GoldMag纳米粒子PSS-MA包覆增强稳定性与光学精度用于蛋白检测

摘要

金磁纳米粒子(GoldMag)因结合Fe₃O₄和Au纳米粒子独特理化性能而备受关注。聚合物包覆GoldMag不仅提高复合粒子在缓冲液中稳定性，更在建立临床相关生物分子即时光学检测中起关键作用。本文采用聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)(PSS-MA)——一种同时含磺酸和羧酸阴离子基团的负性聚电解质——包覆正电荷GoldMag(30 nm)表面。PSS-MA包覆GoldMag复合物在544 nm处呈稳定表面等离子体共振(SPR)吸收峰。一对抗D-二聚体抗体偶联于该复合纳米粒子表面，在0.3-6 μg/mL范围检测靶蛋白D-二聚体。D-二聚体-抗体三明治桥接导致GoldMag组装引起特征峰位移，实现检测。

背景

利用超顺磁性，磁性纳米粒子广泛用于药物/基因递送、磁共振成像、生物分析等生物医学应用。金磁纳米粒子(GoldMag)由Fe₃O₄/Au组成，不仅具氧化铁纳米粒子理化性质，还呈现金纳米粒子易表面功能化和独特光学性质。这些特性在生物学领域引起极大关注，特别是基于光学性质的生物分子检测。例如Wang等用Fe₃O₄-Au纳米棒作光学探针多重病原体检测。然而与其他纳米粒子一样，高表面能驱使GoldMag粒子在缓冲液中相互聚集成簇，极大限制其在生物医学光学检测应用。因此防止GoldMag聚集、确保稳定胶体溶液至关重要。聚合物包覆定制GoldMag用于靶分子检测极具实用价值。已报道通过各种大分子有机物表面修饰可改善GoldMag分散性，如11-巯基十一烷酸(MUA)、聚苯乙烯磺酸(PSS)、聚乙烯亚胺(PEI)。MUA经配体交换策略引入GoldMag表面，增强胶体稳定性。MUA-GoldMag用于基于光学性质的蛋白检测。但MUA链太短，无法提供足够空间位阻保证粒子充分分散；且MUA羧基密度低限制蛋白吸附量。这些劣势限制MUA粒子在光学仪器应用及生物标志物检测灵敏度。

聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)(PSS-MA)(PSS-MA 3:1, Mw~20000)为嵌段共聚物，由PSS和马来酸共价键合制成，同时含磺酸和羧酸基团。大量羧基和磺酸基提供的静电排斥，以及PSS-MA长聚合物链带来的空间位阻，使该聚合物在维持纳米粒子稳定性极具用处。事实上PSS-MA已用作氧化铁纳米材料、钯和Ag-Au双金属纳米结构制备稳定剂。Johnston等报道共聚物包覆氧化铁纳米簇比单一大分子聚合物包覆提供更高电位立体稳定化程度。此外PSS-MA马来酸酐部分大量羧基允许生物分子化学修饰用于生物医学应用。

D-二聚体是交联纤维蛋白降解稳定终产物，源于增强纤维蛋白形成和纤维蛋白溶解。血液D-二聚体水平测定广泛用于血栓栓塞事件和心肌梗死诊断。此处以D-二聚体为模型评估PSS-MA-GoldMag光学检测特定蛋白潜力。我们用一对抗D-二聚体抗体固定于PSS-MA-GoldMag形成探针，通过双抗体三明治免疫分析检测D-二聚体。

因此本研究首次用PSS-MA修饰GoldMag表面。这不仅增强磁性纳米粒子稳定性，还介导纳米粒子与抗体偶联实现D-二聚体检测。

方法

材料与试剂

GoldMag(5 mg/mL)由西安GoldMag纳米生物科技提供。硼酸、硼砷、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、PSS-MA(PSS-MA 3:1, Mw~20000)购自Sigma-Aldrich。一对单克隆抗D-二聚体抗体(抗体1:M-2.1.16;抗体2:M-1.2.57)购自罗氏。D-二聚体购自Meridian Chemicals。

PSS-MA包覆GoldMag表面修饰

GoldMag按文献[17]合成。13.3 mL CTAB(50 mmol/L)加入13.3 mL GoldMag(约3 mg/mL)。机械搅拌(200 rpm)联合超声(SB-5200DTD,中国)30 min，继续搅拌30 min。彻底去离子水洗涤。CTAB-GoldMag重分散于10 mL去离子水，加入16 mL 25%(w/w) PSS-MA溶液，搅拌(180 rpm)90 min。修饰粒子去离子水洗两次，分散于去离子水。

