用于灵敏快速检测卵巢癌细胞的柔性石墨烯生物传感器的演示

介绍

卵巢癌是第二常见的妇科癌症，在妇科癌症中死亡率最高[1, 2]。迄今为止，由于卵巢癌的非特异性症状和缺乏有效的早期筛查方法，卵巢癌患者普遍被诊断得很晚。成像结合碳水化合物抗原 CA125 可用于检测、诊断手术或化疗后的复发。 CA125 不是单一准确的卵巢癌标志物，因为它受多种因素影响，具有较高的假阳性预测值。我们用于诊断卵巢癌复发的升高的 CA125 (> 35 U/mL) 的敏感性小于 70% [3]。超声检查和放射学检查在早期发现和复发诊断方面也没有足够的敏感性和特异性。 I期和II期卵巢癌的5年生存率分别为90%和70%[4]。尽管手术治疗和辅助治疗有所进步，但晚期卵巢癌的5年生存率不足30%[4]。卵巢癌的早期发现与明显较高的5年生存率有关，复发的早期诊断也很重要。据报道，TP53 自身抗体、DNA 甲基化分析、microRNA 算法、巴氏样细胞学分析等几种新方法可提高卵巢癌早期检测的灵敏度 [5]。然而，开发对卵巢癌各分期具有更高灵敏度的新检测方法迫在眉睫但仍面临挑战。

最近研究人员发现早期肿瘤可以脱落成癌细胞进入血液并引起转移[6]。细胞通过原发肿瘤、复发或转移瘤进入外周血流，称为循环肿瘤细胞，可用作实体瘤的诊断或预后生物标志物 [7]。 CTCs在外周血中很少见，检测方法需要较高的灵敏度和特异性。近年来，免疫磁性分离、微流体分离、基于过滤器的方法和配体靶向 PCR 被报道用于检测 CTC [8,9,10,11]。迄今为止，Janssen Diagnostics 的细胞搜索系统是唯一获得美国食品和药物管理局 (FDA) 批准的 CTC 检测方法，可用于监测转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者 [12,13,14]。在卵巢癌中检测 CTC 提供了一种无创的诊断方法，并且在活检困难时具有优势。然而，CTC在卵巢癌早期的检出率仍然较低。仍然需要以更高灵敏度检测 CTC 的新方法。如果我们能够轻松地检测出卵巢癌患者的CTC，它将对肿瘤的早期发现、复发监测和治疗效果都有帮助。

石墨烯是一种二维半导体，由 Andre Geim 和 Kostia Novoselov 在 2004 年分离出来 [15]。近年来，类石墨烯二维材料已广泛应用于传感和生物传感、能量转换和存储、催化、复合材料和涂层、电子和生物医学领域[15]。石墨烯传感器由于其独特的结构和优异的电性能而成为检测癌症生物标志物的有希望的候选者，已被开发用于检测癌胚抗原、前列腺特异性抗原、碳水化合物抗原 19-9 和 15-3 [16,17,18,19 ]。与通过传统光刻、电极蒸发、剥离和传感器封装工艺在刚性 SiO2/Si 基板上使用宝贵的设备制造的传统石墨烯基生物传感器相比，开发一种低成本且简便的方法来制造柔性石墨烯基生物传感器具有重要意义。灵敏度高、检测速度快的生物传感器。

为了解决这些问题，在此，我们开发了一种新颖且简便的方法来在 PET 基板上制造基于石墨烯的柔性生物传感器。用银浆直接在石墨烯/PET上制作两个电极，用硅胶直接构建细胞池；这种灵活的生物传感器可以在任何实验室中手工制作，无需光刻工艺和宝贵的设施。令人惊讶的是，我们基于石墨烯的柔性生物传感器表现出高度敏感，可以快速检测卵巢癌细胞。据我们所知，目前还没有关于基于柔性石墨烯的生物传感器用于检测卵巢癌细胞的报道。

