使用一对适体通过三明治横向流动条带测定法快速检测 Rongalite

背景

Rongalite（羟甲基亚磺酸钠）是一种工业试剂，通常用于还原染色 [1] 或乳液聚合 [2] 作为还原剂。 Rongalite 也可用于水调节剂（例如，减少氯和氯胺）[3]，尽管会产生甲醛（一种已知的人类致癌物），但仍可用于商业化妆品染发剂中，甚至在药物制剂中作为抗氧化剂 [4] .在将这种化合物掺入多种农产品中后，该化合物还在中国造成了不利影响 [5]。这种开发的检测方法提供了一个可靠的现场 Rongalite 检测平台，有助于解决食品安全问题。

适体、单链寡核苷酸和寡肽由于其高特异性、易于和可重复的生产、易于修饰和较少的免疫原性反应而被认为是抗体的完美替代品 [6]。最近的研究揭示了适体作为药物靶向、生物传感和新药开发的生物探针的强大潜力[7]。电化学 [8] 和酶联适体 [9] 检测涉及几个适体，已被开发为一种有前途的 Rongalite 检测工具。然而，这些方法通常存在分析时间长和程序复杂的问题，阻碍了它们的应用[10]。

侧向流条检测（LFSA，也称为条测试）于 1956 年首次开发，作为乳胶凝集测试技术的逻辑延伸 [11]。作为一种单步法，LFSA 因其用户友好的格式、低生产成本、省时的使用以及在广泛条件下的长期稳定性而在多种分析物的现场检测方面引起了极大的关注。 12]. 尽管有这些积极的特点，基于适配体的侧流条带平台的实际应用尚未商业化，并且只有少数基于适配体的层析条带检测被报道用于检测食品样品中的菱钙石 [13] .鉴于食品安全事件频发，以及荣加石作为一种非法食品添加剂的普遍使用，有必要开发一种基于适配体的LFSA用于食品样品中该化合物的现场快速检测。

可以开发两种类型的侧流条带适体传感器，即竞争型和夹心型 [14]。当有几个适体可用于特定目标分子时，夹心型平台非常适合。在目前的工作中，特定的金纳米粒子 (AuNPs) 被用于开发横向流动夹心条状适体检测探针，该纳米材料被认为是最有前途的适配体传感器开发纳米材料（例如，物理化学特性）。同时，先前已经通过化学吸附或物理吸附在 AuNP 上证明了适配体缀合过程，这为适配体传感器提供了一个简单而灵敏的平台，后来在本研究中用作信号探针 [15]。由于使用 AuNPs 和适体的优势，开发了一种可见、快速、一步和现场侧向流动的检测方法，用于分析食品样品中的菱钙石。为了实现这种夹心型适体传感器，使用了两个适体探针 (A09/B09) 作为捕获和信号探针。高效液相色谱(HPLC)进一步证实了该生物传感器的阳性结果。

方法

材料和试剂

Rongalite由Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.提供。HAuCl4（脱水柠檬酸三钠）购自Sigma Aldrich（美国）。 NaCl、BSA、蔗糖、福尔马林、PEG20000、Tween20均来自北京百拓科技有限公司

NC膜（即pall 90、pall 170和Millipore 135）分别来自Pall Corporation和Millipore Corporation，购自捷宁生物技术公司。

食品样品，ersi（中国薄切方形年糕），面条，豆腐和葡萄糖酸-δ-内酯-豆腐，购自附近市场。

通过指数富集 (SELEX) 系统进化配体制备适体

SELEX 过程包括以下步骤（图 1）：(i) 用随机 DNA 文库孵育靶标，(ii) 分离与靶标结合的 DNA，(iii) 通过聚合酶链反应 (PCR) 扩增 DNA , (iv) 为下一轮文库制备单链 DNA，(v) 重复步骤 i-iv 5-15 个循环，包括使用非目标物质进行间隔计数器筛选以去除非特异性 ssDNA，以及 (vi)富集文库的最终克隆和测序[16]。

典型适体选择（SELEX）过程

按照前面描述的步骤筛选适体。简而言之，合成了一个由 82 聚体核苷酸组成的初始 ssDNA 适体文库，每个适体的中心是基于 40 的长随机序列（青科生物技术）。 ssDNA适体库的随机序列为5'-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3'，其中N表示A、G、C或T的随机核苷酸。

本研究使用引物1（5′-GACATATTCAGTCTGACAGC-3′）和引物2（5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3′）对文库进行扩增。

为了筛选与 rongalite 特异性结合的适体，将合成的随机 ssDNA 文库添加到具有 rongalite 的板中。接下来，通过洗涤去除未结合的 ssDNA；通过 PCR 回收和扩增结合的 ssDNA。随着选择轮数的增加，适配体的结合亲和力逐渐增加。

