聚合物胶束递送齐墩果酸：增强溶解度与抗皱功效验证

摘要

齐墩果酸长期仅作为化妆品辅助成分使用。本研究旨在证实齐墩果酸作为活性成分对人类皱纹的缓解效果，并开发聚合物胶束制剂，使难溶性齐墩果酸能作为化妆品主成分用于抗皱。评估了齐墩果酸在增溶剂、表面活性剂和聚合物中的溶解度；利用电泳光散射分光光度计和扫描电子低温显微镜评价含齐墩果酸聚合物胶束的粒径和形貌；通过HPLC测定包封效率和皮肤渗透量；通过目视观察、粒径测定和含量测定评估40°C贮存3个月的聚合物胶束稳定性；将终产品安瓿形式的聚合物胶束涂抹于23名女性受试者眼周8周，每4周用光学轮廓仪评价5项皮肤参数；专业人员进行皮肤目视观察并开展人体皮肤刺激性研究。利用Capryol 90®和聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物制得粒径<100 nm的齐墩果酸聚合物胶束。胶束中齐墩果酸皮肤渗透率高于两种表面活性剂分散液。40°C贮存3个月无显著粒径、颜色、含量变化，无相分离。8周使用后未出现皮肤刺激，光学轮廓仪评价的5项参数及目视评价评分均显著改善。研究表明制备的齐墩果酸聚合物胶束稳定且作为主要活性成分能有效缓解人类皱纹。预期齐墩果酸聚合物胶束可广泛应用于化妆品领域。

引言

皮肤老化包括松弛、变薄和皱纹，可因感染、吸烟、紫外线、创伤、激素失衡、压力及水解酶(如弹性蛋白酶、胶原酶)等促氧化剂加速[1]。上述因素产生活性氧或自由基损伤邻近细胞，降低皮肤弹性和变薄[2,3]。特别是紫外线触发生成活性氧，损伤膜脂质、细胞蛋白和DNA，加速表情纹、雀斑、黄褐斑形成[1-4]。齐墩果酸是从多种植物提取的天然有效成分，也是水果如苹果、梨中含有[5]。作为羟基五环三萜类，齐墩果酸最早从橄榄叶分离，广泛存在于东亚瑞香、黄秦艽等植物中。它通过促进前胶原(胶原合成关键)、神经酰胺、filaggrin合成，抑制分解胶原等蛋白的MMP-1活性，发挥抗衰老功能[5,6]。因此齐墩果酸具有双重抗衰老效应：促进胶原生成并防止胶原降解[7]，是极具前景的化妆品抗衰老成分。然而，其水溶性差限制作为主成分应用，仅少量作为乳化制剂辅助成分使用[8]。其理化性质(熔点>300°C、高结晶性、分子量、分配系数、亲水性)影响皮肤吸收[9-11]。高结晶材料溶解需更大能量、生物利用度低、吸收差。改善此类分子皮肤渗透常用前体合成或胶体药物载体，如脂质体、乳剂、聚合物胶束[12]。

聚合物胶束是水溶液中自组装形成核壳结构的纳米级聚集体，常由双嵌段或三嵌段共聚物形成疏水内核和亲水外壳[13,14]。因嵌段共聚物单体种类和比例可调、临界胶束浓度低，聚合物胶束比表面活性剂胶束物理稳定性更好[15,16]。

本研究制备齐墩果酸聚合物胶束，评价粒径、形貌、包封效率、皮肤渗透率，考察3个月物理稳定性，并开展人体抗皱临床试验。

材料与方法

材料

齐墩果酸、Tween 80/20/60购自TCI(日本)；PEG 400、Pluronic F127/F68购自BASF(德国)；丙二醇、PEG 300/200购自JUNSEI(日本)；TRANSCUTOL P、LABRASOL、LAUROGLYCOL FCC、LABRAFAC、Capryol® 90、Capryol™ PGMC购自Gattefossé(法国)；其他试剂均为EP/GR级。实验用Crlori:SKH1-hr无毛雌性小鼠购自OrientBio(韩国)。

HPLC分析

采用Shimadzu LC-30系列HPLC(日本)，Kromasil 100 C18色谱柱(250 mm × 4.6 mm, 5 μm)，流动相乙腈:水=85:15(v/v)，流速1 mL/min，进样量10 μL，UV λ=210 nm检测齐墩果酸[17]。

