使用聚（4-苯乙烯磺酸-共-马来酸）增强金磁性纳米颗粒的稳定性：用于蛋白质检测的定制光学特性

背景

利用特定的磁化特性，即超顺磁性，磁性纳米粒子已被广泛研究用于生物医学应用，例如药物/基因传递、磁共振成像和生物测定 [1,2,3]。由 Fe3O4/Au 组成的金磁性纳米粒子 (GoldMag) 不仅具有氧化铁纳米粒子的物理化学性质，而且还呈现出金纳米粒子易于表面功能化和独特的光学性质等特性。这些显着特征在生物学领域引起了极大的关注[4, 5]，特别是在基于光学特性的生物分子检测中。例如，Wang 等人。使用 Fe3O4-Au 棒作为多重病原体检测的光学探针 [6]。然而，与其他纳米粒子一样，高表面能迫使 GoldMag 粒子彼此靠近，从而在缓冲溶液中形成簇。这极大地限制了它们在生物医学领域的光学检测应用。因此，防止 GoldMag 聚集并确保胶体溶液稳定至关重要。定制 GoldMag 用于检测基于聚合物涂层的目标分子具有很高的实用性。据报道，GoldMag 的分散性可以通过用各种高分子有机化合物进行表面改性来提高，例如 11-巯基十一烷酸 (MUA) [7]、聚苯乙烯磺酸盐 (PSS) [8] 和聚乙烯亚胺 (PEI) [9]。使用配体交换策略将 MUA 带到 GoldMag 的表面。它通过用 MUA 进行表面改性来增强 GoldMag 胶体溶液的稳定性 [7]。这些 MUA-GoldMag 已用于基于光学特性的蛋白质检测。然而，MUA 的链太短而无法提供足够的空间位阻来确保粒子的足够分散。此外，MUA 中羧基的低密度限制了 GoldMag 可以吸收的蛋白质数量。这些缺点限制了MUA粒子在光学仪器中的应用，并限制了生物标志物检测所需的灵敏度。

聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸) (PSS-MA) (PSS-MA 3:1, Mw ~ 20,000) 是一种嵌段共聚物，由 PSS 和聚马来酸共价键合而成，同时含有磺酸盐和羧基。大量羧基和磺酸盐基团提供的静电排斥以及来自 PSS-MA 长聚合物链的空间位阻使该聚合物在维持纳米粒子的稳定性方面非常有用。事实上，PSS-MA 已被用作纳米颗粒制备中的稳定剂，如氧化铁纳米材料、钯和 Ag-Au 双金属纳米结构 [10,11,12]。约翰斯顿等人。据报道，共聚物涂覆的氧化铁纳米团簇比单个高分子聚合物涂覆的氧化铁纳米团簇确保更高程度的电空间稳定性[13]。此外，PSS-MA 的聚马来酸部分中的大量羧基可以用生物分子进行化学修饰，用于生物医学应用。

D-二聚体是交联纤维蛋白降解的稳定终产物，由增强的纤维蛋白形成和纤维蛋白溶解产生 [14]。血液中 D-二聚体水平的测定广泛用于血栓栓塞事件和心肌梗塞的诊断 [15, 16]。在这里，我们使用 D-二聚体作为模型来评估使用 PSS-MA-GoldMag 进行特定蛋白质光学检测的潜力。我们将一对抗D-二聚体抗体固定在PSS-MA-GoldMag上，形成探针用于双抗体夹心免疫法检测D-二聚体。

因此，在本研究中，PSS-MA 用于 GoldMag 的表面改性。这不仅增强了磁性纳米粒子的稳定性，而且介导了纳米粒子与二聚体检测抗体之间的结合。

方法

材料和试剂

GoldMag (5 mg/mL) 由 Xi'an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd.（中国西安）提供。硼酸、硼砂、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、聚（4-苯乙烯磺酸-共-马来酸）（PSS-MA）（PSS-MA 3:1，Mw ~ 20,000）购自美国 Sigma-Aldrich。一对单克隆 D-二聚体抗体（抗体 1：M-2.1.16；抗体 2：M-1.2.57）购自 Roche。 D-二聚体购自美国Meridian Chemicals。

