靶向癌症递送：用 pHLIP 修饰纳米囊泡识别酸性肿瘤微环境

摘要

癌细胞表面的酸性是肿瘤微环境的标志，不依赖于肿瘤灌注，可作为靶向肿瘤细胞的通用生物标志物。我们用 pH（低）插入肽（pHLIP）修饰脂质体和嚼合物。pHLIP 感知癌细胞表面 pH 并插入靶细胞膜，将纳米材料带至细胞膜近旁。全面表征了含/不含 pHLIP 涂层的 DMPC 脂质体和 Tween 20 或 Span 20 嚼合物，以获取纳米载体基本特性并促进酸敏感性纳米载体的合理设计。证实了样品随时间和血清中稳定性。研究了纳米载体的尺寸、ζ 电位、形态、亲水探针封装能力及释放调控。pHLIP 修饰囊泡可用于实现生物活性物质的延长（调控）释放，以靶向肿瘤和其他酸性病变组织。

引言

约百年前，Paul Ehrlich 提出“魔弹”概念，实现药物特异性高效递送。“魔弹”应能保护药物免受恶劣环境侵害，通过靶向病变组织减少副作用，改善药物药代动力学和药效学，调控药物释放。

1965 年 Bangham 首次观察到磷脂囊泡，随后 Gregory Gregoriadis 确立脂质体可包裹药物作为药物递送系统的概念。脂质体由磷脂闭合双分子层组成，疏水脂肪酸链夹在两亲水头部层间。闭合双层包裹水相核心，分别实现亲脂或亲水药物定位。

脂质体尺寸是影响给药后载体命运的关键参数，涉及血浆蛋白吸收、网状内皮系统（RES）识别、循环半衰期和细胞运输。纳米级载体有利于细胞内化和肿瘤靶向，许多研究聚焦“纳米化”。

为获得更通用、经济的纳米载体，合成表面活性剂被用于制备类脂质体药物递送系统。非离子表面活性剂广泛用于此目的，能自组装成单层或多层囊泡（非离子脂质体、嚼合物）。山梨醇酯表面活性剂（Span®）是制备嚼合物常用的亲脂物质。为延长囊泡循环时间获“隐形”纳米载体，聚乙二醇（PEG）修饰是金标准：通过此偶联获得聚氧乙烯山梨醇酯表面活性剂（Tween®）。Span 和 Tween 具有不同亲水亲油平衡（HLB）值，选择表面活性剂可制备所需性质的嚼合物。此外，添加胆固醇可通过拉伸表面活性剂尾部增强双层稳定性，影响凝胶-液相转变温度，赋予疏水双层刚性。“优化”纳米载体旨在改善制剂和/或增强靶向。

当今癌症是全球主要死因之一。当前治疗手段存在药物递送至肿瘤低效、缺乏肿瘤靶向导致严重副作用等局限，纳米技术有望克服。

目前各种靶向方法在开发中，多基于靶向癌细胞表面过表达的特定生物标志物。但人类肿瘤高度异质，更通用的肿瘤靶向方法更有优势。癌细胞表面酸性是肿瘤微环境标志，不依赖肿瘤灌注，可作为靶向肿瘤细胞的通用生物标志物。pH（低）插入肽（pHLIP）技术正快速发展，用于靶向成像和治疗小分子及纳米材料至肿瘤。pHLIP 感知癌细胞表面 pH 并插入靶细胞膜。pHLIP 插入机制由低 pH（pH<7.0）下肽中负电荷残基质子化触发，增加肽疏水性，使平衡向肽分配入双分子层转移。pHLIP 修饰纳米载体生物相容、能靶向肿瘤、展示癌细胞增强摄取。研究的 pHLIP 涂层纳米颗粒包括脂质、聚合物、金属基纳米材料。

本工作旨在全面表征 pHLIP 修饰的囊泡纳米载体，获取纳米载体基本特性，促进酸敏感性纳米载体合理设计。

材料与方法

材料

聚氧乙烯山梨醇酯单月桂酸酯（Tween 20）、山梨醇单月桂酸酯（Span 20）、胆固醇（Chol）、Hepes 酸盐 {N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙烷磺酸)}、人血清、Sephadex G-75、钙黄绿素、二苯基六三烯（DPH）购自 Sigma-Aldrich。1,2-二肉酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）和 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[4-(对马来酰苯基)丁酰胺]钠盐（DSPE-马来酰亚胺）购自 Avanti Polar Lipids，芘购自 Fluka。pHLIP 肽（ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT）由 CS Bio 合成纯化。所有其他产品试剂均为分析纯。

