用于 NIR-II 光热疗法的 BSA 涂层金纳米棒

介绍

金纳米粒子以其优异的生物相容性和低细胞毒性引起了生物医学研究的广泛兴趣。例如，发现具有高 X 射线衰减效率的金纳米粒子有望用于基于计算机断层扫描 (CT) 的肿瘤诊断 [1, 2]。此外，金纳米粒子表现出优异的光学特性，称为表面等离子体共振 (SPR) 效应。在表面等离子体共振光的存在下，金纳米粒子可以有效地将光子能量转化为热能，用于癌症治疗 [3, 4]。因此，已经开发了各种尺寸和形态可调的金纳米粒子用于肿瘤的光热消融，例如金纳米棒、金纳米壳和金纳米笼 [5,6,7]。特别是，具有可调节各向异性形状和尺寸的金纳米棒 (AuNR) 因其优异的光热稳定性、生物相容性和在近红外区域的强吸收而被广泛研究 [8]。众所周知，近红外光比可见光能更有效地穿透生物组织，因为光波长越长，光散射损失越低[9]。此外，已经发现棒状纳米颗粒具有显着增强的肿瘤通透性和更长的血液循环时间，从而导致更高的肿瘤积累[10, 11]。然而，将金纳米棒应用于光热疗法（PTT）的显着缺点是高功率激光照射，这会引起正常组织的高度损伤（最大允许光强度暴露）[12]。已经证明，第二个近红外窗口（NIR-II，1000-1700 nm）中的 PTT 比 NIR-I（700-1000 nm）具有更大的组织穿透深度，因为 NIR 中的光散射低得多-II [13,14,15,16,17]。因此，NIR-II中的PTT纳米平台有望实现更有效的肿瘤PTT治疗，对于更复杂的肿瘤治疗具有巨大的临床应用潜力。然而，制备具有长波长吸收和低细胞毒性的金纳米棒仍然是一个巨大的挑战。在这里，我们报告了通过无籽法合成金纳米棒，在近红外窗口（1000-1300 nm）的第二个窗口中具有吸收峰。通过用 BSA 涂层引入表面改性以降低细胞毒性。制备的金纳米棒（AuNR@BSA）的纵横比通过透射电子显微镜（TEM）和动态光散射（DLS）表征。采用乳腺癌荷瘤小鼠模型测试AuNR@BSA的光热治疗效果。我们发现低至 0.75 w/cm ² 的光强度可以很好地治疗肿瘤 .

材料和方法

材料

三水氯化金 (HAuCl4·3H2O) (99.9%)、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) (99%)、硝酸 (GR, 65–68%) 和过氧化氢溶液 (GR, 30%) 从上海收到阿拉丁生物科技有限公司 硼氢化钠 (NaBH4) (97%) 和硝酸银 (AgNO3) (99.8%) 购自上海凌峰化学试剂有限公司 盐酸 (HCl) (38%) 购自东莞东江化学试剂有限公司对苯二酚（99%）购自能源化工。牛血清白蛋白 (98%) 从 Sigma-Aldrich 获得。氢氧化钠（AR，96%）购自Greagent。

RPMI 1640 培养基和青霉素-链霉素购自 HyClone。磷酸盐缓冲溶液 (PBS) 购自康宁。胰酶购自 Coolaber。胎牛血清 (FBS) 购自 Gibco。 4T1细胞由中国科学院深圳先进技术研究院生物医学光学与分子影像研究中心提供。同人化学科技（上海）有限公司提供Cell Counting Kit-8（CCK-8）用于细胞增殖和毒性试验。实验全程使用Millipore超纯水。

AuNR@CTAB 纳米粒子的制备

金纳米棒的合成如下进行：将 0.4 mL HAuCl4(aq) (10 mM) 和 10 mL CTAB(aq) (0.1 M) 添加到 23–33 µL AgNO3(aq) (100 mM) 中。然后，在温和混合下，将 10–30 µL HCl (1.2 M) 和 525 µL 氢醌水溶液 (0.1 M) 添加到生长溶液中。生长溶液的颜色从橙色变为非常浅的黄色。搅拌 15 分钟后，将 10–40 µL 新鲜制备的冰冷 NaBH4(aq) (10 mM) 溶液注入生长溶液中。将混合物搅拌 30 秒并在室温下老化 18 小时。 AuNR@CTAB然后用PBS洗涤两次。

