 2 进一步显示了所有 TaO x 的跨会话 纳米管及其相应的纳米管长度。 XRD和TEM分析用于进一步鉴定TaO x 纳米管结晶度。如图 3a 的 XRD 谱所示，仅观察到与 Ta 箔相关的峰（JCPDS Card no. 04–0788），表明阳极氧化后的 TaO x 纳米管可能是非晶相。图 3b 显示了从 90 纳米直径的 TaO x 获取的代表性 TEM 图像 纳米管从阳极氧化的样品上剥落下来，显示出明确的纳米管结构。插图中的无斑点衍射图案证实了 TaO x 纳米管是非结晶的。

SEM 图像显示 a Ta箔表面和自组织TaO x 直径为b的纳米管 20、c 35、d 65 和 e 分别为 90 纳米

显示 TaO x 横截面的 SEM 图像 直径为a的纳米管 20、b 35、c 65 和 d 分别为 90 纳米

一 阳极氧化后的 TaO x 的 XRD 谱 不同直径的纳米管和b 来自阳极氧化的 TaO x 的 TEM 图像 直径为 90 nm 的纳米管。插图还显示了相应的衍射图

之前的研究报告称，相对于疏水表面，亲水表面的细胞附着、扩散和细胞骨架组织明显更好 [28]。达斯等人。进一步表明，低接触角意味着高表面能，这也是有助于更好地细胞附着的关键因素 [29]。因此，了解 TaO x 的影响至关重要 纳米管形貌对表面润湿性的影响。如图 4 所示，所有阳极氧化的 TaO x 纳米管是高度亲水的，因为它们的接触角远小于 90°。此外，发现它们的接触角随着纳米管直径减小到 35nm 单调减小，然后随着直径减小到 20nm 反向增大。我们还发现 TaO x 当使用水或培养基作为测试液体时，纳米管样品显示出类似的趋势。我们试图根据文泽尔定律解释观察到的润湿性行为，该定律描述了亲水材料的小接触角 [30]。在 Wenzel 的模型中，亲水性材料表面粗糙度的增加会导致接触角变小，水会填充液滴下方的凹槽。在这里，我们使用粗糙度因子，即每单位投影面积的纳米管的物理表面积，来评估 TaO x 的几何粗糙度 纳米管样品 [31]。如图 5 所示，内径为 D , 壁厚 W , 和纳米管长度 L , 纯几何粗糙度因子 G 可以计算为 [4πL {D + W }/ {√3(D + 2 W) ² }] + 1. 该计算假设纳米管的所有表面都非常光滑。所有纳米管样品的计算粗糙度因子总结在图 5 的表格中。 除了 20 纳米直径的样品外，直径较小的纳米管具有较大的几何粗糙度，因此根据文泽尔模型被认为表现出更好的亲水性。该推论与我们的结果一致，即接触角随着纳米管直径减小到 35 nm 而减小。这也很好地解释了20nm直径的纳米管表面相对不清晰的纳米管显示出比其他纳米管更小的几何粗糙度和更差的亲水性。

一 –j 光学图像显示 a 上的水和培养基液滴 ,f Ta箔表面和直径为b的自组织TaOx纳米管 ,g 20、c ,h 35、d,i 65 和 e ,j 分别为 90 nm。接触角在图像中表示

