纳米粒子递送柴胡素增强线粒体凋亡抗肿瘤疗效

摘要

青蒿素及其衍生物具有广谱抗癌活性，能选择性杀伤肿瘤细胞。但低浓度柴胡素 (Ats) 主要依赖坏死样死亡 (oncosis) 诱导细胞死亡，抗肿瘤效果有限。为提升疗效，本研究利用纳米技术设计柴胡素负载牛血清白蛋白纳米粒 (Ats-BSA NPs)，实现柴胡素在线粒体富集并激活线粒体介导的凋亡。结果显示，与游离柴胡素依赖坏死不同，Ats-BSA NPs 表现出更高细胞毒性，其显著凋亡效应源于柴胡素在线粒体的分布。这一发现表明 Ats-BSA NPs 损害线粒体完整性，通过上调凋亡相关蛋白和促进细胞色素 C 快速释放，激活线粒体介导的细胞凋亡。

研究背景

青蒿素类药物因高抗疟活性和低毒性广泛用于疟疾治疗。研究发现其亦具显著抗肿瘤活性，毒副作用小、耐受性好。柴胡素 (Ats) 明确抑制肿瘤细胞生长并诱导抗癌效应。实验表明 48 h 后 Ats 以剂量依赖方式诱导不同程度凋亡和坏死。低浓度下 Ats 不诱导明显凋亡，细胞死亡伴随坏死样特征。增大剂量虽能增强抗肿瘤效果，但伴随严重毒性和骨髓抑制。因此亟需降低有效剂量、提升抗肿瘤效率的策略。

线粒体在调控 Ats 的凋亡与坏死效应中起关键作用，也参与多种凋亡信号转导。药物攻击线粒体导致通透性增加、膜电位下降、线粒体膜内膜肿胀，细胞色素 C 迅速释放至胞质，激活 caspase 家族蛋白，触发凋亡级联反应。

为增强 Ats 抗肿瘤效果，许多新技术尝试增加药物在肿瘤细胞内的分布或改善靶向递送至细胞器。纳米粒子 (NPs) 作为靶向癌症治疗关键工具被广泛研究，展现出巨大潜力。NPs 粒径小、比表面积大，可经毛细血管进入血液循环，穿过内皮细胞间隙迁移至肿瘤部位，实现药物靶向分布并提高生物利用度。NPs 还能通过生物材料降解控制药物缓释，延长消除半衰期、提高有效血药浓度、减少给药频率。最重要的是，药物负载 NPs 可递送至细胞内特定位置，提升治疗功效。

为在低浓度下增强 Ats 抗肿瘤效果，本研究设计新型 Ats 负载 BSA NPs。肿瘤细胞低 pH 环境导致线粒体外膜或膜间隙富集氢离子，而线粒体内膜因化学组成和基质分泌富含负电荷，形成外正内负的跨膜电位，有利于 BSA 递送。Ats 在线粒体大量富集可有效触发线粒体介导的凋亡。结果显示，与游离 Ats 诱导的典型坏死不同，Ats 在 BSA NPs 介导下特异性转运至线粒体，促进凋亡相关 caspase 蛋白激活，点燃显著细胞凋亡，体现更高细胞毒性。

实验方法

材料

BSA 购自 Sigma-Aldrich，Ats 购自桂林制药。SMMC-7721 和 Plc 细胞株购自中科院上海生化细胞所。其他试剂均为分析纯。

Ats-BSA NPs 制备与表征

采用去溶剂法制备。将含 Ats 的无水乙醇 (1.0 mL) 快速滴加至 37 °C 的 BSA 溶液 (0.5 mL) 至乳光出现。旋转蒸发除去乙醇，加入 8% 戊二醛 (0.5 μL/mg BSA) 交联搅拌 24 h。离心收集 NPs，去离子水洗涤 3 次。用 Brookhaven Zetasizer 和 TEM (JEM-1200EX) 测定流体动力学直径、多分散指数 (PDI)、Zeta 电位、形貌。包封效率按文献法测定。

MTT 实验

SMMC-7721 和 Plc 细胞用 20% FBS 培养，密度调整至 1×10⁵ cells/mL，接种 96 孔板 (100 μL/孔，约 1×10⁴ 细胞/孔) 培养 24 h。更换无血清培养基加入不同浓度游离 Ats 或 Ats-BSA NPs 孵育 24 h。加入 MTT (5 mg/mL, 50 μL/孔) 孵育 4 h，离心弃上清，加 DMSO (150 μL) 溶解结晶，酶标仪 (Syneray-2) 490 nm 测吸光度。