AuNR@BSA 的制备

首先，我们加入一定量的 CTAB，将其在 AuNR@CTAB 溶液中的浓度调整为 1 mM，然后超声将 CTAB 完全溶解。将 3 mL AuNR@CTAB 缓慢添加到 3 mL BSA 溶液 (10 mg/mL) 中，并将混合溶液超声处理 30 分钟。 9500×r 离心 40 分钟后，上清液更换为 6 mL BSA 溶液（5 mg/mL），然后用氢氧化钠（2 M）调节 pH 至 11-12，搅拌至少 18 H。之后，合成的AuNR@BSA在9500×r离心40分钟，然后用PBS洗涤两次，溶解在PBS中备用。

AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 纳米颗粒的表征

金纳米棒的形貌分析由北京中科百策有限公司通过Talos F200X电子显微镜获得TEM图像。 Zetasizer Nano ZS（英国马尔文）用于通过 DLS 研究各种纳米颗粒的尺寸分布和 zeta 电位。 UV-Vis吸收光谱由UV-2700紫外-可见分光光度计（日本岛津制作所）测定。

为了对肿瘤内的 AuNR@BSA 进行形态表征，将 100 µL AuNR@BSA（OD =25，1064 nm）注射到肿瘤部位，照射约 10 分钟，然后收集处理过的肿瘤。收集未处理的肿瘤作为对照。将收集的肿瘤在 2.5% 戊二醛溶液（Coolaber.co., Beijing, China）中孵育，用于透射电子显微镜（北京中科百策有限公司）。 AuNR样品的傅里叶变换红外光谱(FT-IR)图和X射线衍射(XRD)图由北京中科百色有限公司获得

AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 光热性能的测量

将金纳米棒溶液在 1064 nm (0.5、1、1.5 和 2) 处稀释到不同的 OD，并使用 PBS 作为空白对照。用 1064 nm 激光（Haoliangtech，上海，中国）以 0.35–1 W/cm ² 的功率强度照射金纳米棒（500 µL） 30 分钟。温度用红外热像仪（FLUKE TI25）记录。

AuNR@BSA 的光稳定性

为了测试光稳定性，测量了 AuNR@BSA 的吸收光谱作为照射时间的函数。 AuNR@BSA (OD =1) 在 NIR 激光 (1064 nm, 0.5 w/cm ² ）。从 0 到 10 分钟，每分钟记录一次光谱。还进行了光热循环测试，因为 AuNR@BSA 溶液 (0.5 mL) 每 10 分钟开启和关闭激光照射（1064 nm，0.5 W/cm ² )，并记录温度变化。

细胞培养

鼠乳腺癌细胞系（4T1 细胞）在含有 10% FBS 和 100 U/mL 青霉素或 100 μg/mL 链霉素的 RPMI 1640 中培养。培养环境为37°C，加湿条件为5% CO2。

体外金纳米粒子的细胞毒性评估

CCK-8 法用于鉴定金纳米棒的细胞毒性。 4T1细胞预先接种到96孔板中（5 × 10 ³ 每孔）并孵育 24 小时。随后，加入 10 μL 不同浓度的 AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA，再孵育 24 小时。 PBS 洗涤两次后，每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，孵育 40 分钟，然后用酶标仪测量 450 nm 处的吸光度。

对于光毒性，将 4T1 细胞预接种到 96 孔板中（5 × 10 ³ 每孔）并孵育 24 小时，然后用 NIR 激光（1064 nm，0.75 W/cm ² , 10 分钟）并进一步孵育 24 小时。之后，将 10 μL CCK-8 溶液加入每个孔中，并在 37°C 下再孵育 40 分钟。然后用酶标仪检测各孔在450 nm处的吸光度。

荷瘤小鼠模型

所有BALB/c小鼠均购自北京维塔尔河实验动物技术有限公司。所有动物实验程序均按照中国科学院深圳先进技术委员会批准的标准程序进行。皮下注射4T1细胞(2 × 10 ⁶ ) 进入老鼠的背部。当肿瘤体积达到约 100 mm ³ 时进行动物研究 .