采用 PSS-MA 的表面改性 GoldMag

GoldMag 的合成方法如前所述 [17]。将 13.3 mL CTAB（50 mmol/L）添加到 13.3 mL GoldMag（约 3 mg/mL）中。将混合物机械搅拌 (200 rpm) 结合超声处理 (SB-5200DTD，中国) 30 分钟，然后在没有超声处理的情况下再搅拌 30 分钟。用去离子水彻底洗涤颗粒。 CTAB-GoldMag 重新分散在 10 mL 去离子水和 16 mL 25% (w /w )加入 PSS-MA 溶液，然后搅拌 (180 rpm) 90 分钟。改性后的颗粒用去离子水洗涤两次，分散在去离子水中。

特征化

使用透射电子显微镜（TEM，Hitachi H-600，Hitachi Corporation，Japan）观察 PSS-MA-GoldMag。通过 DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, UK) 分析粒度分布。傅里叶变换红外光谱（FTIR，Thermo Nicolet 5700，Thermo Nicolet Corporation，USA）用于表征 PSS-MA-GoldMag 的官能团。使用 Metter Toledo SDTA 851e 热重分析仪 (TGA) 分析 PSS-MA-GoldMag 中聚合物表面壳的比例。使用 UV-2550 分光光度计（日本岛津制作所）在 450-700 nm 波长范围内记录 GoldMag 的表面等离子体共振 (SPR) 光谱。

制备抗 D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag 探针

将 1 毫克 GoldMag 悬浮在 1 mL 硼砂/硼酸盐缓冲液（0.02 M，pH 7.4）中，其中含有 75 mg/mL 1-乙基-3-（3-二甲基-氨基丙基）碳二亚胺 (EDC)。然后，向悬浮液中加入 100 μg 抗 D-二聚体抗体，然后超声处理 1 小时。将三毫升封闭缓冲液（0.02 M 硼砂/硼酸盐缓冲液，pH 7.4，含有 5% BSA）加入混合物中并孵育 1.5 小时。在外部磁场下分离后，将抗 D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag 复合物保存在 4°C 下的硼砂/硼酸盐缓冲液中。 SPR光谱和动态光散射（DLS）测量证实了抗D-二聚体抗体在PSS-MA-GoldMag表面的结合。

D-二聚体溶液是通过用小牛血清稀释 D-二聚体储备溶液 (40 mg/mL) 制备的。三种浓度的 D-二聚体（0.6、2 和 6 μg/mL）用于优化 D-二聚体与抗 D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag 复合物之间的反应时间。将 10 微升抗 D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag（0.3 毫克/毫升）与 80 微升 D-二聚体溶液（0.6、2 和 6 微克/毫升）混合，并将混合物在 25° C 保持 10、20、30 和 40 分钟。使用UV-2550分光光度计读取PSS-MA-GoldMag复合材料的SPR峰波长。

制备浓度为 6、3、1.5、0.75 和 0.3 μg/mL 的 D-二聚体溶液，分析 D-二聚体浓度与 SPR 谱变化之间的关系。将 10 微升抗 D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag（0.3 毫克/毫升）与 80 微升 D-二聚体溶液（6、3、1.5、0.75 和 0.3 微克/毫升）混合，混合物为在 25°C 下孵育 30 分钟。使用UV-2550分光光度计读取PSS-MA-GoldMag的SPR峰波长。

为了评估甘油三酯、胆红素和血红蛋白是否会干扰我们的蛋白质检测系统，制备了 D-二聚体溶液（0 和 3 μg/mL）和 22 mg/mL 甘油三酯、0.2 mg/mL 胆红素和 2 mg/ mL 血红蛋白样品单独加入。将10微升抗D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag加入上述混合物中，使用UV-2550分光光度计读取PSS-MA-GoldMag复合材料的SPR峰波长。

