氧化和纳米分散天然蚕丝纤维

介绍

具有层次结构的材料在自然生物系统中无处不在 [1, 2]。由于聚合物的主要特性和每个层次结构的功能适应性，它们提供了多种功能 [3,4,5]。为了设计具有增强功能的人造材料来重现这种特殊性质，需要保留聚合物原始纳米结构的提取过程 [6,7,8,9,10]。许多研究致力于使用化学、物理和生物方法从纤维复合结构中分离多糖纳米纤维（例如，纤维素和几丁质）[11,12,13]。特别是，通过使用 2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基 (TEMPO) 介导的天然纤维素/几丁质氧化，然后进行温和的机械处理，已经获得了完全个性化和高度结晶的纳米纤维 [14, 15 ]。然而，经济和环境问题仍然存在；这些现有的纳米纤维分离技术需要昂贵和/或有毒的试剂，例如 TEMPO 和六氟异丙醇 (HFIP)。更重要的是，所得纳米纤维分散体的低浓度限制了它们的储存、运输和应用。

由各种昆虫和蜘蛛纺成的动物丝也具有分级纤维结构 [16, 17]。这些蛋白质分子以从纳米尺度到宏观尺度的组装原纤维的形式存在，从而使丝绸材料具有出色的机械和生化特性 [18,19,20,21]。然而，为了获得丝纳米结构，由于 (i) 复杂的分级结构、(ii) 高结晶度和 (iii) 丝纤维的微/纳米原纤维之间的附着力，提取过程仍然存在挑战。超声波处理已应用于分裂丝纤维 [22]；然而，所得纳米纤维相互缠绕，缺乏加工性。使用盐-甲酸系统部分溶解丝纤维呈现不稳定的树状纳米纤维束[23]。使用部分溶解和超声处理的综合方法导致丝纤维被缩小到单个纳米纤维的直径[24]，而这种纳米纤维的纵横比和产量还有待提高。

为了解决这些问题，我们制定了一种简单且可扩展的策略来提取全​​尺寸的 mesosilks [25]。类似于多糖的分离[26]，羧基被引入到家蚕 蚕丝 (BS) 和 柞蚕 用于通过静电排斥分散纳米纤维的丝 (AS) 纤维；然而，多余的化学物质，如 TEMPO 和溴化钠 (NaBr)，被排除在外，因为选择性氧化是不必要的。在此，我们公开了该方法在产生具有高纵横比的单个纳米纤维方面的有效性。在所得丝纳米纤维 (SN) 膜中获得了光学透明、机械坚固和增强的润湿性能。与那些基于多糖的纳米纤维（即纤维素和几丁质纳米纤维）相比，SNs 有趣的聚集-再分散特性受 pH 值调节。

材料和方法

分解丝纤维的氧化

分解后的蚕丝纤维是由家蚕原料制备的 （或柞蚕 ) 蚕纤维（中国协和丝绸有限公司）。简而言之，将5 g丝纤维在重量比为1:400的0.02 M碳酸钠水溶液中煮沸30 分钟，然后在蒸馏水中彻底洗涤，然后风干。然后，将脱胶的丝纤维浸入重量比为1:20的甲酸（88 wt%）溶液中。将混合物在室温下孵育至少 1 h，然后以 10,000 r/min 匀浆 3 min 以获得悬浮液。悬浮液以8000 r/min离心后得到固态解体丝纤维。

为了氧化，将分解的丝纤维洗涤至pH 7并切成几厘米长的短片，将所需量的次氯酸钠（NaClO）溶液与1 g分解的丝纤维一起加入100 ml水中。向混合物中连续加入氢氧化钠 (NaOH) 以保持 pH 值在 10。当不再观察到 NaOH 消耗时，通过滴加 0.5 M 盐酸 (HCl) 将 pH 值调节至 7 来淬灭反应。然后，将水不溶性部分以10000 r/min离心并洗涤数次。最后，用超声波均质器在 19.5 kHz 和 300 W 的输出功率下处理水不溶性部分 20 分钟后，得到丝纳米纤维。采用冰水浴，避免长时间超声处理过热。

氧化蚕丝纤维的X射线衍射分析

X 射线衍射 (XRD) 实验使用 Ultima IV 多用途 X 射线衍射系统（Ultima IV，Rigaku，日本）和 Cu-Kα 源（λ =0.1542 nm)。 X射线源的电压和电流分别为40 kV和30 mA。使用 PeakFit 软件 (4.0) 分析氧化丝纤维的解卷积结果。峰的数量和位置是根据光谱的二阶导数的结果定义的，并在解卷积过程中固定。带宽由软件自动调整。