体内血液循环和生物分布

对于循环时间测量，首先将 200 μL AuNR@BSA 静脉注射到 BALB/c 小鼠的尾静脉，然后在 0.25、2、4、6、8、12、36 和48 小时，并用 30 微升 PBS 稀释以获得 50 微升血样。加入约 400 μL 浓 HNO3（色谱级），拧紧盖子并在 90°C 下消解 2 小时。冷却至室温后，缓慢滴入 150 μL H2O2（色谱级），然后无盖加热至 90°C 1 小时。最后，用超纯水将溶液稀释至 5 mL。 Au离子通过0.44 mm尼龙注射器过滤器后，采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定。

对于生物分布测量，将约 200 μL AuNR@BSA 静脉注射到 BALB/c 小鼠的尾静脉。 24 小时后，处死小鼠，取出心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，在 80°C 的烘箱中干燥。消化前，对每个器官称重，加入 800 μL 浓 HNO3 (GR)，并加热至 90°C 2 小时。冷却至室温后，缓慢滴加 200 μL H2O2 (GR)，90°C 加热 1 h，然后用超纯水将溶液稀释至 10 mL。最后，通过 0.44 mm 尼龙注射器过滤器后，用 ICP-OES 测量 Au 离子的浓度。

光热处理效率

为了评价AuNR@BSA的热治疗效果，将4T1肿瘤荷瘤小鼠随机分为4组，肿瘤体积约100 mm ³ :(1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA + 激光； (3) 仅激光 (4) 空白控制。使用红外热像仪记录肿瘤部位的红外热像。分别记录治疗前后小鼠的肿瘤体积和体重。肿瘤体积可根据正态方程计算（体积 =宽度 ² × 长度/2)。两周后处死小鼠，分离肿瘤。

数据分析

采用SPSS 16.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数 ± d表示，组间比较采用方差分析，计数资料比较采用卡方检验。 P <0.05 被认为具有统计学意义。

结果与讨论

AuNR@CTAB 的合成和表征

发现金纳米棒越小，药代动力学越好，细胞毒性越低[18]。然而，金纳米棒的SPR吸收峰与纵横比高度相关，纵横比越大SPR峰的能量越低。为了合成具有大纵横比的AuNR，同时保持尽可能小的尺寸，对表面活性剂浓度、生长溶液的pH值和还原剂浓度等合成参数进行了优化。 NaBH4(aq) 是一种强还原剂，通过 LaMer 爆发成核形成 Au 核，随后 Au 离子的快速随机附着和颗粒内成熟 [19]。随着 NaBH4 摩尔量的增加，金纳米棒的最大吸收峰从 1223 到 865 nm 发生蓝移（图 1C）。生长溶液的 pH 值也是控制金纳米棒生长的关键参数，通过盐酸的量进行调节 [20]。随着盐酸用量的增加，金纳米棒的最大吸收峰逐渐从 871 nm 红移到 1070 nm（图 1D）。此外，Ag ⁺ 被认为能够控制金纳米棒的生长方向，Ag ⁺ 越低 可以实现更长的 SPR 峰吸收波长（图 1E）。最后，合成的金纳米棒呈酒红色，如图 1B 所示。因此，考虑到金纳米棒的合成效率和激光光源的可用性，我们选择在1064 nm处具有最大吸收峰的金纳米棒用于肿瘤的光热治疗。

AuNR@CTAB在不同合成条件下的光性能。 一 AuNR@CTAB的制备。 b CTAB 包覆的金纳米棒 (AuNR@CTAB) 的图像，c 不同 NaBH4 浓度制备的 AuNR@CTAB 的紫外可见光谱，d 不同 HCl 浓度制备的 AuNR@CTAB 的紫外-可见光谱 e 不同AgNO3浓度制备的AuNR@CTAB紫外-可见光谱