材料和方法

石墨烯薄膜的生长和转移

在这项工作中，石墨烯薄膜是通过化学气相沉积 (CVD) 在铜箔 (Alfa Aesar, No. 13382) 表面上生长的 [20]。首先用20%盐酸溶液5分钟去除铜箔表面氧化层；然后，将铜箔用去离子水清洗数次，然后用氮气流干燥。将清洗干净的铜箔放在石英舟上，放入CVD炉的石英管中。将炉膛抽真空至 1 × 10 ^–2 Pa. 将炉温升至 1000°C，保持 20 分钟，加入 50 sccm 99.999% 的 H2，然后将 50 sccm 的 99.999% 甲烷引入管中，用于生长大面积石墨烯薄膜 20 分钟。最后，用 CH4/H2 气流将 CVD 炉冷却至室温。

大面积的石墨烯/铜箔被切成许多所需的碎片。然后，将 PMMA 旋涂在石墨烯/Cu 箔的表面，形成 PMMA/石墨烯/Cu 夹层状结构。随后，下面的铜箔用 1 M FeCl3 溶液蚀刻。 PMMA/石墨烯在去离子水中清洗 30 分钟，然后转移到 PET 基材上。最后用丙酮去除PMMA，得到石墨烯/PET样品。

基于石墨烯的生物传感器的制造

基于石墨烯的生物传感器的制造过程描述如下。首先，通过 PMMA 辅助湿转移法将铜箔上约 1 cm × 2 cm 的石墨烯薄膜转移到 1 cm × 2 cm PET 基板上。然后，使用银浆在石墨烯/PET 薄膜中心附近制造两个电极。最后，为了测试癌细胞溶液的电响应，在电极的边缘用硅胶构建了一个长宽几毫米、高约1毫米的细胞池。待细胞池硅胶完全凝固后，即可使用Agilent 4155B半导体分析仪检测石墨烯生物传感器是否能正常工作。

SKOV3 卵巢癌细胞培养

SKOV3卵巢癌细胞系列（华西第二附属医院公共实验室提供）在含10%小牛血清（MRC，美国）的RPMI-1640（Transgene，法国）完全培养基中，5% CO2条件下培养和 37°C。

电池溶液的制备和电测

癌细胞用细胞培养基稀释到特定浓度。用移液管吸取 50μL 细胞溶液到凹槽中进行测量。电信号由Agilent 4155B半导体分析仪记录。

结果与讨论

10 × 10 cm ² 的照片 在铜箔上大面积 CVD 生长的石墨烯薄膜如图 1a 所示。从图 1a 中可以观察到，与具有明亮金属色的裸铜箔相比，石墨烯/铜的颜色要暗一些。石墨烯/铜的相应拉曼光谱如图 1b 所示。如图 1b 所示，拉曼峰值在 1580 cm ^-1 和 2680 厘米 ⁻¹ 对应于石墨烯薄膜的 G 和 2D 峰。为了进一步检查石墨烯薄膜的质量，我们测量了转移到 SiO2/Si 衬底上的单层石墨烯薄膜的拉曼光谱，如图 1c 所示。可以观察到 I 之间的比率 G 和 I 2D小于0.5，证实石墨烯的厚度为单层；还可以观察到D峰很低，几乎看不到，说明石墨烯薄膜的质量很高，缺陷也很少。

一 裸铜箔（左图）和在铜箔上生长的石墨烯（右图）的照片，b 石墨烯/铜的拉曼光谱和c 石墨烯/SiO2/Si的拉曼光谱

PET基板上柔性石墨烯生物传感器的照片如图2所示。癌细胞溶液可以加入细胞池中，石墨烯生物传感器的电信号可以从两个银糊电极获得。测量细胞培养基和CTC溶液的电响应。