DSPE-pHLIP 合成

pHLIP 与 DSPE 脂质在甲醇中共价偶联：DSPE-马来酰亚胺与 pHLIP N 末端单一半胱氨酸残基反应，按文献方法进行。简述：5 mg 肽溶于 250 μL 甲醇（吹氩气），DSPE-马来酰亚胺（9.9 mM 储备液）溶于氯仿，按 1:1 摩尔比混合。室温反应 2-6 小时至完成。用 RP-HPLC 监测反应进程（乙腈水梯度 25-80%，含 0.05% TFA），监测未标记 pHLIP 峰下降。合成构建体经 SELDI-TOF 质谱表征。用 pHLIP 摩尔消光系数 ε₂₈₀=13,940 M⁻¹cm⁻¹ 经吸光度测定 DSPE-pHLIP 浓度。

囊泡制备与纯化

采用薄膜水化法制备非离子表面活性剂（Tween 20 或 Span 20）和磷脂（DMPC）囊泡，含/不含 pHLIP。各配方中胆固醇按不同摩尔比添加（表 1）。样品组成经优化，选用先前表征良好的结构，添加相同量 pHLIP。

亲脂成分先溶于 CHCl₃:CH₃OH（3:1），不同温度下真空旋干除溶剂。所得薄膜用 5 mL Hepes 缓冲液（0.01 M pH 7.4）或钙黄绿素钠溶液（10⁻² M）水化。涡旋混合约 5 分钟，随后超声处理（见附件表 S1）用 20 kHz 微探头（VibraCell-VCX 400-Sonics）。DMPC 脂质体超声在惰性气氛下防氧化。

囊泡悬浮液经 Sephadex G-75 胶渗层析纯化（玻璃柱 50×1.2 cm，Hepes 缓冲液洗脱），再经适当孔径纤维素滤膜过滤。pHLIP 涂层嚼合物和脂质体用同法制备。

动态光散射测量

25 °C 用动态光散射（DLS，Malvern NanoZetaSizer ZS90，5 mW HeNe 激光 λ=632.8 nm，数字相关器）测囊泡平均尺寸和分布。90° 散射光强自相关函数经 Contin 算法分析得颗粒扩散系数 D 分布，进而通过 Stokes-Einstein 关系 R_H = k_B T / 6πηD 得有效水动力学半径 R_H 分布。嚼合物/脂质体尺寸分布宽度虽小但非无视。表 2 报告值为颗粒强度加权平均水动力学直径。

ζ 电位测量

用激光多普勒电泳技术（Malvern NanoZetaSizer ZS90）测电泳迁移率，用 Smoluchowski 关系 ζ = uη/ε 换算 ζ 电位，η 和 ε 为溶剂相粘度和介电常数。

小角 X 射线散射

小角 X 射线散射（SAXS）在欧洲同步辐射装置（ESRF，法国格勒诺布尔）ID02 高亮度束线进行。动量转移区间 0.1 nm⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm⁻¹，q = (4π/λ)sin(θ/2)，θ 为散射角，λ=0.1 nm X 射线波长。对应研究长度尺度 1-60 nm，适合探测溶液中嚼合物/脂质体内部结构。所有实验 25 °C、短照射时间 0.1 s 防辐射损伤。每样品在不同散射角捕获散射强度，经二维探测器角度重组、扣除背景和溶剂贡献，分析得囊泡形状和内部结构信息。

单层囊泡闭合双层建模为三个同心壳层：外头部、疏水链、内头部。假设囊泡尺寸符合 Schulz 分布。

冷冻透射电镜

囊泡溶液（5 μL 滴）置于 Lacey 碳膜/碳电镜网格，液态乙烷快速冷冻保持玻璃态水合状态。FEI Vitrobot 系统玻璃化设置：单次吸干 3 s，偏移 1，排水等待 1 s。透射电镜（JEOL 2100，200 kV，×10,000-×150,000 放大）成像囊泡。