AuNR@BSA 的合成和表征

十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 是用于合成具有精确长度和纵横比的金纳米棒的最广泛使用的化合物。然而，当浓度高于 1-10 μM 时，CTAB 具有显着的细胞毒性。 CTAB包覆的金纳米棒（AuNR@CTAB）在生物医学中的应用受到很大限制[21]。此外，CTAB 包覆的金纳米棒在水溶液中的胶体稳定性受温度影响很大，在低温下容易结晶[22]。鉴于降低 CTAB 的细胞毒性并提高其稳定性，已经提出了几种方法来在金纳米棒合成过程中替代 CTAB 或对 CTAB 涂层的金纳米棒进行功能化。使用聚合物、肽、表面活性剂和脂质来修饰纳米颗粒表面，这些策略中的大多数使用硫醇化分子或静电相互作用力与金表面结合 [23]。蛋白质是最有前途的选择，因为它具有胶体稳定性、生物相容性和进一步功能化的优点。 [26]

CTAB 和 BSA 包裹的金纳米棒如图 2A 所示。 AuNR@BSA 的最大吸收峰约为 1064 nm，与 AuNR@CTAB 相比红移了约 30 nm（图 2B）。通过将 CTAB 涂层替换为 BSA，金纳米棒的 zeta 电位从正变为负（附加文件 1：图 S1）。从 AuNR@BSA 和 AuNR@CTAB 的 FTIR 光谱（附加文件 1：图 S2），我们可以发现 1649 cm ^-1 处的两个特征峰 和 1539 厘米 ⁻¹ 在 AuNR@BSA 的情况下，这归因于 BSA 的酰胺 I 和酰胺 II 振动带。动态光散射 (DLS) 也用于分析 AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 的流体动力学尺寸；此外，AuNR@BSA 和 AuNR@CTAB 的形态通过透射电子显微镜（TEM）表征，如图 2C、D 所示。从 DLS 的散射强度测量中可以清楚地发现两个峰，一个具有约 3.10 的流体动力学尺寸（对于 AuNR@CTAB，± 0.85) nm 和另一个约为 57.45 (± 24.22) nm。然而，在 AuNR@BSA 的情况下，峰移至 8.64 (± 3.80) nm 和 89.24 (± 42.24) nm。我们可以发现，在用 BSA 涂覆后，AuNR 的形状保持相似，除了末端变得稍微圆润（图 2C、D）。对于体内治疗应用，纳米粒子的临界尺寸限制在 100 nm 以下 [25]。超过这个尺寸，纳米粒子穿透肿瘤的能力将受到限制；因此，所提出的金纳米棒将是理想的肿瘤治疗候选者 [24]。如附加文件1：图S3所示，从金纳米粒子的(111)、(200)、(220)和(311)面的XRD图中可以清楚地观察到Au的特征峰。

AuNR@BSA 和 AuNR@CTAB 的表征。 一 AuNR@BSA的制备。 b AuNR@CTAB (L) 和 AuNR@BSA (R) 的紫外-可见光谱。 c AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 的 DLS 强度测量。 d AuNR@CTAB和AuNR@BSA的TEM图

体外金纳米棒的光热效应

1064 nm 二极管激光器作为最经济的 NIR-II 光源被认为是光热疗法的最佳波长。因此，用于高效光热治疗的理想 NIR-II 金纳米平台被认为具有在 1064 nm 处具有强 SPR 吸收、高光热效率和优异的光热稳定性的特点。为了研究制备的 AuNR@BSA 的光热效应，PBS 和不同 OD（=0.5, 1, 1.5, 2）的 AuNR@BSA 在 1064 nm 处激发，光强度为 0.35 至 1 W/cm ² 30 分钟。使用温度成像仪每 5 分钟记录一次温度变化，如图 3A 所示。具有相同吸光度（OD =1）的AuNR@BSA和AuNR@CTAB的光热效应显着高于PBS。我们可以发现温度在前 5 分钟迅速上升，然后在其余时间保持在 80°C 左右，如图 3A 所示。 PBS 的光热诱导温度升高主要是由于水在 1064 nm 处的泛音吸收引起的。作为光强度函数的最高温度如图 3B 所示。发现吸光度约为 1 时 AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 的光致热温度与光强度成正比。随着激光强度越来越高，AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 的温度升高比 PBS 快得多。此外，图 3C 显示在相同的照射条件下 (1064 nm, 0.75 W/cm ² )，随着 AuNR 的吸光度增加，最大光热温度显着增加。 BSA 涂层 AuNR 的光热性能略好于 CTAB 涂层。 AuNR@BSA的最高光热温度（OD =1, 61.1°C）在三个辐照周期（0.5 W/cm ² ）内没有显着变化 ，10 分钟），这表明所制备的 AuNR@BSA 具有出色的光热稳定性（图 3D）。图 3E 描绘了 AuNR@CTAB（OD =1）、AuNR@BSA（OD =1）和 PBS 在激光照射下 10 分钟的光热温度图像。 PBS 的最高温度为 44.5°C，而 AuNR 的最高温度高达 85.5°C。以上结果表明合成的AuNR@BSA在NIR-II范围内具有合适的吸收特性、光热转换效率和光稳定性，是一种优异的光热治疗剂。