细胞内 BSA NPs 分布

对数期细胞经胰蛋白酶消化，浓度调整至 1×10⁶ cells/mL，接种 6 孔板贴壁。去培养基加入罗丹明 B 标记 BSA NPs。Hoechst (蓝) 染核 15 min，MitoTracker Green FM 染线粒体。共聚焦激光扫描显微镜 (FluoView FV10i) 追踪 NPs 细胞内定位。

线粒体膜电位变化

JC-1 探针检测线粒体膜电位。高电位时 JC-1 在线粒体聚集呈红荧光 (Ex 525 nm/Em 590 nm)；电位降低时 JC-1 转移至胞质形成绿色单体 (Ex 490 nm/Em 530 nm)。细胞接种共聚焦皿培养 12 h，更换含 Ats 或 Ats-BSA NPs 无血清培养基孵育 9 h，洗涤后加 JC-1 (2 μmol/L) 暗处孵育 30 min，激光扫描共聚焦显微镜观察成像变化。

ROS 产生测定与内质网 (ER) 染色

细胞处理同 MTT 实验。游离 Ats 和 Ats-BSA NPs 孵育 6、12、24 h 后，加入 DCFH-DA (10 μM) 孵育 30 min，冰冷 PBS 洗涤 3 次除去未内化 NPs。微板读数器 (Synergy-2) 以 Ex 485 nm/Em 530 nm 检测 DCF 荧光强度评估氧化应激。24 h 处理组加入 ER-Tracker Blue-White DPX 探针孵育 30 min，洗涤后共聚焦显微镜观察 ER 形态变化。

流式细胞术评估细胞坏死与凋亡

按前期研究方案，Annexin V-FITC/PI 双染评估游离 Ats 和 Ats-BSA NPs 诱导的坏死与凋亡。细胞胰蛋白酶消化接种 6 孔板 (1×10⁶ cells/mL) 培养 24 h，更换含药物无血清培养基处理。收集细胞悬浮于 Nicoletti 缓冲液含 PI 和 AV-FITC，共聚焦观察形态变化。流式细胞术定量早期凋亡 (Q4)、坏死 (Q2)、晚期坏死/坏死 (Q1)、活细胞 (Q3) 比例。

Western Blot 检测凋亡相关蛋白与细胞色素 C

SMMC-7721 细胞与游离 Ats 或 Ats-BSA NPs 孵育 24 h 后，RIPA 裂解液 (含蛋白酶/磷酸酶抑制剂) 裂解细胞。BCA 法定量蛋白浓度，10% SDS-PAGE 电泳。UVP 凝胶分析系统 (iBox Scientia 600) 成像分析靶蛋白表达水平。

结果

Ats-BSA NPs 特性与细胞活力研究

TEM 显示 Ats-BSA NPs 球形均匀分散，PDI 低至 0.016。平均粒径 99.9±2.3 nm，Zeta 电位 -25.6±4.3 mV。释放曲线显示平滑持续释放：游离 Ats 6 h 内释放 >85%，NPs 48 h 累计释放 78.9%，证实 NPs 通过生物材料降解实现长效平滑释放，延长半衰期、提高血药浓度、降低给药频率。

MTT 结果显示两细胞系中游离 Ats 和 Ats-BSA NPs 细胞毒性均随浓度增加而增强。Ats-BSA NPs 在两细胞系中均表现出更高细胞毒性和敏感性，导致更大抑制率。24 h 时 Ats-BSA NPs 使细胞活力显著下降。SMMC-7721 和 Plc 细胞的 IC₅₀ 分别为 50.1 和 44.9 μg/mL (Ats-BSA NPs)，而游离 Ats 分别为 69.2 和 74.9 μg/mL。提示 NPs 改变了 Ats 细胞内定位，最终杀伤更多细胞。

BSA NPs 细胞内摄取

共聚焦显微镜观察 (图 2) 显示，罗丹明 B 标记 NPs 共培养 3 h 后红色荧光见于胞质；随时间延长，大部分 NPs 内化并扩散至胞质，红色荧光随时间增强。NPs 与线粒体共定位 (黄色荧光，红绿合并)，证明内化 BSA NPs 能特异性富集于线粒体，提示 Ats 可经 BSA NPs 递送至线粒体。