内径为D的理想化纳米管结构示意图 , 壁厚 W , 和纳米管长度 L .本研究中所有纳米管样品的计算粗糙度系数汇总于表中

人成纤维细胞对扁平 Ta 箔和 TaO x 的反应 进一步研究了纳米管阵列。评估 TaO x 上的成纤维细胞附着 在纳米管中，细胞骨架肌动蛋白用罗丹明鬼笔环肽染色以表达红色荧光，细胞核用 DAPI 染色以表达蓝色荧光。肌动蛋白免疫染色显示扁平 Ta 箔和 TaO x 可区分的细胞-材料接触形态 不同直径的纳米管（见图 6）。众所周知，细胞必须首先粘附在材料表面，然后再扩散以进行进一步的细胞分裂。更好的细胞粘附可以通过与肌动蛋白细胞骨架偶联的整合素引起更多的细胞内信号级联激活 [32,33,34]。 FE-SEM 用于详细观察细胞粘附（见图 7）。直径为 35 nm 的成纤维细胞显示出具有拉长扁平形态的优异细胞粘附。另一方面，Ta 箔和 90 纳米直径的 TaO x 上的那些成纤维细胞 纳米管在一定程度上显示出较少的附着细胞和缺乏细胞扩散。使用 ImageJ 软件进一步估计纳米管上细胞的覆盖面积，并在这些 SEM 图像中注明。与接触角的趋势相似，发现覆盖面积随着纳米管直径减小到 35 nm 单调减小，然后随着直径减小到 20 nm 反向增加。 35 纳米直径的 TaO x 纳米管确实显示出最大的细胞覆盖区域。众所周知，当检测到合适的粘附位点时，细胞就会识别表面特征。据推测，细胞可以将它们的接触稳定在 TaO x 上 通过形成粘着斑和成熟的肌动蛋白纤维，然后募集微管蛋白微管 [35]。肌动蛋白细胞骨架与位于粘连内的整联蛋白相连。我们的研究结果表明，直径为 35 nm 的纳米管上的细胞骨架可以比扁平 Ta 箔或其他 TaO x 上的细胞骨架形成得更好 纳米管阵列。

a 上成纤维细胞附着的荧光显微镜图像 Ta箔和自组织TaO x 直径为b的纳米管 20、c 35、d 65 和 e 分别为 90 纳米。红色荧光表示细胞骨架蛋白肌动蛋白丝，蓝色荧光表示细胞核

一 –e SEM图像显示a上人成纤维细胞的细胞粘附和增殖 Ta箔表面和直径为b的自组织TaOx纳米管 20、c 35、d 65 和 e 分别为 90 nm。 ImageJ软件估计出的样本上的细胞覆盖区域如图所示

WST-1实验进一步评估了TaOx上的成纤维细胞增殖 不同直径的纳米管。图 8 显示了从 WST-1 测定结果测量的光密度的比较。我们发现，直径为 35 nm 的 TaO x 的细胞增殖最高 纳米管样品。但Ta组与TaOx无显着差异 纳米管阵列。此外，细胞增殖和表面润湿性表现出与 TaO x 几乎相似的趋势 纳米管直径。这一观察结果表明，不仅纳米管直径而且表面润湿性都强烈影响细胞粘附和随后的扩散。换句话说，与直径为 35 nm 的纳米管相比，直径为 20 nm 的纳米管可能会为成纤维细胞提供更多的焦点，但其较差的亲水性消除了一些有效的焦点接触，从而阻碍了细胞的附着。最终，直径为 35 纳米的 TaO x 纳米管显示出所有样品中最高的生物相容性。

在 Ta 箔和自组织 TaO x 上培养人成纤维细胞后测量的光密度 (QD) 不同直径的纳米管。 OD值及其标准差列于附表

结论

总之，这项工作研究了阳极氧化 TaO x 的生物相容性 具有不同纳米管直径的纳米管。所有阳极氧化 TaO x 纳米管被确定为主要是非晶相。我们讨论了表面润湿性与 TaO x 的转变 基于 Wenzel 模型的纳米管直径。体外生物相容性评价进一步表明成纤维细胞对 TaO x 表现出明显的润湿性依赖性行为 纳米管阵列。 35 纳米直径的 TaO x 纳米管阵列揭示了所有纳米管样品中最好的生物相容性。这种增强可归因于 TaO x 提供的高密度焦点 纳米管具有更高的表面亲水性。该研究表明，通过形成 TaO x 可以提高 Ta 的生物相容性 具有合适的纳米管直径和几何粗糙度的纳米管阵列。