溶解度与制剂优化研究

定量齐墩果酸加入增溶剂，60°C搅拌48 h并超声5 min，2000 rpm离心取上清液，0.45 μm PVDF膜过滤，以初始总重减去剩余固体重估算溶解度(表1)。制剂优化筛选聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物188/407、Tween 60/80，尝试不同比例(表2)。齐墩果酸和Capryol® 90加热搅拌至澄清，加入聚合物/表面活性剂继续搅拌至澄清，分散于蒸馏水(图1)。静置约48 h目视检查选择最优配方，观察沉淀、分层、透明度、凝胶化结果汇总表3。

齐墩果酸聚合物胶束制备

按表2配方G、H制备聚合物胶束(PMO-G、PMO-H)，PMO-H用于临床试验化妆品产品。

染色测试

配方G或H分散水中胶束化通过透明度目视确认。亚甲蓝加入水/Capryol® 90混合物、水、Capryol® 90、PMO-G、PMO-H中，目视观察颜色变化确认PMO形成。

粒径测定

采用电泳光散射(ELS)技术测量粒子电泳迁移率[18]，用ELS-Z电泳光散射分光光度计(日本Otsuka Electronics)评价PMO-G和PMO-H粒径。

扫描电子低温显微镜(Cryo-SEM)分析

利用快速冷冻固定微观结构、断裂成像的Cryo-SEM(捷克Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T)观察PMO形貌。

包封效率

PMO离心2000 rpm 15 min取上清液HPLC分析，包封效率=胶束中齐墩果酸量/初始添加量×100%。

PMO-H稳定性

PMO-H在40°C加速稳定性条件下贮存3个月，目视评价颜色、分层、沉淀、浑浊度；定期HPLC测定齐墩果酸残留量、ELS-Z测定粒径变化(图9)。

体外皮肤渗透实验

采用Franz扩散池，以6周龄无毛雌性小鼠皮肤为膜，角质层朝上。供体室加330 μL制剂，受体室装PBS(pH 7.4):乙醇=9:1(v/v)，定时取样HPLC分析。24 h后清除皮肤残留制剂，测定皮肤内残留齐墩果酸。实验三次重复。

统计分析

实验独立三次重复，结果以mean±SD表示，独立t检验，p<0.05为显著差异。

含PMO-H安瓿制备

临床试验用PMO-H为测试产品。PMO-H、纯水、EDTA-2Na、尿囊素、二丙二醇、丙二醇、卡波姆、PEG/PPG/聚丁二醇-8/5/3甘油磁力搅拌10-15 min，加氢氧化钾继续搅拌5-10 min；均匀后加透明质酸钠、β-葡聚糖搅拌2-5 min；最后加苯氧乙醇、丙二醇、辛甘醇、乙基己基甘油搅拌2-5 min。终配方灌装安瓿，真空干燥箱除气泡。对照品同法制备但不含齐墩果酸。

人体应用测试

人体皮肤刺激性研究

25名22-56岁男女受试者上臂贴敷测试物质24 h，按ICDRG标准于贴敷移除后30 min、24 h、48 h由2名专业人员观察刺激程度。

抗皱临床试验

23名30-65岁有眼周皱纹女性受试者，双盲法，随机将测试产品(PMO-H安瓿)和对照品分涂面部左右两侧，8周每4周评价。光学轮廓仪(Skin Visiometer SV 700)测5参数：平均粗糙度(R3)为主要终点，皮肤粗糙度(R1)、最大粗糙度(R2)、平滑深度(R4)、算术平均粗糙度(R5)为次要终点。专业人员目视评价并拍照(Janus 1 Mark II)。配对样本t检验，95%可靠度[20-25]。

结果与讨论

增溶剂、表面活性剂、聚合物筛选

齐墩果酸在生物相容性增溶剂中溶解度见表1。倾向溶于低HLB疏水油类。Capryol® 90 HLB值略高于普通油[26]，但齐墩果酸在其溶解度较高，且易稳定为胶束内核[27]。选定Capryol® 90后筛选表面活性剂/聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物作壳层[27-30]。表2配方稀释水后即时透明，但24 h内部分出现沉淀、分层、凝胶化(图2)。配方G、H 24 h后保持透明液态；配方I虽透明但呈凝胶；配方A-D 24 h后浑浊沉淀。故选G、H进一步开发。

齐墩果酸聚合物胶束特性

染色测试研究胶束结构(图3)。Capryol® 90/水混合物明显分层；Capryol® 90中亚甲蓝沉淀；水变深蓝；PMO-G和PMO-H变蓝，表明胶束由油相内核和水相外壳组成。聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物407作为外壳，成功包封含齐墩果酸的Capryol® 90内核形成胶束[31]。