稳定性研究

含/不含 pHLIP 的嚼合物和脂质体在 25 °C 和 4 °C 两种储存温度下进行物理稳定性研究，评估 90 天内尺寸和 ζ 电位是否显著变化。每批次在 1、30、60、90 天取样测定尺寸和 ζ 电位。

同样在生物流体（人血清）中研究稳定性。悬浮液与 45% 人血清接触，37 °C。0、30 min、1 h、2 h、3 h 测定尺寸和 ζ 电位变化。

双层表征

用荧光探针二苯基六三烯（DPH）和芘分别探测嚼合物/脂质体双层流动性和微粘度-极性，两探针均定位于双层疏水区。制备前将 DPH（2 mM）和芘（4 mM，220 μL 和 2.5 mg）加入表面活性剂或磷脂/胆固醇混合物。制备后芘负载囊泡按上述纯化，DPH 负载囊泡经逐级减小孔径（5.0 至 0.22 μm）滤膜过滤。

室温用荧光光谱仪（LS55, PerkinElmer）测荧光各向异性，λ_ex=400 nm，λ_em=425 nm，按公式计算荧光各向异性（A）：

$$ A = \frac{I_{vv} - I_{vh} \times G}{I_{vv} + 2 I_{vh} \times G} $$

其中 I_vv 和 I_vh 为垂直偏振激发光方向平行和垂直的发射荧光强度。校正因子 G = I_hv / I_hh 为水平偏振激发时垂直/水平发射分量比。荧光各向异性值与膜流动性成反比。高各向异性值对应高结构有序和/或低膜流动性。

为评估囊泡双层微粘度和微极性，用荧光光谱仪（Perkin-Elmer LS55，λ_ex=330 nm，记录 350<λ_em<550 nm 发射光谱）进行芘荧光实验。芘荧光精细结构呈五峰。第一（372 nm）和第三（382 nm）振动带强度比 I₁/I₃ 与芘环境极性相关：低 I₁/I₃ 对应非极性环境。芘分子在双层中可形成分子内激发态二聚体，此过程对探针微环境粘度敏感。因此激发态二聚体/单体荧光强度比 I_E/I_M 与微粘度相关。

这些研究在含/不含 pHLIP 的囊泡上进行，结果对比。

钙黄绿素释放研究

非离子表面活性剂或磷脂囊泡负载 10⁻² M 钙黄绿素。此浓度下钙黄绿素荧光自猝灭。去猝灭测量用于确定囊泡水相核心钙黄绿素释放。制备时加入 5 mL 钙黄绿素水溶液水化薄膜负载探针。囊泡悬浮液经胶渗层析纯化，接触 45% 人血清或 Hepes，装入透析袋（截留分子量 8000 Da, Spectra/Por®）。释放实验在 37 °C、磁力搅拌下进行，外相为 Hepes 缓冲液（10 mM, pH 7.4）。0-24 h 不同时间取外相等分试样，间歇性回补系统。用荧光光谱仪（Perkin-Elmer LS50B，λ_ex=492, λ_em=520 nm）监测外相荧光确定钙黄绿素释放。参考值 F_∞（任意单位，关联囊泡内总钙黄绿素量）用异丙醇（1:1 v/v）破坏囊泡后测定。各时间点释放百分比（F%）按公式计算：

$$ F\% = \frac{F_t}{F_{\infty}} \times 100 $$

其中 F_t 为特定时间点 t 读取的荧光值。

统计分析

单因素方差分析（ANOVA）用于统计分析。事后 Bonferroni t 检验评估 ANOVA 显著性。p<0.05 为统计学显著。结果为三次实验平均值 ± 标准差。

结果与讨论

含/不含 DSPE-pHLIP 的 Tween20、Span20、DMPC 囊泡表征尺寸和 ζ 电位（表 2）。

表 2 结果显示，无论 pHLIP 是否存在，分析样品在尺寸和 ζ 电位上均无显著差异。

上述尺寸范围经冷冻透射电镜（图 1）不同技术确认。

pHLIP 涂层嚼合物和脂质体代表性冷冻透射电镜图像。a NioSpan20-pHLIP 嚼合物（×10,000）；b LipoDMPC-pHLIP 脂质体（×10,000）；c LipoDMPC-pHLIP 脂质体（×40,000）