纳米纤维的形态观察

为了观察各种纳米纤维的形成，将分散体稀释到 0.01 wt%。对于扫描电子显微镜，将 10 μL 稀释分散体的等分试样置于硅片上，然后风干。样品涂有金和钯，并使用 JEOL-JSM 7600F (JEOL, Japan) SEM 在 5 kV 电压下成像。对于透射电子显微镜 (TEM)，将 10 μL 稀释分散体的等分试样放置在碳涂层 Cu 电子显微镜网格上。多余的液体被滤纸吸收，然后风干。使用 Titan 80-300 (FEI, U.S.) 透射电子显微镜在 80 kV 下观察样品网格。使用美国国立卫生研究院开发的ImageJ软件（1.48）分析纳米纤维的尺寸。

机械测试

BS、AS、CN（纤维素纳米纤维）和ChN（几丁质纳米纤维）膜的厚度约为50 μm，采用溶剂蒸发法浇铸而成。每个纳米纤维膜被剪裁成长度为 60-80 mm 和直径为 5 mm 的几条带，并通过电子万能试验机（AG-Xplus，SHIMADZU，Japan）拉伸它们以确定其机械性能。本次试验中，夹具初始间距为20 mm，拉伸速度为1 mm/min。

光学和润湿特性

使用 Amersham Biosciences 的 Ultrospec 2100 pro 光谱仪测定了厚度为 25 μm 的各种膜在 350 到 800 nm 范围内的透光率。

使用液滴计（Kyowa Interface Science Co., Ltd.）进行接触角测量。在~ 0.5 s内滴到膜上的4 μL蒸馏水滴的形状自动进行图像分析。

结果与讨论

丝绸纳米纤维的氧化与分离

图 1a 展示了从丝纤维材料中分离纳米纤维的策略。我们首先采用预处理工艺通过用甲酸处理来分解这些丝纤维（氨基酸或羟基与甲酸之间没有发生化学反应，如附加文件 1 中的拉曼光谱所示：图 S1 和附加文件的相关讨论文件）。这种预处理将丝纤维分解成宽度为 5-20 μm 的微纤维结构（图 1a）。然后，次氯酸钠 (NaClO) 被用来氧化/部分溶解（降解）分解的丝纤维。根据 TEMPO（2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧自由基）介导的多糖氧化条件，使用 TEMPO 将氢氧化钠 (NaOH) 连续加入混合物中以将 pH 值保持在 10 /NaClO/NaBr 系统，而在这种情况下，由于丝素蛋白序列中的活性氨基酸有限，因此不再需要 TEMPO 和 NaBr 来氧化丝纤维。初始丝纤维的羧基浓度为~ 0.3 mM/g 蛋白质，这归因于分子序列中的天冬氨酸和谷氨酸[27]。此后，由于丝氨酸残基上的羟甲基氧化，氧化丝的羧基含量在添加 NaClO 后近似线性增加。当 NaClO 添加量达到 20 mM/g 蛋白质时，BS 和 AS 的氧化丝的最终羧基浓度分别为 0.889 和 1.013 mM/g 蛋白质（图 1b、c）。然而，过量的 NaClO 可能会降解丝纤维 [28]。例如，当 NaClO 添加量为 20 mM/g 蛋白质时，BS 和 AS 的水不溶性部分分别为 58.52 和 69.30 wt%。氧化后水不溶性部分的重量损失表明 NaClO 添加 ≤ 10 mM/g 蛋白质是可以接受的（超过 75% 的蛋白质仍然存在），因为在氧化过程中降解有限。因此，我们使用10 mM NaClO/g蛋白质氧化BS和AS纤维，其中BS和AS的羧酸盐含量分别为0.724和0.837 mg/g蛋白质。

BS和AS的SN和羧基含量的工艺图。 一 丝纤维氧化和分散成丝纳米纤维 (SNs) 的示意图。 b 家蚕氧化后不溶于水的部分羧基含量和残留重量 (BS) 对应于添加次氯酸钠 (NaClO)。羧基含量从 0.293 增加到 0.889 mM/g BS（NaClO 添加量为 20 mM/g 蛋白质），剩下 58.52 wt% 的蛋白质。 c 对于柞蚕 丝绸（AS）。羧基含量从0.347增加到1.013 mM/g AS（NaClO添加量为20 mM/g蛋白质），剩余蛋白质69.30 wt%