特异性和K 个体适体的 d 值与唐的方法相似[17]。

本工作中使用的适体序列如下：

• 初级适体A09,

  5′-生物素-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC

• 二级适体B09,

  5′-生物素-GCTAGACGATATCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

这些适体序列（A09和B09）是从青科生物技术合成并购买的。

金纳米粒子的生产

AuNPs 是通过 HAuCl4 方案的柠檬酸盐还原合成的 [18]。紫外/可见分光光度法 (Thermo Scientific™ Evolution 60S) 证实了具有足够尺寸的 AuNP 的单分散生产。合成了球形（直径约 40 nm）和深红色的 AuNP。这些未修饰的 AuNP 的尺寸是通过使用 Beer-Lambert 定律在 530 ± 2 nm 和透射电子显微镜（图 2）（JEOL Ltd. JEM-1011）估算的。

与 AuNPs 结合的二级适体 B09 通过以下报道的方案制备 [18]。简而言之，将 1 mL 制备的 AuNP 与 4 μL 二级适体 B09 溶液（100 μM）一起孵育，并将混合物在室温下储存在抽屉中至少 16 小时。随后在轻轻摇动时将一摩尔 NaCl 滴加到小瓶中，直到混合物中的最终浓度达到 0.1 M。小瓶在使用前存放在抽屉中至少 1 天。通过以 12,000g 离心去除未结合的硫醇化适体 在 4°C 下保持 20 分钟。从离心机中取出试管，得到澄清的上清液，纳米颗粒位于试管底部。在红色上清液的情况下，将混合物再离心 5 分钟。轻轻吸出上清液，最终将纳米颗粒分散在 1 mL 0.01 M PBS（磷酸盐缓冲盐水）缓冲液（pH =7.4）中，该缓冲液含有 5% BSA、5% 蔗糖、1% PEG20000 和 0.05% Tween20。

横向流条设计

LFSA 的设计如图 3 所示。简而言之，条带在背卡样品（GF-08，20 × 300 毫米）、金共轭物、硝化纤维素 (NC) 膜（Pall 90、60 × 300）上包含几个重叠的垫mm) 和吸收 (H-5076, 20 × 300 mm) 垫。重叠的长度为 2 毫米。将样品垫浸入含有 3% BSA 和 0.05% Tween20 的 0.01 M PBS 缓冲液（pH =7.4）中，随后在 37°C 下干燥 2 小时。用含有 5% BSA、5% 蔗糖、1% PEG20000 和 0.05% Tween20 的 0.01 M PBS 缓冲液（pH =7.4）处理金缀合物垫。随后用喷雾器 (XYZ3010-1429) 将功能性 AuNP 喷涂在处理过的金共轭垫上。 1 微升生物素-A09 适体 (10 μM) 与 10 μL 链霉亲和素 (1 mg/mL) 在 4°C 下孵育 1 小时。适体缀合的链霉亲和素随后在 NC 膜上衬以分配器 (XYZ3010-1429) 以形成测试线，而链霉亲和素 (1 mg/mL) 与仪器衬以形成对照线。之后，处理过的 NC 膜在 37°C 下干燥 2 小时以进行固定。最后，组装条带，将 LFSA 切成 40 毫米宽的条带，并在 37°C 下储存过夜直至使用。

AuNPs (40 nm) 的 TEM 图像

典型的侧流试纸条配置（夹心格式）

特异性测试

将 80 微升 Rongalite 溶液 (10 μg/mL) 添加到组装条带的样品垫中。对其他反靶标（包括福尔马林和去离子水）重复此步骤以进行特异性测试。去离子水用作对照。一条红线应出现在预期的划线区域。每个对照重复两次。

剂量相关测试

与特定测试类似，制备了不同浓度（0.8、1、5 和 10 μg/mL）的菱格石溶液。将 80 微升 Rongalite 溶液加入到组装条带的样品垫中。以检测线上15 min内观察到红色作为检测限的判定标准。

食品样品测试

为了评估这种新型 LFSA 的实用性和准确性，从研究所周围的市场收集了五个可能含有添加的菱格石的食品样品。用 10 mL 水提取 1 克样品。然后，将 80 μL 的每种样品提取物溶液应用于基于适配体的侧流试纸条，用于检测菱格石。这些结果得到了高效液相色谱法(HPLC)的证实。

结果与讨论

特异性和解离常数 (K d) 选定的适体

不同浓度的 A09 和 B09 适体与固定量的 Rongalite 一起温育。图 4a 中显示了绘制在 450 nm 处测得的吸光度与相应输入适体浓度的饱和曲线。 K 使用非线性回归分析 d 值计算。 K A09 的 d 值为 61.12 ± 16.36 nM，B09 的 d 值为 39.81 ± 12.73 nM。如图 4b 所示，A09/B09 与 Rongalite 的结合亲和力较高。

一 K 的测量 A09 和 B09 的 d 值。 GraphPad Prism用于对K进行非线性固化拟合分析 d 计算。 b A09/B09与菱钙石的特异性结合亲和力

