牛血清白蛋白包覆金纳米棒实现低剂量NIR-II光热治疗

摘要

第二近红外窗口（NIR-II, 1000–1300 nm）提供无与伦比的组织穿透深度，是成像和光热治疗的理想光学窗口。但制造在该波段吸收且保持低细胞毒性的金纳米棒仍具挑战。我们设计一系列高长径比金纳米棒，在NIR-II窗口表现鲁棒表面等离子体共振。牛血清白蛋白（BSA）包覆显著提升生物相容性，不损光学性能。乳腺癌小鼠模型中，BSA包覆纳米棒仅需0.75 W cm⁻² NIR-II激光强度即可完全消融肿瘤。结果证实大长径比金纳米棒可行低剂量NIR-II光热治疗。

引言

金纳米颗粒（AuNPs）因优异生物相容性和低细胞毒性成为生物医学研究多功能剂。高X射线衰减使其成为CT肿瘤成像候选；显著表面等离子体共振（SPR）实现高效光热转换用于光热治疗（PTT）。可调尺寸形貌的AuNPs（纳米棒、纳米壳、纳米笼）已用于癌症消融，特别是金纳米棒（AuNRs）各向异性赋予强近红外吸收和光热稳定性。近红外光比可见光穿透更深，长波长散射更小。棒状颗粒还显增强肿瘤渗透和延长循环，促进富集。但常规PTT常需高功率激光，风险附带损伤。NIR-II窗口比NIR-I穿透更深、散射更低，可在更低激光强度下有效治疗。然而制造吸收NIR-II且生物相容的AuNRs困难。本文报道无种子法合成吸收峰1000–1300 nm AuNRs，BSA包覆降低细胞毒性，评估体内外光热性能，在乳腺癌小鼠模型中用0.75 W cm⁻²激光实现肿瘤消融。

材料与方法

材料

四氯合金酸三水合物（99.9%）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB, 99%）、硝酸（GR 65–68%）、过氧化氢（30%）、硼氢化钠（NaBH₄, 97%）、硝酸银（AgNO₃, 99.8%）、盐酸（38%）、氢醌（99%）、牛血清白蛋白（BSA, 98%）购自上海奥拉丁生物科技。RPMI 1640、青霉素-链霉素、PBS、胎牛血清（FBS）、4T1细胞、CCK-8试剂盒分别来自HyClone、Corning、Gibco、Dojindo。全程超纯水（Millipore）。

AuNR@CTAB制备

无种子法合成AuNRs。简述：0.4 mL 10 mM HAuCl₄与10 mL 0.1 M CTAB混合，加23–33 μL 100 mM AgNO₃。继加10–30 μL 1.2 M HCl和525 μL 0.1 M氢醌得浅黄生长液。搅拌15 min后注入10–40 μL新配10 mM冰冷NaBH₄，搅拌30 s，室温陈化18 h。AuNR@CTAB经两次PBS洗涤纯化。

AuNR@BSA制备

将AuNR@CTAB中CTAB浓度调至1 mM并超声溶解。3 mL AuNR@CTAB与3 mL 10 mg mL⁻¹ BSA混合超声30 min。离心（9500×g, 40 min）沉淀重悬于6 mL 5 mg mL⁻¹ BSA，2 M NaOH调pH至11–12，搅拌≥18 h。最终AuNR@BSA两次PBS洗涤后PBS保存。

表征

透射电镜（TEM, Talos F200X）观察形貌；动态光散射（DLS, Zetasizer Nano ZS）测粒径和ζ电位；UV-Vis（Shimadzu UV-2700）记录吸收。体内肿瘤分布注射后经TEM观察切片。傅里叶变换红外（FT-IR）和XRD（北京中科百测）确认BSA包覆和金结晶。

光热性能

AuNR溶液（OD=0.5–2 @1064 nm）经1064 nm激光（0.35–1 W cm⁻²）照射30 min，红外热成像（FLUKE TI25）监测温升。光稳定性经0.5 W cm⁻²下重复10 min开/关循环评估。

体外细胞毒性

4T1细胞96孔板种植（5×10³ cells/well）培养24 h。加入AuNR@CTAB或AuNR@BSA（10 μL）不同浓度，孵育24 h。加CCK-8（10 μL）孵育40 min，450 nm测吸光度。光毒性实验：1064 nm照射（0.75 W cm⁻², 10 min）后CCK-8测试。

动物实验

雌性BALB/c小鼠（6–8周）皮下接种2×10⁶ 4T1细胞。肿瘤达~100 mm³开始实验。所有操作遵循机构伦理规范。

体内生物分布与循环

尾静脉注射AuNR@BSA（200 μL）。0.25, 2, 4, 6, 8, 12, 36, 48 h采血，HNO₃/H₂O₂消解，ICP-OES定量Au含量。24 h取心、肝、脾、肺、肾消解测Au浓度。