结果与讨论

方案 1 说明了为蛋白质的比色检测粒子的表面改性和功能化而开发的程序。为了研究 PSS-MA 在 PSS-MA-GoldMag 结构上的吸附和掺入，进行了 FTIR 光谱分析、SPR 光谱和 TGA。图 1a 分别显示了纯 PSS-MA、PSS-MA-GoldMag 和 GoldMag 的 FTIR 光谱。 3000–3700 cm ⁻¹ 宽而强的波段 对应于聚合物链中–CO–OH 基团和–SO2–OH 羟基的拉伸[18]。磺酸基的对称振动：(SO3 ⁻ ) 分别为 1037 和 1126 cm ⁻¹ 并且苯的 C =C 的伸缩振动在 1403 和 1637 cm ^-1 [19]。在 PSS-MA-GoldMag 中观察到 PSS-MA 的这些特征吸收带，表明原始颗粒成功地被 PSS-MA 包覆。 GoldMag 表面化学基团的变化通过修饰后 SPR 带中 11 nm 从 555 到 544 nm 的明显蓝移得到证实（图 1b）。 SPR 峰的位置和宽度与纳米颗粒的表面、环境和分散性有关 [20,21,22,23]。 TGA 分析表明有机材料与 GoldMag 的重量比接近 1:4（图 1c）。在低温下，失重可归因于脱水；当温度升高时，失重可能归因于改性颗粒表面有机分子的氧化分解[19, 24]。在改性过程中，CTAB-GoldMag 带正电（+ 12.2 mV），在颗粒表面涂覆 PSS-MA 后，颗粒表面带负电（- 24.5 mV）（图 1d）。以上结果表明PSS-MA成功地附着在纳米粒子表面。

一 金磁性颗粒（GoldMag）表面改性的“整体”过程示意图和聚（4-苯乙烯磺酸-共-马来酸）（PSS-MA）的分子结构示意图。 b D-二聚体与抗体1和2-PSS-MA-GoldMag相互作用以及D-二聚体与抗体1-PSS-MA-GoldMag相互作用示意图

一 PSS-MA、PSS-MA-GoldMag 和 GoldMag 的 FTIR 光谱。 b GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 悬浮在水中的 SPR 光谱。 c GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 的 TGA 分析。 d 修饰引起的zeta电位变化

使用 TEM 获得的 GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 的显微照片（图 2a、b）表明这些颗粒在改性后是单分散的。在高分辨率电子显微图像下，颗粒表面的聚合物层清晰可见，进一步表明 GoldMag 上的聚合物涂层成功（图 2b）。图 2c 显示 PSS-MA-GoldMag 的平均直径为 116 nm。 PSS-MA-GoldMag 悬浮液呈酒红色，表明纳米颗粒具有良好的稳定性（在水中 1 年）。

一 GoldMag 的 TEM 图像。 b PSS-MA-GoldMag 的 TEM 图像。插图显示了聚合物包装的颗粒。 c GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 的尺寸分布。插图为 PSS-MA-GoldMag 溶液的照片，呈红色

用 SPR 光谱分析了 GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 在不同 pH 值的缓冲溶液中光学特性的稳定性 [7]。如图 3a 所示，当 GoldMag 悬浮在 pH 值为 6.0 至 9.0 的硼砂/硼酸盐缓冲液中时，SPR 特征峰从 555 nm 移至更长的波长。缓冲溶液的组成也会影响 GoldMag 悬浮液的稳定性。与去离子水中的那些相比，当 GoldMag 悬浮在 PB 缓冲液（pH 7.4）、硼砂/硼酸盐缓冲液（pH 7.4）和 NaCl 溶液（10 mM）中时，SPR 特征峰的位置移至更高的波长（558 nm） (550 nm)（图 3c）。然而，当 PSS-MA-GoldMag 分散在电解质溶液或不同 pH 值的缓冲溶液中时，特征 SPR 峰 (545 ± 2 nm) 没有显着变化（图 3b、d）。夏等人。和斯托霍夫等人。还报道了纳米粒子的聚集可以使 SPR 光谱转移到更长的波长 [25, 26]。还测量了 GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 的 zeta 电位（图 3e、f）。据报道，低 zeta 电位（小于 ± 30 mV）会导致颗粒团聚 [27, 28]。当 GoldMag 悬浮在 PB 缓冲液 (pH 7.4)、硼砂/硼酸盐缓冲液 (pH 7.4) 和 NaCl 溶液 (10 mM) 中时，GoldMag 的 zeta 电位为 - 16.7 ± 1.1 mV、- 14.3 ± 2.1 mV 和 - 8.9分别为 1.5 mV。当颗粒悬浮在 pH 为 6.0 至 9.0 的硼砂/硼酸盐缓冲液中时，GoldMag 的 zeta 电位为 - 14.2 ± 1.7 mV、- 17 ± 1.1 mV、13.9 ± 1.7 mV 和 - 18.1 ± 1.6 mV。然而，PSS-MA 与 GoldMag 的粘附显着降低了其在不同电解质溶液以及不同 pH 值下的 zeta 电位。在所有情况下，zeta 电位都低于 - 30 mV。这些结果表明，用 PSS-MA 对 GoldMag 进行表面改性显着提高了其对缓冲溶液组成和 pH 值变化的抵抗力，并确保了高水平的分散性 [29]。

