金纳米颗粒比色传感器检测糖基化血红蛋白 A0 中低分子量 AGEs

摘要

糖尿病患者血浆中蛋白质糖基化产生晚期糖基化终产物（AGEs）驱动疾病进展。我们用果糖体外糖基化血红蛋白 A0（HbA0），再用所得糖基化蛋白作为模板合成金纳米颗粒（GNPs）。GNPs 的表面等离子体共振（SPR）与糖基化程度强相关。凝胶过滤分馏揭示两类产物：高分子量蛋白交联片段和低分子量非蛋白质 AGEs。仅后者诱导 GNP 形成，验证了该检测方案。因 AGEs 是糖尿病及其并发症的可靠生物标志物，该基于 GNP 的比色传感器提供快速、廉价的诊断工具，具潜在临床影响。

背景

II 型糖尿病（T2DM）以慢性高血糖为特征，触发美拉德反应——蛋白质与糖的非酶糖基化。初始席夫碱迅速转化为阿马多利产物，进一步转化形成 AGEs。AGEs 交联蛋白、激活 RAGE 受体、诱导氧化应激和炎症，导致心血管疾病、肾病、视网膜病变和神经退行性变。其他途径如葡萄糖氧化、脂质过氧化、多元醇途径也产生 AGEs，膳食摄入也增加全身水平。尽管 AGEs 具有异质性，但共享共价交联和褐变效应，使其成为糖尿病、衰老及相关疾病的有吸引力生物标志物。

当前 AGE 检测依赖昂贵的色谱-质谱或 ELISA，限制即时检测应用。简单、快速、成本效益高的比色传感器极具需求。金纳米颗粒（GNPs）具有可调 SPR，已成功用作糖、蛋白、蛋白聚集体的比色报告分子。我们先前证实糖基化蛋白可诱导 GNP 合成，糖基化程度反映在光学响应中。基于此，我们研究低分子量 AGEs 是否能驱动 GNP 形成，从而作为定性传感器基础。

方法

材料

血红蛋白 A0 和 Sephadex G25（Sigma Aldrich）开瓶即用。氯金酸三水合物（HAuCl₄·3H₂O, Loba Chemie）为 Au³⁺ 来源。果糖、磷酸盐缓冲液、分析纯试剂按常规采购。全程用 MilliQ 水（>18 MΩ）。

方法

HbA0 糖基化

HbA0（1 mg mL⁻¹）与果糖（0.1 M）在 0.1 M 磷酸缓冲液 pH 7.4、37 °C 下孵育 1-10 天。第 0 天（对照）和第 10 天（完全糖基化）取样，无菌保存。

还原性测定

用高铁氰化钾还原测定还原活性。孵育后酸化反应混合物，测 700 nm 吸光度；吸光度越高还原性越强。

凝胶过滤色谱

第 0 天和第 10 天 Fruc-Hb 样品在 Sephadex G25 柱（15 cm × 1 cm，7.5 mL h⁻¹）分馏。收集 30 组分，用 UV 吸收（280 nm）和 Bradford 蛋白测定分析。

金纳米颗粒合成

金盐（1% w/v HAuCl₄）加水搅拌至淡黄。加入 Fruc-Hb（12.5 ng μL⁻¹）或单个组分（1 ng μL⁻¹），静置待 GNP 生长。终末颜色从粉红至紫红，指示纳米颗粒成功形成。

Bradford 测定

各组分蛋白含量测 595 nm 和 450 nm 吸光度，比值（OD₅₉₅/OD₄₅₀）反映蛋白富集度。

光谱学

UV-Vis 光谱

Perkin Elmer Lambda 25 记录 200-800 nm 光谱，光程 1 cm。

荧光光谱

Agilent Cary Eclipse 测蛋白内在荧光（激发 280 nm）和 AGE 荧光（激发 350 nm）。

圆二色光谱

远紫外 CD（190-260 nm）用 Chirascan 光谱仪评估二级结构变化。

透射电镜

GNPs 离心干燥于碳膜网格后经 JEOL 2100F TEM 成像。

GNP 颜色强度分析

从数字图像计算 (R-B)/G 量化颜色。

SDS-PAGE

糖基化和对照 HbA0 样品在 12% 分离胶电泳，白光下显像。

结果

果糖、HbA0 和糖基化 HbA0 合成 GNP

激发 350 nm 时 450 nm 荧光经 10 天果糖孵育后增 >10 倍，确认 AGEs 形成（图 1）。还原性测定显示第 10 天 Fruc-Hb > 第 0 天 Fruc-Hb > 果糖 > HbA0（图 2a）。仅第 10 天 Fruc-Hb 在 4 天内生成稳定 GNPs（图 2b），显示 530 nm SPR 峰（图 2c）和 22±2.4 nm 球形颗粒（图 2d）。数据证实驱动 GNP 合成的是 AGEs 而非单纯蛋白变化。

Fruc-Hb 分馏分离两类糖基化产物

第 10 天 Fruc-Hb 凝胶过滤得两群体：高分子量蛋白质片段（组分 5-12、15+）和低分子量非蛋白质 AGEs（群体 II）。第 0 天 Fruc-Hb 仅产生蛋白质群体（群体 I）（图 3）。280 nm UV 吸收和 Bradford 分析确认群体 I 蛋白质性质，群体 II 有 UV 吸收但蛋白含量可忽略。

蛋白质和非蛋白质糖基化产物荧光

仅第 10 天组分显示 450 nm AGE 荧光。群体 I 组分荧光强度较高，指示蛋白结合 AGEs；群体 II 组分荧光较弱但保留 UV 吸收，确认其非蛋白质、低分子量本质（图 4）。

Fruc-Hb 组分合成 GNP 区分糖基化产物

用单个组分合成 GNP 时，仅群体 II（非蛋白质 AGEs）产生稳定有色 GNPs，群体 I 不产生（图 5）。这表明低分子量 AGEs 负责纳米颗粒形成，可作为选择性传感器。增加 Fruc-Hb 和金浓度可加速反应至 1 天，凸显即时检测适用性（图 S5）。8-40 ng μL⁻¹ Fruc-Hb 浓度下颜色强度线性关系确认定量潜力（图 6）。

讨论

本研究确立低分子量 AGEs 是驱动 GNP 合成的活性物种。分馏揭示仅非蛋白质 AGEs 触发纳米颗粒形成，为传感器提供清晰机制基础。GNPs 提供高灵敏度，可纳克级检测 AGEs，检测限 1 ng μL⁻¹。方法简单、成本效益高、兼容小样本量，理想用于快速即时检测糖尿病监测。未来工作可扩展至区分特定 AGEs 物种和检测晚期脂质过氧化终产物，进一步拓宽临床效用。

结论

我们提出一种稳健比色分析法，以纳克灵敏度检测糖基化血红蛋白中低分子量 AGEs。利用 AGEs 还原性诱导 GNP 形成，传感器区分糖基化/非糖基化样品，及蛋白结合/游离 AGEs。相比 LC-MS/MS，该分析法为监测糖尿病进展及并发症提供快速、廉价替代方案。针对 AGEs 的特异性结合简便性，使其成为临床诊断和个性化血糖管理的有前景工具。