粒径、分布、形貌可预测胶束制剂物理稳定性。PMO-G平均粒径80.4 nm，PMO-H 57 nm(图4)。PMO-A、G、H粒径分布直方图对比(图5)：PMO-A因沉淀浑浊，粒径>100 nm且分布宽；PMO-G、H透明，PMO-H分布更窄、流动性更适合化妆品。PMO-G和PMO-H包封效率均99-100%，几乎100%齐墩果酸封入内核(图6)。

Cryo-SEM显示PMO-G和PMO-H均为球形胶束，但PMO-H粒径形貌更一致(图7)。

PMO体外皮肤渗透研究

用6周龄无毛雌性小鼠皮肤，比较PMO-G、PMO-H、齐墩果酸+Tween 80水分散液(OTw)、齐墩果酸+丙二醇水分散液(OPG)渗透效率。24 h累计渗透量：PMO-H 29.49±4.00%、PMO-G 21.39±5.91%、OTw 13.66±0.81%、OPG 5.90±2.47%(图8)。PMO-G/H首次检出时间8 h，OTw 10 h，OPG 20 h。皮肤残留量：PMO-H 56.22±13.50%、PMO-G 36.74±0.72%、OTw 27.44±7.02%、OPG 26.28±5.42%。PMO-H渗透量和皮肤残留量均最高，表明胶束制剂渗透更快、更多。

液态齐墩果酸聚合物胶束稳定性

基于表征和渗透研究选定PMO-H制备安瓿。40°C/75% RH加速条件贮存3个月评价稳定性。PMO-H 3个月内保持透明、无沉淀分层、颜色不变。HPLC测定齐墩果酸比例维持>98%，粒径从55.3±6.5 nm微降至49.6±5 nm基本恒定(图9)。证明PMO-H在加速条件下理化性质稳定3个月。

临床试验

人体刺激性测试

25名22-56岁健康志愿者上臂贴敷测试产品24 h，移除后30 min、24 h、48 h测刺激指数。含PMO-H化妆品安瓿配方在1 h和48 h均未观察到刺激。

临床试验结果

23名30-65岁女性受试者(排除3例脱落，20例完成)分涂测试品(PMO-H安瓿)和对照品面部左右两侧8周。5参数评价：主要终点R3，次要终点R1、R2、R4、R5，目视评价分为额外次要终点(表4)。

主要终点R3：测试品用4周下降0.673%，8周显著下降7.835%(p=0.006)；对照组4周上升5.127%，8周显著上升9.971%(p=0.010)。测试品与对照组R3差异8周显著(p=0.000)，4周不显著(图10)。

次要终点R1：测试品4周下降4.629%，8周显著下降9.973%(p=0.017)；对照组4周上升8.037%，8周上升4.799%。差异8周显著(p=0.024)。R2：测试品4周下降1.048%，8周下降5.803%；对照组4周上升7.261%，8周上升9.536%。差异8周显著(p=0.016)。R4：测试品4周显著下降8.594%(p=0.039)，8周下降9.747%；对照组4周上升10.764%，8周上升3.491%。差异4周显著(p=0.008)，8周不显著。R5：测试品4周下降6.333%，8周下降8.556%；差异4周和8周均不显著。

目视评价：测试品4周评分下降2.917%，8周显著下降8.333%(p=0.034)；对照组4周上升1.667%，8周上升4.167%。差异8周显著(p=0.046)。

综上，眼周皱纹区分析显示：主要终点R3测试品与对照组差异8周显著；所有次要终点测试品组下降、对照组上升；R4差异4周显著，R1、R2差异8周显著(图11)；专业人员目视评价所有平均评分测试品组4周和8周均低于对照组(表5)，差异8周显著(图12)。总体而言，含PMO-H为主要成分的化妆品配方8周使用有助于改善皱纹(图13)。

结论

表面活性剂常用于化妆品增溶难溶物质，但用量有限：需足量溶解防沉淀，又要最小量保安全。胶束制剂可解决此矛盾。本研究开发的齐墩果酸聚合物胶束以最少表面活性剂提高溶解度，增强皮肤渗透。利用Capryol 90和聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物制得稳定胶束，40°C 3个月无沉淀、分层、降解。临床试验证实，作为主要活性成分，胶束制剂中齐墩果酸对人类皱纹有效缓解。结论：水溶性差无法以原生形式作为抗皱主要成分的齐墩果酸，可制成适用的聚合物胶束。预期本研究开发的齐墩果酸聚合物胶束对缓解人类皱纹极具应用价值，将广泛用于化妆品领域。