一 GoldMag 在硼砂/硼酸盐缓冲液 (0.02 mol/L) 中的 SPR 光谱，不同 pH 值范围为 6.0 至 9.0。 b PSS-MA-GoldMag 在硼砂/硼酸盐缓冲液 (0.02 mol/L) 中的 SPR 光谱，不同 pH 值范围为 6.0 至 9.0。 c GoldMag 悬浮在硼砂/硼酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）、PB 缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）和电解质溶液中的 SPR 光谱。 d PSS-MA-GoldMag 悬浮在硼砂/硼酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）、PB 缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）和电解质溶液中的 SPR 光谱。 e 悬浮在硼砂/硼酸盐缓冲液 (0.02 mol/L) 中的 GoldMag zeta 电位的变化，不同 pH 值范围为 6.0 到 9.0。 f GoldMag悬浮在硼砂/硼酸盐缓冲液（0.02 mol/L，pH 7.4）、PB缓冲液（0.2 mol/L，pH 7.4）和电解质溶液中的zeta电位变化

为了研究蛋白质和 PSS-MA-GoldMag 之间的相互作用，通过 EDC 介导的蛋白质氨基和聚合物羧基之间的反应，将抗 D-二聚体抗体与 PSS-MA-GoldMag 偶联。如图 4a 所示，在 PSS-MA-GoldMag 与抗 D-二聚体抗体反应后观察到 SPR 峰的红移，这表明抗体在纳米颗粒上的结合 [30, 31]。颗粒平均直径从 116 nm 增加到 130 nm，证实了抗 D-二聚体抗体被引入 PSS-MA-GoldMag（图 4b）[24]。在向 PSS-MA-GoldMag 悬浮液中加入不同量的抗 D-二聚体抗体（20 至 200 μg）后，通过 SPR 光谱评估抗体质量对 PSS-MA-GoldMag 光学特性的影响。如图 4c 所示，SPR 峰没有改变并保持在 548 ± 3.0 nm，与添加的抗体量无关。

一 PSS-MA-GoldMag 和抗 D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag 的 SPR 光谱。 b 抗体-PSS-MA-GoldMag 和 PSS-MA-GoldMag 的大小分布。 c 颗粒的SPR峰不随抗体浓度的增加而变化

