基于双适配体夹心法的食品中连二亚硫酸钠快速现场检测试纸条

摘要

本研究建立了一种快速、便捷的侧向层析试纸条（LFSA），利用两个高特异性适配体——A09和B09，经金纳米粒子（AuNPs）标记检测连二亚硫酸钠（rongalite），一种偶尔被滥用为食品添加剂的危险试剂。生物素标记的A09适配体固定在链霉亲和素包被的硝酸纤维素膜上作为捕获探针，AuNPs标记的B09适配体作为信号探针。该检测条在15分钟内肉眼即可观察到明显红色检测线，检测限低至1 µg mL⁻¹，极适合农产品和食品的现场快速筛查。

研究背景

连二亚硫酸钠（rongalite，羟甲磺酸钠）广泛用于工业染料和聚合物化学作为还原剂。然而，其意外或故意添加至食品引发严重健康隐患，包括释放甲醛及中国报告的不良反应 [5]。因此，开发可靠快速的检测方法对保障食品安全和公共健康至关重要。

适配体——单链DNA或RNA分子——较抗体具有显著优势：化学合成批次一致性高、免疫原性低、易修饰适配多种传感平台 [6]。虽有电化学和酶联适配体法检测连二亚硫酸钠 [10]，但常需复杂仪器和长时间分析。相比之下，侧向层析试纸条（LFSA）提供单步、便携、低成本的解决方案，适合即时检测（POCT）。

迄今仅有极少数适配体基层析试纸条针对连二亚硫酸钠 [13]。鉴于监管审查日益严格和非法添加剂泛滥，我们开发了夹心格式LFSA，利用双适配体特异性和AuNPs光学清晰度，实现食品基质中连二亚硫酸钠的快速现场检测。

材料与方法

试剂与材料

连二亚硫酸钠购自东京化学工业株式会社。氯金酸三水合物（HAuCl₄）和柠檬酸钠购自Sigma-Aldrich（美国）。辅助试剂（NaCl、BSA、蔗糖、PEG₂₀₀₀₀、Tween-20）购自北京百奥泰德科技有限公司。硝酸纤维素（NC）膜（Pall 90、Pall 170、Millipore 135）由Pall和Millipore公司经健宁生物供应。疑似含连二亚硫酸钠的食品样品——米糕（尔西）、面条、豆腐、葡糖酸内酯豆腐——采自当地市场。

SELEX法筛选适配体

遵循系统进化配体指数富集（SELEX）方案筛选高亲和力连二亚硫酸钠适配体。初始82-mer ssDNA文库（5′‑GACATATTCAGTCTGACAGCG‑N₄₀‑GATGGACGAATATCGTCTAGC‑3′）与连二亚硫酸钠孵育，洗去未结合序列，PCR扩增结合适配体。经12轮富集——含针对结构相关化合物的反向筛选——克隆测序获得两个高亲和力适配体：A09和B09。序列如下，由清华科技合成：

捕获适配体A09（生物素标记）：5′‑Biotin‑GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
信号适配体B09（生物素标记）：5′‑Biotin‑GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC‑HS‑3′

金纳米粒子制备

采用柠檬酸还原法合成~40 nm金纳米粒子 [18]。UV/Vis光谱（λ_max≈530 nm）和透射电镜（TEM）确认粒径单分散性（图2）。将1 mL AuNP溶液与4 µL 100 µM B09孵育，盐诱导沉淀、离心、重悬于含5% BSA、5% 蔗糖、1% PEG₂₀₀₀₀、0.05% Tween-20的PBS（pH 7.4）中，制备B09-AuNPs探针。

试纸条组装

LFSA组装（图3）包含样品垫、结合垫、NC膜（Pall 90）、吸水垫，粘贴于背衬卡。样品垫用PBS+3% BSA+0.05% Tween-20预处理，37℃干燥2 h。结合垫负载B09-AuNPs。检测线：点样1 µL生物素-A09（10 µM）混合10 µL链霉亲和素（1 mg mL⁻¹），4℃孵育1 h；质控线：仅点样链霉亲和素。干燥后切割成40 mm条带，37℃过夜储存。