含/不含 DSPE-pHLIP 的嚼合物/囊泡内部结构经 SAXS 实验确定。图 2 SAXS 强度谱不同，表明各体系各有特征。

SAXS 谱。无 DSPE-pHLIP（黑空心符号）和有 DSPE-pHLIP（彩色符号）的嚼合物/囊泡强度谱

Tween20 基嚼合物为单层，DMPC 囊泡显示一定多层性（如脂质体），特征峰 q≈1 nm⁻¹ 对应层间距 6 nm（约 5 nm 脂质双层 + 1 nm 水）。Span20 基囊泡确为多层，特征峰 q=1.6 nm⁻¹ 对应层间距 3.8 nm，匹配 Span20 分子长度两倍。结果表明 Span20 囊泡多层壳由相邻双层组成，几乎无层间水。

DSPE-pHLIP 存在（<1% 摩尔分数）不显著影响体系。所有 q 范围散射强度相似，表明结构物质分数和囊泡颗粒整体尺寸相当。

DMPC 基囊泡脂质体内双层数略有增加，从 q=1 nm⁻¹ 布拉格峰强度增加可推断。插入少量连接肽的 DSPE C18 链不改变脂质双层厚度，主要由相对 DMPC 的大量胆固醇（约 40-50%）决定。此胆固醇浓度下脂质链处于液态有序（Lo）相，特征为链侧向位置有序弱、链轴向取向有序强，能容纳少量 C18 链而无结构变化。Span20 基多层囊泡内部结构亦无变化。

Tween20+pHLIP 体系存在少量胆固醇微晶，特征尖峰 q=1.84 nm⁻¹（特征距离 3.41 nm），囊泡结构不受影响。少量微晶常见于 Tween 基嚼合物，量取决于组成、制备、纯化程序。图 2 中 Tween20 和 Tween20+pHLIP 两实验谱与拟合曲线同显，拟合模型为球形闭合双层三同心壳：外头部、链、内头部。拟合平均囊泡尺寸约 168 nm，与 DLS 结果一致。两闭合双层结构参数相同（见附件图 S1 和表 S2），除外壳：有 DSPE-pHLIP 时外壳电子密度轻微降低 5%（0.42 至 0.40 e/ų），层粗糙度增加。这表明 DSPE-pHLIP 主要影响囊泡外壳。符合 DSPE C18 链插入双层锚定肽于囊泡表面、在伸展分支的聚乙二醇头部间的图像。注：pHLIP 肽本身（非连接脂质）在高 pH 与不饱和磷脂双层囊泡外表面相互作用、低 pH 插入双层，近期用 SAXS 观察到。本研究肽摩尔分数显著更低且连接脂质，目标设计 pHLIP 涂层 pH 敏感药物纳米载体。pHLIP 结合由共价连接的 DSPE C18 链疏水插入纳米载体疏水区驱动。pHLIP 肽锚定于外头部区域，倾向于酸性 pH 下与靶膜相互作用和/或在低 pH 环境双层重排后释放纳米载体内容物。

为研究 pHLIP 是否影响双层微流变性质（流动性、微粘度、极性），进行疏水壳表征。用荧光探针芘在制备初期加入样品。因亲脂性，芘插入囊泡双层提供膜环境极性和微粘度信息。

表 3 显示，三组样品中极性值在有 pHLIP 时仅轻微下降，而微粘度值在所有囊泡中均三倍增加。

双层进一步用掺入脂质的另一疏水荧光探针 DPH 荧光各向异性测量表征。这些测量反映探针在双层中运动和取向，给出双层流动性信息，可影响囊泡释放能力。荧光各向异性值与膜流动性成反比。高各向异性值对应高结构有序和/或低膜流动性，如液态有序相。

