纳米颗粒生物医学毒性：活性氧（ROS）影响机制综述

摘要

纳米颗粒独特的理化特性使其在生物医学等多领域备受关注。但其潜在毒理学效应令人担忧，因纳米颗粒易诱导过量活性氧（ROS）产生。强氧化性的过量ROS可损伤生物大分子与细胞器结构，导致蛋白氧化羰基化、脂质过氧化、DNA/RNA断裂、膜结构破坏，进而引发坏死、凋亡甚至诱变。本综述总结纳米颗粒在细胞水平诱导ROS生成的机制与责任因素，解析ROS介导生物毒性的机理，梳理纳米颗粒毒性文献，并提出优化纳米颗粒用于生物医学应用的策略。

引言

纳米颗粒（NPs）是尺寸<100 nm的新型合成颗粒。其形状、尺寸赋予独特理化性质与功能。NPs广泛用于纺织、化妆品、水净化、食品包装等消费品[1,2]，也用于光催化、能源、光电工程[3-6]。

生物医学领域更是NPs应用热土：生物传感器、siRNA递送、靶向基因敲低、药物递送、生物填充材料等[7-11]。新应用不断涌现：如Fe₃O₄-PEG-G5-MMP2@Ce6纳米探针显著抑制胃肿瘤生长[12]；pDNA-PEI-CeO NPs诱导更多肉瘤细胞凋亡[13]；HS-Fe-PEG-HER2 NPs选择性结合肿瘤细胞作为成像剂区分正常/癌变组织[14]；银纳米颗粒（Ag NPs）作为纳米抗生素高效对抗耐药细菌生物膜感染[15]。

尽管应用前景广阔，但越来越多研究揭示NPs对生物体[16,17]和细胞[18,19]的不良影响。NPs毒性潜能取决于尺寸与形状，决定其诱导ROS生成的倾向[20,21]。过量ROS可诱发基因毒性、凋亡、坏死、炎症、纤维化、化生、肥大、致癌等病理后果[18,22,23]。NPs毒性还可上调促炎因子、激活巨噬细胞等炎性细胞，进一步增加ROS[23,24]。NPs暴露诱导的ROS激增可调控细胞功能，严重时致命[17,23,25]。本综述探讨NPs诱导ROS爆发的主要机制，分析NPs细胞毒性主因，总结潜在致病效应。证据充分表明ROS过量产生是NPs生物毒性主因。未来研究应致力于设计低ROS产生的NPs以降低细胞毒性。

NPs在生物医学领域的应用

NPs应用于多种医疗场景，多种新型NPs展现生物医学材料潜力。表1汇总：Nano-C60可作抗癌剂抑制癌细胞增殖（体内外）[26]；ZnO NPs用于骨科/牙科植入填充[38]；TiO₂作抗菌剂、空气水净化、牙科修复体[52-54]。Davaeifar等报道藻蓝蛋白-ZnO纳米棒可降低内源ROS保护细胞[68]。Pacurari等指出SWCNTs可作临床诊断剂与生物工程材料[88]。此外，多种NPs通过诱导ROS爆发作为抗菌剂杀菌（表1）。

NPs在细胞中诱导ROS增加的机制

ROS含氧的化学活性物种，包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子自由基（O₂⁻）、羟基自由基（•OH）[92,93]。主要在内质网（ER）、过氧化物酶体、线粒体等细胞器产生[94]。氧化磷酸化过程中，氧通过线粒体电子传递链（ETC）获电子生成水，部分电子被分子氧捕获生成O₂⁻，进一步转化为H₂O₂和•OH[93]。

生理条件下，ROS是氧代谢自然产物[95]，在多种细胞信号通路中发挥关键作用[96,97]。Dröge和Holmstrom等报道ROS可激活EGF受体、MAPK级联、转录因子AP-1、核因子-κB（NF-κB）等信号级联，参与哺乳动物生长、增殖、分化[98,99]。后续研究证实ROS还调节伤口修复[100]、缺氧生存[101]、细胞内pH稳态[102]、固有免疫[103]。