AuNR@BSA光热效应的体外评价。 一 AuNR@BSA 和 AuNR@CTAB 的光热温度与激光照射时间的函数关系（SPR 吸光度约为 1, 1064 nm, 1 W/cm ² ）。 b NIR 触发的 PBS、AuNR@CTAB（OD =1）和 AuNR@BSA（OD =1）的温度升高作为激光照射强度（1064 nm，0.35 至 1 W/cm ^{2 ）。 c 在 10 分钟激光照射（1064 nm，1 W/cm 2 ）下，具有不同吸光度的 AuNR@BSA 和 AuNR@CTAB 的 NIR 触发温度升高 ）。 d AuNR@BSA (OD =1) 在三个周期照射下的光热转化 (1064 nm, 0.5 W/cm 2 ）。 e PBS、AuNR@CTAB (OD =1)、AuNR@BSA (OD =1) 在近红外激光 (1064 nm, 1 W/cm 2 ) 照射下的热图像 ) 的时间间隔为 5 分钟和 10 分钟。 (mean ± SD, n =3)}

体外金纳米棒的细胞毒性和光热毒性

进行CCK-8分析以量化不同浓度的AuNR@CTAB和AuNR@BSA对4T1细胞的细胞毒性。即使没有激光照射，AuNR@CTAB 在非常低的浓度下（吸光度约为 0.05）已经表现出显着的细胞毒性，因此其生物学应用受到极大限制。然而，AuNR@BSA 表现出良好的生物学应用前景，例如，当 AuNR@BSA 吸光度达到约 1 时，细胞活力仍在可接受的范围内（图 4A）。受 AuNR@BSA 良好的稳定性和高光热转换效率的鼓舞，在体外对 4T1 肿瘤细胞进行光热毒性，光强度约为 0.75 W/cm ² 10 分钟。在吸光度为1左右时发现显着的光热毒性，细胞存活率约为20%；然而，在非辐射实验中发现大约 100% 的细胞存活率（图 4B，附加文件 1：图 S4）。这些体外结果表明，NIR-II区的AuNR@BSA光热处理可以在相对辐射强度下有效杀死癌细胞。

金纳米棒的体外细胞毒性和光热毒性。 一 用不同浓度的 AuNR@CTAB 和 AuNR@BSA 孵育的 4T1 细胞的细胞活力。 b 4T1 细胞在不同浓度的 AuNR@BSA 和近红外激光照射（1064 nm，0.75 W/cm ² ）下孵育的细胞活力 ，10 分钟）。 (mean ± SD, n =3)

体内生物分布研究

血液循环时间对于成功递送基于纳米颗粒的药物至关重要 [24]。 AuNR@BSA 的血液循环时间通过 ICP-OES 由 Au 浓度监测，发现约为 1.5 小时（半衰期）（图 5A）。 AuNR@BSA 的体内生物分布也通过不同器官中的 Au 浓度来测量（附加文件 1：图 S5）。如图 5B 所示，AuNR@BSA 作为网状内皮系统 (RES) 的一个器官，由于其强大的吞噬作用，在静脉注射 24 小时后在肝脏和脾脏中高度积累 [27, 28]。这些结果表明AuNR@BSA可以有效地在肝脏和脾脏中积累。 AuNR@BSA在肝脾相关疾病中具有潜在的应用价值。