表征

透射电镜(TEM,日立H-600)观察PSS-MA-GoldMag。动态光散射(DLS,Malvern Zetasizer)分析粒径分布。傅里叶变换红外光谱(FTIR,Thermo Nicolet 5700)表征PSS-MA-GoldMag官能团。梅特勒托利多SDTA 851e热重分析仪(TGA)分析PSS-MA-GoldMag聚合物表层比例。紫外-可见分光光度计(UV-2550,岛津)450-700 nm记录GoldMag表面等离子体共振(SPR)光谱。

抗D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag探针制备

1 mg GoldMag悬浮于1 mL硼砷/硼酸缓冲液(0.02 M, pH 7.4)，含75 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。加入100 μg抗D-二聚体抗体，超声1 h。加入3 mL封闭缓冲液(0.02 M硼砷/硼酸缓冲液, pH 7.4, 含5% BSA)孵育1.5 h。外部磁场分离后，抗D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag复合物置于硼砷/硼酸缓冲液4 °C保存。SPR光谱和DLS测量确认抗体偶联。

D-二聚体溶液用小牛血清稀释母液(40 mg/mL)制备。三浓度D-二聚体(0.6, 2, 6 μg/mL)优化反应时间。10 μL抗D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag(0.3 mg/mL)混合80 μL D-二聚体溶液(0.6, 2, 6 μg/mL)，25 °C孵育10, 20, 30, 40 min。UV-2550读取PSS-MA-GoldMag复合物SPR峰波长。

配制6, 3, 1.5, 0.75, 0.3 μg/mL D-二聚体溶液分析浓度与SPR光谱变化关系。10 μL探针(0.3 mg/mL)混合80 μL各浓度D-二聚体，25 °C孵育30 min，读取SPR峰波长。

评估甘油三酯、胆红素、血红蛋白干扰：制备0和3 μg/mL D-二聚体溶液，分别加入22 mg/mL甘油三酯、0.2 mg/mL胆红素、2 mg/mL血红蛋白。加入10 μL探针，读取SPR峰波长。

结果与讨论

方案1展示粒子表面修饰和功能化流程用于蛋白比色检测。为研究PSS-MA在PSS-MA-GoldMag结构上吸附掺入，进行FTIR、SPR、TGA分析。图1a显示纯PSS-MA、PSS-MA-GoldMag、GoldMag FTIR谱。3000-3700 cm⁻¹宽强带对应聚合物链-CO-OH伸缩振动和-SO₂-OH羟基。磺酸基对称振动(SO₃⁻)在1037和1126 cm⁻¹，苯环C=C伸缩振动在1403和1637 cm⁻¹。PSS-MA这些特征吸收带在PSS-MA-GoldMag中观测到，证实原始粒子成功包覆PSS-MA。SPR带从555 nm蓝移11 nm至544 nm确认GoldMag表面化学基团变化(图1b)。SPR峰位置和宽度与纳米粒子表面、环境、分散性相关。TGA分析指示有机物与GoldMag重量比近1:4(图1c)。低温失重归因脱水；升温失重可能因表面有机物氧化分解。修饰过程中CTAB-GoldMag带正电(+12.2 mV)，PSS-MA包覆后粒子表面带负电(-24.5 mV)(图1d)。以上结果均表明PSS-MA成功附着于纳米粒子表面。

TEM微图(图2a,b)显示GoldMag和PSS-MA-GoldMag修饰后均为单分散。高分辨电镜图清晰可见粒子表面聚合物层，进一步证实包覆成功(图2b)。图2c显示PSS-MA-GoldMag平均直径116 nm。PSS-MA-GoldMag悬浮液呈酒红色，指示纳米粒子良好稳定性(水中1年)。

SPR光谱分析GoldMag和PSS-MA-GoldMag在不同pH缓冲液中光学特性稳定性[7]。图3a显示GoldMag在pH 6.0-9.0硼砷/硼酸缓冲液中SPR特征峰向长波长红移(从555 nm)。缓冲液组成也影响GoldMag悬浮液稳定性。GoldMag悬浮于PB缓冲液(pH 7.4)、硼砷/硼酸缓冲液(pH 7.4)、NaCl溶液(10 mM)时SPR峰移至更高波长(558 nm)，对比去离子水(550 nm)(图3c)。然而PSS-MA-GoldMag分散于电解质溶液或不同pH缓冲液中特征SPR峰(545±2 nm)无显著变化(图3b,d)。Xia等和Storhoff等也报道纳米粒子聚集致SPR光谱红移。GoldMag和PSS-MA-GoldMag zeta电位也测定(图3e,f)。报道zeta电位低于±30 mV导致粒子团聚。GoldMag悬浮于PB缓冲液(pH 7.4)、硼砷/硼酸缓冲液(pH 7.4)、NaCl溶液(10 mM)时zeta电位分别为-16.7±1.1、-14.3±2.1、-8.9±1.5 mV。GoldMag在pH 6.0-9.0硼砷/硼酸缓冲液中zeta电位为-14.2±1.7、-17±1.1、13.9±1.7、-18.1±1.6 mV。然而PSS-MA附着显著降低其在不同电解质溶液和pH下zeta电位绝对值，所有情况均低于-30 mV。结果表明PSS-MA表面修饰显著提高GoldMag对缓冲液组分和pH变化抵抗力，保证高分散性。