但NPs暴露后，细胞内ROS可能急剧增加，诱发ROS爆发[20]（表1）。主要机制解释：NPs释放的金属离子损害线粒体呼吸促进ROS过表达[30,104]。

NPs释放的金属离子参与氧化还原循环与化学催化，通过芬顿反应[H₂O₂ + Fe²⁺ → Fe³⁺ + HO⁻ + •OH]或类芬顿反应[Ag⁺ + H₂O₂ + H⁺ = Ag⁺ + •OH + H₂O][23,105,106]。游离金属离子（如Ag⁺）还致细胞酶失活、膜结构破坏[31,107]、电子传递紊乱[108]、氧化还原电位耗竭、线粒体膜电位（MMP）降低[109]，进一步加剧胞内ROS积累。NPs还通过干扰电子传递[32,110]、升高NADP⁺/NADPH比[30]、干扰线粒体功能[18]促进ROS积累。NPs干扰氧化应激相关基因（soxS, soxR, oxyR, ahpC）[58]、抗氧化基因（sod1, gpx1）[111,112]、NADPH生成相关基因（met9）[30]表达，基因表达失稳加速ROS积累。

ROS产生显著依赖NPs特定尺寸与形状[113,114]。如TiO₂ NPs诱导胞内ROS致核酸蛋白损伤[10]；Liao等发现10 nm TiO₂ NPs基因毒性最高、诱导ROS最多[115]。Se NPs诱导ROS产量与直径强相关，81 nm诱导最多[113]。Cho等证实形状强烈影响诱导ROS能力：昼花拟态金属NPs（D-NP）比夜花拟态NPs（N-NP）显著诱导更多ROS，增强杀细胞效应[114]（图1）。

NPs极低浓度即可诱导细胞内ROS爆发（表1），如Nano-C60 1 μg/mL显著增加细胞凋亡[26,27]。多数NPs呈剂量依赖效应，如VO₂ NPs[60,61]、CuO NPs[74,75]。

NPs通过ROS增加导致细胞灾难性后果

NPs入胞常产生不良影响。最主流解释：NPs诱导ROS爆发导致氧化应激细胞毒性。NPs致ROS爆发导致生物大分子氧化修饰、细胞结构损伤、耐药性产生、基因突变、致癌[116,117]。ROS爆发还改变细胞正常生理功能，如触发炎症，最终阻断细胞功能、损害机体[23,118,119]。通常NPs先吸附细胞表面，再穿膜入胞诱导ROS生成[36]。强氧化性ROS对细胞高应激[46]，攻击几乎所有生物大分子：碳水化合物、核酸、不饱和脂肪酸、蛋白/氨基酸、维生素[36,120,121]（图2）。

ROS导致脂质过氧化与膜结构损伤

脂质特别是不饱和脂肪酸是关键胞内大分子，维持细胞膜结构功能。NPs强吸附细胞膜并产生ROS致外膜脂质过氧化。膜脂肪酸组分改变可增加通透性，导致NPs不受控从胞外转运入胞质，损伤进一步加剧[76,122]。胞内NPs诱导新一轮ROS爆发。过载ROS致细胞器膜破裂、内容物泄漏[52,123]、受体失活[124]、乳酸脱氢酶（LDH）释放、不可逆细胞损伤[125]。

ROS攻击蛋白致功能失活

ROS攻击氨基酸疏水残基，导致肽键断裂、干扰蛋白功能[126-128]。羰基化是蛋白氧化损伤特征[129]。羰基化蛋白形成化学不可逆聚集体，不能经蛋白酶体降解，致蛋白功能永久丧失[130,131]。Gurunathan等证实PtNPs增强ROS生成、增加羰基化蛋白，抑制骨肉瘤增殖促进凋亡[132]。燃烧摩擦源纳米颗粒（CFDNPs）在年轻阿尔茨海默病患者大脑积累，可能促进ROS生成致蛋白错误折叠、聚集、纤维化[133]。Pelgrift等显示Mg NPs可能抑制基因转录或直接损伤蛋白[10]。