各样品各向异性值见表 3。数据显示 DSPE-pHLIP 存在降低荧光各向异性，即增加膜流动性。双层流动性不仅受非极性链有序和侧向组织影响，也受极性头部影响。三体系 SAXS 结果显示 DSPE-pHLIP 分子主要影响头部区域，最终导致极性头部不同堆积。结构结果似与两探针揭示的 DSPE-pHLIP 存在下双层微流变性质吻合。芘揭示微粘度增加（芘 log P=4.88 可插入近外区）。DPH 假定嵌入双层核心，平行于脂质酰基链轴或受限于双层中心平行于表面，主要敏感于两亲分子酰基链角度重取向。DPH 揭示的流动性增加可能与 DSPE 链插入其他酰基链及 pHLIP 在极性头部区域分配改变表面活性剂堆积性质有关（图 3）。

pHLIP 与囊泡膜相互作用示意图

对制备样品进行进一步表征。所有含/不含 pHLIP 样品在 4 °C 储存 90 天评估随时间稳定性，测尺寸和 ζ 电位变化（附件图 S2）。实验全程未观察到尺寸和 ζ 电位显著变化；因此所有制备样品在 4 °C 储存稳定。

此外，在 90%（v/v）人血清、37 °C 下 3 h 检查样品稳定性（附件图 S3）。

接触人血清后，Tween20 囊泡尺寸增加但保持 300 nm 以下。3 h 实验中尺寸和 PDI 值恒定，表明悬浮囊泡全程完整。

含/不含 pHLIP 的 Span20 样品接触血清均显示尺寸增加，pHLIP 制备增幅更大，PDI 值提示尺寸分布均一（数据未显）。这可能因血浆蛋白静电吸附于嚼合物表面，但未导致囊泡破坏。ζ 电位接触血清后下降支持此假设。当 ζ 电位达中性附近微负值时系统不稳定，囊泡开始聚集。

DMPC 囊泡同样显示接触血清后尺寸增加，但变化非显著，尺寸维持 280 nm 以下（DMPC）或 240 nm 以下（DMPC+pHLIP）。

评估含/不含 pHLIP 样品释放能力，随时间测定囊泡释放钙黄绿素（亲水探针）量。

研究在 37 °C、24 h 进行，纯化样品暴露于 HEPES 缓冲液或人血清。图 4 显示，Tween20 和 Tween20-pHLIP 在 HEPES 缓冲液或人血清中钙黄绿素释放曲线极相似。

钙黄绿素释放曲线。NioTween20 和 NioTween20-pHLIP 接触 HEPES 缓冲液（a）或人血清（b）

释放钙黄绿素量在 30-50% 间，含/不含 pHLIP 样品释放能力无差异。

Span 和 DMPC 样品得相同结果（数据未显）。

不同刺激响应纳米载体（如热敏立方体、聚合物自组装纳米载体）报道了可比释放曲线。

总之，含/不含 pHLIP 样品在微粘度和流动性上的理化差异（表 3）不影响其释放能力（图 4），符合 DSPE-pHLIP 分子主要影响头部区域的证据。这些数据与先前结果一致：中性和高 pH 下 pHLIP 结合于 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）脂质体表面，不诱导融合或膜泄漏。

结论

本研究证实制备 pHLIP 修饰囊泡的可能性。样品在 4 °C 稳定至少 3 个月且血清中稳定。所提纳米载体能封装亲水探针并调控释放。

pHLIP 囊泡全面表征以获取纳米载体基本特性，促进酸敏感性纳米载体合理设计。

pHLIP 结合由共价连接的 DSPE C18 链疏水插入纳米载体疏水区驱动。pHLIP 肽锚定于外头部区域，倾向于酸性 pH 下与靶膜相互作用和/或在低 pH 环境双层重排后释放纳米载体内容物。

根据这些发现，所提 pHLIP 修饰囊泡可用于实现生物活性物质的延长（调控）释放，以靶向肿瘤和其他酸性病变组织。

缩略语

Chol:

胆固醇

Cryo-TEM:

冷冻透射电子显微镜

DLS:

动态光散射

DMPC:

1,2-二肉酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱

DPH:

二苯基六三烯

pHLIP:

pH（低）插入肽

SAXS:

小角 X 射线散射

Span20:

山梨醇单月桂酸酯

Tween20:

聚氧乙烯山梨醇酯单月桂酸酯