特异性和敏感性

用生物素标记的适体 A09（捕获适体）与最初排列在膜上的链霉亲和素结合。这条线被选为测试线。同时，链霉亲和素在对照区对齐。

如图 5a 所示，一旦 AuNP 二级适体（作为信号探针）与 Rongalite 结合，测试区上的一级适体就会与该化合物的另一个位点结合。在阳性分析的情况下，由 AuNPs 生成的红线应出现在测试区域上。在对照实验中，对照区的链霉亲和素捕获剩余的AuNP标记的生物素修饰的B09适体，从而随时提供对照信号。

特异性 (a ) 和灵敏度 (b ) 的 LFSA 为 Rongalite。 一 将 80 μL 的 Rongalite 溶液 (10 μg/mL) 添加到组装条带的样品垫中。对其他反靶标重复此步骤，包括用于特异性测试的福尔马林。去离子水用作对照。 b 制备了不同浓度（0、0.8、1、5 和 10 μg/mL）的 Rongalite 标准溶液。将80 μL标准溶液移至样品垫上，以15 min内在检测线上观察到红色作为检测限的判定标准

如图 5b 所示，结果表明，在低至 1 μg/mL 的浓度下，肉眼很容易检测到 Rongalite。

通过本文开发的LFSA分析这些食品样品，结果如表1所示。

有趣的是，在每次 LFSA 后都没有保持控制线。高浓度的菱格石或盐离子会导致对照区出现微弱的信号。因此，重悬缓冲液的组成对条带测试的性能影响很大。根据所得结果，选择含有5% BSA、5%蔗糖、1% PEG20000和0.05% Tween20的0.01 M PBS缓冲液（pH =7.4）作为重悬缓冲液。

各种垫的组成对条带检测的性能有显着影响。在各种替代品中，NC 膜被发现是最适合核酸吸附和杂交的固体载体。 NC 已被广泛用作侧流条中的信号垫，因为它提供了足够的流速 [19]。具有各自流速的不同尺寸类型的 NC 膜适用于这些分析。在这项工作中，测试了从捷宁生物技术公司购买的三种常用的 NC 膜（即颇尔 90、颇尔 170 和 Millipore 135）。 Pall 90被选为最适合LFSA的NC膜。

已经开发了许多技术用于检测菱格石。然而，很少有人在现场检测中得到广泛应用，主要是因为相关的高成本和复杂的协议，如 GC 和 HPLC，对日常操作人员来说很麻烦。 LFSA 是一种单步方法，由于其用户友好的格式、低生产成本和便利性，已成为一个完美的平台。尽管灵敏度不如色谱条，LFSA 将成为床旁检测领域的一种很有前途的方法。

LFSA 的灵敏度仍然低于色谱条。此外，使用适体的 LFSA 技术显示出优于侧流免疫分析（LFIA，基于抗体的方法）的一些固有优势，而这与该领域的最新进展无关。虽然也可以使用抗体设计类似的检测，但适体传感器具有稳定性和低成本优势。此外，适配体由具有分子内和分子间杂交、酶促复制和易于序列确定特性的核酸组成，因此可以更灵活地开发不同的形式。凭借这些积极的特性，已经开发了许多用于多重检测的适体传感器。

此外，LFSA 可以使用不同的标签，包括最近开发的量子点 [20] 和上转换磷光体 [21]。然而，在所有报道的标签中，AuNPs 是最广泛用于 LFSA 的。 Au 标签最显着的特性在于它能够为 NC 膜着色，允许肉眼直接观察。这一特性使 LFSA 有别于目前昂贵的实验室方法，使该技术成为一种方便的分析工具。

床旁检测 (POCT) 已被提议作为降低这些检测成本的理想工具。 LFSA 生物传感器平台是最广为人知的检测方法，目前用于 POCT [22]。 LFIA 生物传感器平台主要包括夹心和竞争（或抑制）格式。一般而言，夹心形式分析是在目标分子具有至少两个表位的情况下设计的。本文开发了一种在两个不同结合位点与rongalite结合的双适体，其中包含以夹心型形式组装的捕获和信号探针。

结论

成功开发了一种简单且低成本的夹心式 LFSA，用于现场快速检测菱格石。该测定涉及一对与 AuNP 偶联的适体。在优化了一些关键参数后，开发的检测提供了高灵敏度，检测限值低至 1 μg/mL。这项技术可以很容易地用于研究食品样品的 Rongalite 污染。该测定提供了可靠的现场荣加莱特检测平台，有助于解决食品安全问题。

缩写

AuNPs：

金纳米粒子

HPLC：

高效液相色谱

LFIA：

横向流动免疫分析

LFSA：

侧流条带检测

NC 膜：

硝酸纤维素膜

POCT：

即时检测

SELEX：

指数富集配体系统进化

TEM：

透射电子显微镜