ROS诱导基因突变

核酸（DNA/RNA）对细胞功能、生长、发育至关重要，其核苷酸易受ROS攻击[134-136]。因低氧化还原电位，ROS可直接与碱基反应修饰[137]。如ROS氧化鸟嘌呤为8-氧鸟嘌呤（8-oxoG）[138]，腺嘌呤为1,2-二氢-2-氧腺嘌呤（2-oxoA）[139]，致DNA损伤[140]。NPs因基因毒性与诱导ROS能力[141]，显著诱导DNA单/双链断裂[142,143]、染色体损伤、非整倍体事件[144]。

NPs诱导ROS过量是细胞基因编码错误、非整倍体、多倍体、诱变激活的主因[145-148]。核苷酸池中鸟嘌呤最脆弱，易被ROS氧化为8-oxoG[149]。DNA中8-oxo-dG升高致碱基错配[150]。A:8-oxoG掺入增加G:C→T:A有害颠换突变率[151,152]。G:C→T:A颠换与G:C→A:T转换比率可量化氧化DNA损伤[153]。

NPs诱导ROS致DNA损伤累积，驱动致突变性[154]、致癌[155]、多药耐药[156,157]、衰老、免疫逃逸[158]。Jin等显示ROS过量显著增加DNA结合转录调节因子基因突变，加速抗生素外排[159]，促进细菌多重耐药[34]。Giannoni等报道线粒体DNA突变随胞内ROS增加，进一步损害ETC复合物I活性致线粒体功能障碍[160,161]。

NPs诱导DNA损伤可抑制氨基酸合成、复制[162]，致p53[163]和Rab51蛋白[82,142]异常累积。DNA损伤可延缓或完全阻滞细胞周期[164]。受损DNA细胞丧失生长增殖能力[165]，最终致死[166]（图3）。

ROS增加诱导细胞损伤与疾病发生

NPs细胞毒性与氧化应激、内源ROS产生、胞内抗氧化池耗竭相关。氧化应激增加致生物大分子氧化损伤，进一步影响细胞正常功能，促成多种疾病发生发展[167]。

NPs致膜损伤增强NPs胞质转运。NPs聚集于溶酶体、线粒体、细胞核，导致灾难性后果[168,169]。报道NPs可降低ATP生成[89]、耗竭谷胱甘肽、诱导蛋白误翻译[170]、破裂溶酶体[171]、抑制核糖体亚基结合tRNA。这些事件表明细胞基本生物过程崩塌，细胞活力显著下降[47]。Singh和Scherz-Shouval等报道NPs诱导ROS破坏细胞骨架功能，激活自噬与凋亡[89]。

NPs经皮肤、肺、肠道等多途径入体（图4a），引发多样毒理学效应与炎症免疫反应[172-174]。如硅NPs致巨噬细胞大量分泌IL-1β致细胞死亡[175]；碳纳米管暴露小鼠肺炎显著增强，激活肺泡巨噬细胞诱导强炎症[176]；豚鼠吸入ZnO NPs致肺损伤，肺总量与活量下降[177-179]。ZnO NPs破坏肺泡上皮屏障致人肺炎症[180]。NPs经肠道吸收致肠黏膜炎症降解[181]。Shubayev等指出Mg NPs以MMP依赖方式降解血脑/血神经屏障增强巨噬细胞向神经系统迁移[182]。吸入碳纳米管小鼠表现免疫抑制、脾脏naive细胞抗体反应抑制[183]。Cd NPs致血单核细胞活力严重下降致免疫缺陷[184]。

除上述病理，高变异ROS水平被确认为多种人类疾病主因。Tretyakova和Liou等显示氧化DNA倾向形成DNA-蛋白偶联物，在心脑积累促成癌症、衰老相关病、慢性炎症[185,186]。Andersen总结糖尿病、心血管病、神经退行性病与ROS失衡高度相关[187]。Pérez-Rosés等证实ROS增加促进阿尔茨海默、帕金森病发展[188]。