最后，在用超声波均质器处理水不溶性部分后获得纳米纤维（图 2）。扫描电子显微镜观察表明，氧化在微观水平上使丝绸松散，形成直径为几微米的纤维，超声处理进一步将它们分散成直径为 105 ± 27 nm 的纳米纤维（图 2c）。与其他主要剥离丝纤维表面层的过程 [24] 相比，由于氧化丝中的静电排斥力，纳米纤维的最终产率为基于氧化丝的~ 50%。类似的策略也适用于 AS 纤维。所得AS纳米纤维的直径为112 ± 33 nm，轮廓长度超过1 μm（图2f）。

在每个过程中对所得丝纤维的代表性 SEM 观察。 一 甲酸预处理后分解的BS纤维，b 氧化 BS 纤维和 c BS 纳米纤维的直径为 105 ± 27 nm。 d 甲酸预处理后分解的AS纤维，e 氧化 AS 纤维和 f 直径为112 ± 33 nm的AS纳米纤维。 BS和AS纳米纤维的轮廓长度大于1 μm

丝绸纤维的结晶度

丝蛋白分子充当亲水-疏水-亲水聚合物，在形成从疏水核（结晶区域）伸出的亲水珠（无定形区域）期间折叠成不规则大小的胶束[17]。由于胶束之间的外部区域的粘附，SNs 被组装。然而，有人认为丝纤维的 NaClO 氧化表明它们的纳米结构之间存在弱粘附 [25]。如图 3a 和 b 所示，氧化后，氧化 BS 纤维的 X 射线衍射 (XRD) 图案与其原始图案相似，氧化后的 AS 纤维的 XRD 图案也相似。因此，氧化后的丝纤维仍然是其天然的纳米结构单元，即丝纤维中的 β-折叠结构。另一方面，这些 XRD 图案的去卷积（图 3c、d）表明氧化后 BS 和 AS 纤维的结晶度发生了显着变化，详情见表 1。虽然氧化主要发生在丝氨酸残基上在蚕丝蛋白中，无定形区域中有几个氨基可以被 NaClO 攻击 [29]。因此，可以理解的是，表 1 中氧化 BS 纤维的结晶度从 24.8%（分解的 BS）增加到 41.3%（添加 10 mM/g 蛋白质 NaClO），随后羧基含量增加。在氧化 AS 纤维的情况下也出现了类似的趋势，这些 AS 纤维的结晶度从 22.9% 增加到 39.2%。结果表明，除了静电排斥力外，蚕丝蛋白中无定形区域的破坏也是分散SNs的重要因素。当 NaClO 添加 <10 mM/g 蛋白质时，氧化丝纤维（BS 和 AS）的结晶度随着羧基含量的增加而增加。无定形区域的降解先于丝蛋白的结晶核心。然而，过量的 NaClO（20 mM/g 蛋白质）可能会降解蚕丝。这种现象与我们在图 1b 和 c 中揭示的结果非常吻合。

氧化蚕丝纤维的XRD分析。 a 的 X 射线衍射 (XRD) 图 BS 和 b 加入各种 NaClO 氧化的 AS。 c 的代表性反卷积和结果 BS 和 d AS材料

丝绸纳米纤维的性能

通过超声处理 10 mM NaClO 氧化丝纤维获得的氧化 BS 和 AS 纳米纤维的形态如图 4a 和 b 所示。 BS 和 AS 纳米纤维具有相似的纵横比（由 ImageJ 软件计算），其中 BS 纳米纤维的平均纵横比为 16.92，AS 纳米纤维分别为 19.12。相比之下，使用 TEMPO 介导的氧化制备的纤维素纳米纤维（CNs）和几丁质纳米纤维（ChNs）如图 1 和图 2 所示。 4c 和 d。为了进一步表征这些 SN，使用溶剂蒸发法浇铸了大约 50 微米厚的膜。使用 UV-Vis（从 350 到 800 nm）分光光度计评估光学透明（透射率超过 75%）丝膜（图 4e）。