为了评估在 PSS-MA-GoldMag 上缀合后的抗体活性，通过将一对抗体（抗体 1 和抗体 2）和抗体 1 固定在 PSS-MA-GoldMag 上来制备探针 A 和探针 B，分别。通过SPR光谱分析了两种类型的探针和D-二聚体之间的相互作用。通过在探针 A 中加入三种浓度的 D-二聚体（0.6、2 和 6 μg/mL）后，观察 SPR 峰最大值的变化 40 分钟获得最佳反应时间。如图 5a 所示，随着时间的推移，通过抗原-抗体夹心桥之间的交联，PSS-MA-GoldMag 的聚集导致了表面等离子体带的显着变化。在低浓度 (0.6 μg/mL) 下，SPR 光谱从 20 分钟到 40 分钟没有显着变化，表明 20 分钟足以反应 0.6 μg/mL 或更低浓度的 D-二聚体。然而，使用中高浓度 D-二聚体（2 和 6 微克/毫升），波长持续增加 30 分钟。这表明最佳反应时间是 30 分钟。如图 5b 所示，随着 D-二聚体浓度从 0.3 增加到 6 μg/，复合颗粒的 SPR 光谱显示表面等离子体共振从 λmax =550 到 570 nm 有明显的红移和特征峰的强度降低。毫升。这是由探针 A 上 D-二聚体与抗体 1 和抗体 2 的交叉连接引起的 PSS-MA-GoldMag 的聚集引起的。 PSS-MA-GoldMag 的聚集导致金的光学性质发生变化PSS-MA-GoldMag 的一部分。江等人。和李等人。也有报道称纳米金的聚集可使纳米粒子的SPR 谱发生红移和边界[32, 33]。然而，在图 5d 中没有观察到红移，因为 D-二聚体和抗体 1 之间的相互作用不能导致纳米颗粒的组装。此外，即使添加到探针 A 的 D-二聚体的量低至 0.3 μg/mL，也观察到可区分的红移 (5 nm)，这表明检测限低于诊断临界值 (0.5 μg/mL) 用于该生物标志物。在 0.3–6 μg/mL (r ² =0.9944)（图 5c）。

一 反应时间与 SPR 谱的关系。 b 由于 D-二聚体与探针 A 的交叉连接导致 GoldMag 颗粒聚集导致 SPR 光谱的红移。c 复合材料的 SPR 峰作为 D-二聚体浓度的函数绘制的曲线。 d 添加D-二聚体探针B后复合材料的SPR光谱

如图 6 所示，在分别存在甘油三酯、胆红素和血红蛋白的情况下，PSS-MA-GoldMag 的 SPR 特征峰没有发现显着偏移。该结果表明我们的蛋白质检测系统与甘油三酯、胆红素和血红蛋白没有干扰反应。

抗D-二聚体抗体-PSS-MA-GoldMag在甘油三酯、胆红素和血红蛋白存在和不存在下与D-二聚体样品反应后的SPR谱

这些结果表明 PSS-MA-GoldMag 是一种很有前途的用于蛋白质固定的磁性纳米颗粒，并且可以通过抗体 1-目标蛋白-抗体 2 在颗粒表面形成夹心桥。 这使得 PSS-MA-GoldMag 作为一种有用的材料生物标志物的床旁光学检测。

在本研究中，PSS-MA 首次用于 GoldMag 的修饰（方案 1）。在 GoldMag 表面引入 PSS-MA 显着提高了其在缓冲溶液中的稳定性。除了由 PSS-MA 的长聚合物链引起的空间位阻之外，PSS-MA 中的羧基和磺基还会引起纳米颗粒之间的静电排斥 [29]。这显着增强了 PSS-MA-GoldMag 的稳定性。颗粒表面的大量羧基满足与生物分子结合的要求。

结论

在本研究中，报告了一种用 PSS-MA 涂覆 GoldMag 的简单快速的方法。结果表明，PSS-MA的引入显着提高了GoldMag的胶体稳定性和分散性。该颗粒在宽 pH 范围的缓冲溶液中表现出良好的稳定性。此外，羧基的存在提供了将蛋白质结合到纳米颗粒的选择。以D-二聚体及其抗体为模型，发现可以通过抗原与抗体-纳米颗粒复合物之间的交联来定制光学特性。结果表明，PSS-MA修饰的GoldMag可以作为基于免疫测定的光学检测的非常有前景的候选物。

缩写

DLS：

动态光散射

FTIR：

傅里叶变换红外光谱

GoldMag：

金磁性纳米粒子

MUA：

11-巯基十一烷酸

PEI：

聚乙烯亚胺

PSS：

聚苯乙烯磺酸盐

PSS-MA：

聚(4-苯乙烯磺酸-共-马来酸)

SPR：

表面等离子体共振

TEM：

透射电子显微镜

TGA：

热重分析仪