NPs也被报道促进乳腺癌细胞凋亡[35]、通过促进ROS产生破坏恶性组织与病原体[189,190]。但ROS也诱导正常/癌细胞增殖、刺激突变、在正常细胞致癌、癌细胞多药耐药[191,192]。Handy等发现碳纳米管暴露鱼类肺部肉芽肿、长期暴露肝脏肿瘤[193]。某些NPs致多器官衰竭，主要累及心、肺、肾、肝。TiO₂ NPs致体重下降、脾脏病变、呼吸道凝血、肝细胞坏死纤维化、肺泡间隔增厚[194,195]。NPs阻碍干细胞分化加重器官损伤[196]。NPs降低精子质量[197]，碳NPs暴露损害海胆精子受精能力与胚胎发育[198]。大量证据显示NPs对微生物、藻类、线虫、植物、动物、人类的毒理学效应[22,199,200]（图4b）。

低/无细胞毒性的新型NPs

NPs具生物医学价值（如抗菌抗癌[26-28]），主要作用模式为增加细胞ROS产生，但此特性也致毒，导致基因突变、凋亡、致癌[45,49,58]。急需开发保留功能且不致过量ROS的新型NPs。近期研究报道两类新型NPs可清除胞内ROS：① 清除ROS的NPs[77]；② 包被额外材料降低细胞毒性的NPs[87]。

Panikkanvalappil等证实Pt NPs降解ROS抑制DNA双链断裂[201]。Mn₃O₄ NPs调节细胞氧化还原保护生物大分子抗氧化应激[77]。CeO₂ NPs以自由基清除能力保护细胞组织抗氧化损伤[79,202]。

H₂O₂是NPs-细胞相互作用主要副产物，破坏蛋白、脂质、核酸等重要生物分子。但用巯基丙酸包被MNPs（MPA-NPs）或氨基化二氧化硅（SiO₂-MNPs）处理细胞时，上述损伤未观察到[203,204]。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）包被石墨烯氧化物（GO）对树突状细胞（DCs）、T淋巴细胞、巨噬细胞毒性低于未包被GO。PVP-GO减少T淋巴细胞凋亡、甚至增强巨噬细胞活性[205]。Pt包被Au纳米棒（PtAuNRs）保留传统AuNR疗效，触发靶向细胞死亡同时清除ROS，保护健康细胞免受ROS间接诱导死亡[87]。

结论与展望

NPs独特理化性质（超小尺寸、大比表面积、高反应性）使其在各应用领域极具吸引力。商业用工程NPs快速增加，生物安全受公众更多关注。本综述总结了NPs在细胞水平诱导ROS形成的机制与责任因素，以及生物医学领域ROS相关NPs毒性最新进展，重点介绍了细胞友好型NPs新兴领域。NPs诱导ROS生成与其尺寸、形貌、比表面积、成分相关。ROS在细胞生物学、生物医学中具多功能性，也是细胞凋亡、活力、分化等信号传导关键介质。

为提高NPs生物安全性、加速生物医学应用，仍需攻克瓶颈：① 期望设计高通量方法（HTMs）高效检测NPs体内外生物毒性。HTMs可节省时间资源、整合多参数、最小化方法/系统误差，深入理解NPs性质与细胞响应关系，识别最优条件。② NP诱导ROS生物毒性的分子细胞机制尚不清晰。需进一步探索NPs形成ROS的相关机制，为修饰NPs理化特性控制ROS生成提供更多信息，助力开发降低工程NPs危害的新策略，加速其临床商业化转化。③ 因结构特性，NPs可经多途径自由入体，体内积累诱发炎症免疫反应，导致细胞损伤/死亡、器官功能障碍，最终刺激阿尔茨海默、帕金森、肝炎、胚胎发育异常等疾病发生。随NPs广泛应用，这些问题日益迫切。