光热治疗疗效

小鼠分四组：(1) AuNR@BSA, (2) AuNR@BSA+激光, (3) 仅激光, (4) 对照。肿瘤内注射AuNR@BSA（200 μL），10 min后1064 nm照射（0.75 W cm⁻², 10 min）。监测肿瘤温度、体积、体重14天。终点剖肿瘤。

数据分析

SPSS 16.0统计分析。数据均值±SD；p<0.05为显著。

结果与讨论

AuNR@CTAB合成表征

优化NaBH₄、HCl、Ag⁺浓度控制长径比和SPR峰位。增加NaBH₄蓝移峰从1223至865 nm；增大HCl红移871至1070 nm。降低Ag⁺浓度进一步延伸SPR峰。最终AuNRs呈酒红色，吸收最大值1064 nm（图1），匹配NIR-II窗口及可用激光源。

图1. 不同合成条件下AuNR@CTAB光学性质：(a)制备示意；(b)TEM像；(c)UV-Vis谱随NaBH₄变化；(d)随HCl变化；(e)随AgNO₃变化。

AuNR@BSA合成表征

CTAB虽利于纳米棒生长，但>1–10 μM有细胞毒性且低温易沉淀。BSA置换CTAB兼顾降毒和提高胶体稳定性。AuNR@BSA保持相似长径比，SPR峰~30 nm红移至1064 nm（图2）。ζ电位由正（CTAB）转负（BSA），确认表面置换。FT-IR显示BSA特征酰胺带（1649, 1539 cm⁻¹）。DLS显示两族水动力直径8.6 nm和89 nm，指示BSA包覆后尺寸轻微增加。TEM确认棒状形貌末端略圆（图2）。所有尺寸<100 nm，利于肿瘤渗透。

图2. AuNR@BSA与AuNR@CTAB表征：(a)合成示意；(b)UV-Vis谱；(c)DLS粒径分布；(d)TEM像。

体外光热效应

AuNR@BSA（OD≈1）在0.35 W cm⁻²下5 min从~25°C升至80°C并趋稳（图3A）。温升随激光功率线性（3B）。增加OD进一步提高峰温。0.5 W cm⁻²三次10 min循环确认光热稳定性（3D）。热成像显示AuNRs峰温85.5°C vs PBS 44.5°C（3E）。结果凸显BSA包覆纳米棒在NIR-II卓越光热转换和稳定性。

图3. 体外光热性能：(a)温度-时间；(b)温度-激光功率；(c)温度-吸光度；(d)三循环稳定性；(e)热成像。

体外细胞毒性与光热毒性

AuNR@CTAB甚至低浓度（OD≈0.05）显显著细胞毒性；AuNR@BSA至OD≈1仍维持>80%细胞活力（图4A）。光热处理（0.75 W cm⁻², 10 min）使4T1活力降至~20%（OD≈1），对照组~100%（4B）。BSA包覆保生物相容性同时实现高效光热杀伤。

图4. 细胞毒性与光热毒性：(a)活力-浓度；(b)有/无激光活力。

体内生物分布与循环

AuNR@BSA血液半衰期~1.5 h（图5A）。24 h主要富集肝脾，符合网状内皮系统摄取（5B）。提示潜在肝脾靶向应用。

图5. 生物分布：(a)血液Au浓度随时间；(b)24 h器官分布。

体内光热治疗

肿瘤内注射AuNR@BSA后1064 nm照射（0.75 W cm⁻², 10 min）肿瘤温度升至~64°C，对照组维持体温（图6D）。14天内AuNR@BSA+激光组肿瘤完全消融无复发；对照组肿瘤快速进展（6A, B）。剖检确认无残留肿瘤组织（6C）。处理肿瘤TEM显示完整AuNRs，证实体内光稳定性（图7）。

图6. 体内治疗结果：(a)肿瘤体积；(b)体重；(c)肿瘤照片；(d)红外热成像；(e)治疗后图像。

图7. 肿瘤组织中AuNR@BSA TEM：(a)治疗后；(b)未治疗。

结论

合成SPR峰1064 nm的BSA包覆金纳米棒，兼具高光热效率和增强生物相容性。体内研究证实低剂量NIR-II激光照射可在乳腺癌小鼠模型中快速消融肿瘤。纳米棒显良好生物分布（肝脾显著摄取）并在肿瘤微环境保持光稳定性。这些特性使AuNR@BSA成为NIR-II光热治疗有前景平台，可结合免疫/化疗实现个性化、安全、高效癌症治疗。