石墨烯/PET生物传感器照片

在将这些液体放入细胞池之前和之后，在 0.01 V 的固定电压下记录这些液体的电流响应的时间依赖性。如图3所示，可以观察到在浸入这种液体之前，电流保持恒定；当这些液体被放入细胞池时，电流迅速下降，然后慢慢保持新的平衡。响应定义为 η =(我 0 - I )/我 0*100%，其中 I 0 是刚浸入液体之前的电流，I 是浸入液体一段时间后的最大值（或最小值）。可以看到，放入这种液体后，石墨烯的电阻增加。在浸渍溶液 200 s 前后，裸细胞培养基和 CTC 溶液的电响应分别为 2.96% 和 37.04%。显然，与裸细胞培养基相比，CTC 溶液即使在 30 个细胞/ml 时的电响应也非常显着，这表明基于柔性石墨烯的生物传感器对癌细胞检测非常敏感。

一 裸细胞培养基的电响应，以及 b 30个细胞的癌细胞溶液

从图 3 进一步分析了裸细胞培养基和 30 个癌细胞/毫升的 CTC 溶液的电信号的时间依赖性。如图 4 所示，可以观察到与裸细胞培养基相比，电信号的时间依赖性CTC 溶液（即使是 30 个细胞/毫升）的反应非常灵敏和快速。浸泡细胞溶液后，只需2.1、2.0、4.5、7.5、10.5、28.5秒即可达到5%、10%、15%、20%、25%、30%的响应，而相应的细胞培养响应中仅从 0.15% 增加到 1.3%。这意味着，柔性石墨烯生物传感器非常适合在 5 秒内进行快速灵敏的检测。

细胞培养基和CTC溶液电响应的时间依赖性

我们进一步研究了相同浓度 10,000 (10 K)/ml 的两种 CTC 癌细胞（SUDHL8 细胞和 OCILYS 细胞）的电响应。如图 5 所示，两种不同的癌细胞的电流时间依赖性具有略微不同的趋势和较大的电响应差异。这意味着，石墨烯生物传感器有望用于识别不同的癌细胞。

不同癌细胞电反应的时间依赖性：a SUDHL8 和 b 欧西丽斯

还研究了具有 10,000 (10 K)/ml 和 100 K/ml 的各种细胞浓度的 SUDHL 8 癌细胞溶液的电流和响应的时间依赖性。如图 6 所示，可以观察到癌细胞浓度较低的溶液显示出较高的电流，这表明癌细胞往往是绝缘的，并且更多的细胞不利于导电。两种浓度溶液的响应时间依赖性显示出相似的变化趋势，低浓度溶液的响应略高于高浓度溶液。这些结果表明生物传感器可用于识别不同浓度的癌症溶液。

电流的时间依赖性 (a ) 和响应 (b ) 对于具有不同浓度 10 K 和 100 K 细胞/ml 的 SUDHL8 癌细胞

如上所述，结果表明廉价且灵活的石墨烯基生物传感器对细胞培养基和癌症溶液、不同的癌细胞和不同浓度的癌细胞溶液表现出不同的响应，这表明这种灵活的石墨烯基生物传感器有望成为用于检测和鉴定CTC卵巢癌细胞。

结论

为了开发一种有效的早期检测方法，特别是针对卵巢癌，我们在 PET 基底上开发了一种非常简单的基于石墨烯的柔性生物传感器。这种灵活的生物传感器由一个细胞池和两个电极组成，并比较加入细胞溶液前后的电信号，显示出高灵敏度和快速检测速度。对细胞培养基和癌液、不同的癌细胞和不同浓度的癌细胞液表现出明显不同的反应。我们的工作表明，基于石墨烯的柔性生物传感器有望用于灵敏、快速地检测/识别 CTC 卵巢癌细胞。

数据和材料的可用性

作者可以确认所有相关数据都包含在文章及其补充信息文件中。

缩写

CA：

碳水化合物抗原

CTC：

循环肿瘤细胞

PET：

聚对苯二甲酸乙二醇酯

FDA：

食品药品监督管理局

CVD：

化学气相沉积