为研究蛋白与PSS-MA-GoldMag相互作用，抗D-二聚体抗体经EDC介导与PSS-MA-GoldMag羧基反应偶联。图4a显示抗体反应后SPR峰红移，指示抗体偶联纳米粒子。平均直径从116 nm增至130 nm确证抗体引入(图4b)。评价抗体量对PSS-MA-GoldMag光学性质影响：向悬浮液加入不同量抗D-二聚体抗体(20-200 μg)后SPR光谱分析。图4c显示SPR峰保持548±3.0 nm不变，与抗体量无关。

为评价偶联后抗体活性，制备探针A(固定一对抗体1和2)和探针B(仅固定抗体1)。SPR光谱分析两探针与D-二聚体相互作用。向探针A加入三浓度D-二聚体(0.6, 2, 6 μg/mL)，观察40 min内SPR峰最大值变化获最佳反应时间。图5a显示随时间抗原-抗体三明治桥接导致PSS-MA-GoldMag聚集，SPR带显著移动。低浓度(0.6 μg/mL)20-40 min SPR谱无显著变化，指示20 min足够0.6 μg/mL或更低浓度反应。中高浓度(2, 6 μg/mL)波长持续增加至30 min，指示最佳反应时间30 min。图5b显示D-二聚体浓度从0.3增至6 μg/mL时，复合粒子SPR谱呈明显红移(λmax从550至570 nm)和特征峰强度下降。这是D-二聚体与探针A上抗体1和2交联导致PSS-MA-GoldMag聚集引起的。聚集改变GoldMag金部分光学性质。Jiang等和Li等也报道纳米金聚集致SPR光谱红移变宽。但图5d探针B未观测红移，因D-二聚体与抗体1相互作用无法导致纳米粒子组装。此外即使加入探针A的D-二聚体低至0.3 μg/mL仍观测到5 nm可辨红移，指示检测限低于该生物标志物诊断临界值(0.5 μg/mL)。SPR峰位与D-二聚体浓度在0.3-6 μg/mL范围线性相关(r²=0.9944)(图5c)。

图6显示甘油三酯、胆红素、血红蛋白存在下PSS-MA-GoldMag SPR特征峰无显著位移。表明本蛋白检测系统与这些物质无干扰反应。

结果表明PSS-MA-GoldMag是极具前景的磁性纳米粒子用于蛋白固定化，可通过抗体1-靶蛋白-抗体2在粒子表面形成三明治桥接。这使PSS-MA-GoldMag成为即时光学生物标志物检测免疫分析的优良材料。

本研究首次用PSS-MA修饰GoldMag(方案1)。引入PSS-MA显著改善其缓冲液中稳定性。除PSS-MA长链空间位阻外，PSS-MA羧基和磺基引起纳米粒子间静电排斥，显著增强PSS-MA-GoldMag稳定性。粒子表面大量羧基满足生物分子偶联需求。

结论

本研究报道一种简便快速PSS-MA包覆GoldMag方法。结果显示胶体稳定性和分散性经PSS-MA引入显著改善。粒子在宽pH范围缓冲液中表现良好稳定性。此外羧基存在提供蛋白偶联纳米粒子选项。以D-二聚体及其抗体为模型，发现光学特性可通过抗原与抗体-纳米粒子复合物交联调控。结果表明PSS-MA修饰GoldMag可作为基于免疫分析光学检测极具前景的候选材料。

缩略语

DLS:

动态光散射

FTIR:

傅里叶变换红外光谱

GoldMag:

金磁纳米粒子

MUA:

11-巯基十一烷酸

PEI:

聚乙烯亚胺

PSS:

聚苯乙烯磺酸

PSS-MA:

聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)

SPR:

表面等离子体共振

TEM:

透射电子显微镜

TGA:

热重分析仪