线粒体膜电位分析

JC-1 染色 (图 3) 显示：游离 Ats 处理组线粒体红荧光强、绿荧光弱，JC-1 以聚集态为主，膜电位高、完整性好。Ats-BSA NPs 处理组两细胞系线粒体绿荧光显著增强，表明膜电位严重下降、膜完整性受损。证实 Ats 经 BSA NPs 递送至线粒体导致去极化。

ROS 产生与 ER 染色

大量 ROS 可致线粒体内膜磷脂过氧化、膜电位下降、细胞色素 C 释放。DCFH-DA 探针检测 ROS：细胞内酯酶水解生成 DCFH，ROS 氧化生成绿荧光 DCF。两细胞系经游离 Ats 和 Ats-BSA NPs 处理后 ROS 均随时间增加。相比游离 Ats，Ats-BSA NPs 显著增强 ROS 产生：48 h 时 SMMC-7721 和 Plc 细胞 ROS 水平分别升高 1.53 倍和 1.28 倍。ER 染色显示，Ats-BSA NPs 处理组 ER-Tracker 荧光强度显著增强，提示触发 ER 应激。这支持 Ats 经 BSA NPs 靶向线粒体，显著增加细胞内自由基水平，触发 ER 应激并激活线粒体途径诱导 caspase 依赖性凋亡。

细胞凋亡与坏死评估

Annexin V-FITC/PI 染色 (图 5a) 显示：对照组无荧光；游离 Ats 和 Ats-BSA NPs 处理 24 h 后均观测到强绿红荧光，诱导坏死与凋亡。Ats-BSA NPs 处理组 Annexin V-FITC 和 PI 荧光强度显著增强，表明坏死与凋亡程度显著提高。

流式细胞术定量 (图 5b)：游离 Ats 处理 SMMC-7721 和 Plc 细胞坏死率分别达 24.4% 和 4.6%，凋亡率仅 4.9% 和 7.1%，主要依赖坏死。Ats-BSA NPs 显著提升凋亡率 (SMMC-7721 10.9%，Plc 11.5%) 和坏死率 (SMMC-7721 29.0%，Plc 21.6%)。表明 BSA NPs 介导的线粒体递送加速肿瘤细胞死亡，增强坏死与凋亡协同效应，启动凋亡信号转导和线粒体介导的级联反应。

Western Blot 分析

Western Blot (图 6) 检测凋亡蛋白表达：Ats-BSA NPs 处理 SMMC-7721 细胞中 Bax 蛋白显著上调。提示 BSA NPs 协助 Ats 富集线粒体导致功能障碍，胞质 Bax 单体转移至线粒体外膜寡聚化形成蛋白通道，增加膜通透性。胞质细胞色素 C 显著增强，caspase-3 和 caspase-9 表达上升。细胞色素 C 快速释放激活 caspase，推动凋亡级联。相反，游离 Ats 对凋亡相关蛋白和细胞色素 C 表达无显著影响，证实其主要依赖坏死致死。BSA NPs 增强药物线粒体富集，激活线粒体介导凋亡，显著增加关键凋亡蛋白表达。

讨论

凋亡是多细胞生物程序性死亡的主动过程；坏死是 caspase 非依赖性死亡，特征为肿胀、通透性增加、膜破裂，属意外非受控死亡。本研究证实：Ats 抑制肿瘤细胞生长呈剂量依赖，主要依赖坏死致死，激活 caspase 非依赖性坏死途径。而 Ats-BSA NPs 内化后快速定位线粒体释放 Ats，产生 ROS 触发 ER 应激，通过降低线粒体膜电位、释放细胞色素 C、促进 Bax、cleaved caspase-3 和 caspase-9 表达，激活线粒体介导的 caspase 依赖性凋亡途径。综上，Ats-BSA NPs 增加线粒体递送，增强坏死与凋亡协同，提升细胞毒性，诱导显著细胞死亡。

结论

游离 Ats 在肿瘤细胞中强依赖坏死样死亡抑制增殖，细胞毒性有限。相比之下，Ats-BSA NPs 激活线粒体凋亡途径并同时触发坏死效应，二者协同增强抗肿瘤功效。本研究凸显 Ats-BSA NPs 在增强 Ats 细胞毒性和凋亡效应中的意义，以及 BSA NPs 在多样化 Ats 诱导细胞死亡途径中的作用。与游离 Ats 相比，Ats-BSA NPs 在肿瘤细胞中诱导更强细胞毒性和显著凋亡效应。