SNs、CNs 和 ChNs 的形态和特性测试。所得a的透射电子显微镜（TEM）观察 BS 和 b AS纳米纤维被10 mM/g蛋白质NaClO添加氧化，c 纤维素纳米纤维 (CN) 和 d 通过 TEMPO 介导的氧化实现的几丁质纳米纤维 (ChNs)。比例尺是 500 nm。 e 由 BS、AS、纤维素 (CN) 和几丁质 (ChN) 纳米纤维浇铸的约 50 μm 厚膜的 UV-Vis 透射率。 f 由 BS、AS、CN 和 ChN 纳米纤维浇铸的约 50 μm 厚膜的代表性应力-应变曲线。 g 由 BS、AS、CN 和 ChN 纳米纤维浇铸而成的膜的杨氏模量。数据代表平均 SD (n =5)。 h –k f浇铸膜的水接触角 BS 纳米纤维为 58.8 ± 1.5°，明显低于再生 BS 膜（71.0 ± 0.3°，插图）。 AS、CN和ChN膜的水接触角分别为55.7 ± 0.5、40.3 ± 1.1和52.5 ± 0.6°

通过这种缩小尺寸的方法获得的纳米纤维保留了高度结晶的结构和高纵横比。因此，这些膜表现出稳健的机械性能（图 4g），BS 和 AS 的杨氏模量分别为 4.51 ± 0.71 和 4.43 ± 0.23 GPa，与 CN 和 ChN 膜（代表性应变和应力曲线在图 4f 中给出）。此外，由于引入了羧基，BS 膜的润湿性能在再生膜中得到了显着改善。如图 4h 所示，BS 纳米纤维流延膜的水接触角为 58.8 ± 1.5°，而再生 BS 膜（图 4h 中的插图）为 71.0 ± 0.3°。此外，AS（图 4i）、CN（图 4j）和 ChN（图 4k）膜中的水接触角分别为 55.7 ± 0.5、40.3 ± 1.1 和 52.5 ± 0.6°。

CN 和 ChN 以及丝器件由于它们相似的机械强度、加工可塑性和生化特性等，已在材料科学中广泛应用了几十年 [13, 30, 31]。当然，这些多糖和基于蛋白质的材料。因此，我们想知道它们的差异如何调节纳米纤维的形成。在中性条件下，适当分散的BS和AS分散体的zeta电位分别为- 39.5 ± 0.66和- 37.4 ± 2.4 mV。羧基之间的静电斥力不利于蚕丝微/纳米原纤维界面之间的粘附；因此，这些纳米纤维均匀地分散在水相中。有趣的是，当 pH 值降低时，H ⁺ 屏蔽带负电荷的表面，导致纳米纤维聚集，如图 5a 和 b 所示。 SNs的聚集体可以通过调节pH> 7重新分散在水中，或者在离心后很容易收集，然后在轻微搅拌下重新分散。图 5 的底部图表显示了在不同 pH 条件下收集的 SN 聚集体的剩余重量。对于 BS，80.1 ± 1.7 和 90.9 ± 2.2 wt%（对于 AS 为 85.7 ± 2.2 和 93.6 ± 1.5 wt%）在 pH 5 和 3 下分别回收。同时，与初始分散体相比，该过程将 SNs 浓缩了大约 100 倍（~ 20 wt%），浓度为~ 0.2 wt%。 SNs 的这种迷人特性归因于（i）基于蛋白质的材料的内在 pH 响应和（ii）软物质 SNs 在聚集和再分散过程中的灵活性。聚集-再分散现象表明这些 SNs 作为载药和释放载体的应用前景广阔。此外，所得到的SN非常适合储存和运输也没有争议。

SNs的再分散过程。 a 的 pH 响应现象的摄影 BS 和 b AS纳米纤维。离心后残留超过80 wt%的蛋白质（BS和AS），蛋白质含量为~ 20 wt%

结论

总之，在 NaClO 氧化后获得了单独分散的 BS 和 AS 纳米纤维。该方法类似于 TEMPO 介导的多糖氧化制备纳米纤维；然而，不需要 TEMPO/NaBr 催化剂。所制备的 SN 的直径为 ~ 110 nm，长数微米，表面带负电。在 SN 膜中获得了光学透明、机械坚固和增强的润湿性能。特别是，通过降低 pH 值，SNs 可以浓缩到~ 20 wt%，并且这些纸浆状 SNs 可以重新分散在中性水溶液中。基于这些结果，SNs是材料科学和生物医学应用的绝佳候选者。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章中。

缩写

AS：

柞蚕 丝绸

BS：

家蚕 丝绸

ChN：

甲壳素纳米纤维

CN:

纤维素纳米纤维

SEM：

扫描电镜

SN：

蚕丝纳米纤维

TEM：

透射电子显微镜

XRD：

X射线衍射