AuNR@BSA在血液和器官中的生物分布。 一 通过静脉注射 AuNR@BSA，血液中 Au 浓度随时间的变化。 b AuNR@BSA在各器官中的生物分布

体内金纳米棒的近红外光热处理

AuNR@BSA 优异的光热性能鼓励我们对荷瘤 BALB/c 小鼠进行体内光热治疗。将 AuNR@BSA 原位注射到肿瘤中，然后在 10 分钟后引入光进行光热治疗（1064 nm，0.75 W/cm ² ）。体内温度变化由热温度成像仪监测。处理前后的温度变化如图 6D 所示。照射后 10 分钟内肿瘤部位的温度约为 63.9°C，并且在此温度下保持很小的波动（图 6D）。相比之下，在相同照射条件下（AuNR@BSA 组、PBS 组、激光组），对照组没有观察到温度变化。光热治疗后，每两天监测小鼠的肿瘤体积和体重，持续 14 天。如图 6A、B 所示，AuNR@BSA_laser 组的肿瘤被完全抑制并在原肿瘤部位留下烧痂，而对照组的生长相对较快且失控（AuNR@BSA 组， PBS 组、激光组）。结痂是烧伤的皮肤，这直接证明了注射AuNR@BSA的PPT过程可能会导致肿瘤部位局部过热。光热效应非常有效，因为我们观察到 AuNR@BSA + 激光组的实体瘤在治疗后两天迅速减少。为了进一步捕捉治疗后的肿瘤变化，在第 14 天的观察结束时，杀死小鼠并分离肿瘤。如图 6C 所示，AuNR@BSA_laser 治疗组的肿瘤大小被完全抑制，而所有其他组的生长都不受控制。来自组（AuNR@BSA + 激光）的小鼠图像显示，在治疗 14 天后，肿瘤没有继续生长（图 6E）。因此，考虑到理想的治疗能力和没有明显的细胞毒性，用于近红外第二窗口激光照射治疗的 AuNR@BSA 是体内光触发 PTT 的理想候选者。这清楚地表明，使用当前NR-II疗法的简单热疗可以有效抑制肿瘤生长（附加文件1）。

荷瘤小鼠的光热治疗。 一 在不同治疗条件下，肿瘤体积随时间的变化。 b 治疗后荷瘤小鼠体重随时间的变化。 c 治疗14天后不同组肿瘤组织照片。 d 暴露于 1064 纳米激光 (0.75 W/cm ² ) 的荷瘤小鼠的红外热成像图像 ，10 分钟）在瘤内注射 AuNR@BSA 后 10 分钟。 e AuNR@BSA_laser 组小鼠治疗后的图像。 (mean ± SD, n =2)

此外，对光热治疗后的孤立肿瘤和未治疗的肿瘤进行TEM。光热处理后的肿瘤组织中可以观察到AuNR。进一步证明金纳米棒在肿瘤组织环境中仍具有优异的光稳定性（图7）。

AuNR@BSA在肿瘤组织中的透射电子显微照片a 治疗的肿瘤。 b 未治疗的肿瘤

结论

在这里，我们合成了在光热治疗的第二个近红外窗口中具有 SPR 吸收最大值的 AuNR@BSA，因为它们具有出色的光热性能和生物相容性。报道的AuNR的生物相容性通过用牛血清白蛋白包被得到显着提高，并且光热性能不受影响。静脉注射的AuNR@BSA的生物分布表明肝脏和脾脏中积累了大量的AuNR。 The TEM image of AuNR@BSA inside tumor reveals that the high in vivo photostability of the AuNR and suggests that once upon injection, several phototreatment might be applied to reach the desired therapy outcomes. The excellent photothermal conversion of the reported AuNR was able to sufficiently inhibit tumor growth even under low light irradiation. The PTT of AuNR@BSA combined with other treatment strategies, such as immunotherapy and chemotherapy, would be promising for developing a useful tool for personalized, safe, and effective tumor treatment.

Availability of data and materials

The data set used and/or analyzed in this study can be obtained from the corresponding author upon reasonable request. All data generated or analyzed during this study is included in this published article.