GAL-GNR-siBRAF纳米系统：靶向BRAF基因沉默联合光热疗法抑制肝癌生长

摘要

肝癌是全球最常见恶性肿瘤之一。RAF激酶抑制剂对肝细胞癌（HCC）疗效显著，抑制BRAF/MEK/ERK通路成为新治疗策略。但肿瘤靶向递送系统仍是临床应用的主要障碍。半乳糖（GAL）可靶向肝癌细胞高表达的天冬氨酸糖蛋白受体（ASGPR）。本研究设计新型多功能纳米材料GAL-GNR-siBRAF，包含三部分：GAL作为肝癌靶向配体，金纳米棒（GNR）提供近红外光热转化能力，siRNA特异性沉默BRAF（siBRAF）。该纳米载体显示高siRNA负载量并抑制血清中siRNA降解。与裸GNR相比，GAL-GNR-siBRAF生物毒性更低、基因沉默效率更高。处理显著下调BRAF表达，抑制肝癌细胞增殖、迁移与侵袭。光热效应与BRAF敲低的联合作用有效诱导肿瘤细胞死亡。该研究开发出治疗肝癌的新型靶向多功能纳米材料，为临床新疗法提供思路。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球重大卫生问题[1]，发病率第六、癌症死亡率第三[2,3]，多发于东亚和撒哈拉以南非洲，但发达国家发病率也在上升[4]。早期HCC标准治疗为手术切除，5年生存率89-93%[5]，但仅20-30%患者早期确诊，超70%属晚期无法手术。其他选择包括肝移植、经导管动脉化疗栓塞（TACE）、全身化疗[6]，均受限于供体短缺、栓塞不全、副作用大、预后差等问题，迫切需要新疗法[7]。

RAS/RAF信号通路在肝癌发生中关键，BRAF是该通路核心致癌基因。该基因突变常导致级联失控，通路异常激活与预后不良相关[8]。BRAF是RAF家族最高频突变基因，靶向RAS/RAF通路成为HCC新策略[8-10]。RAF激酶抑制剂索拉非尼获批治疗HCC，使BRAF突变成为晚期HCC首选靶点[11]。索拉非尼较安慰剂延长总生存[12-14]，但靶向性差导致高血压、脱发、恶心等副作用[15]，高特异性靶向肝癌并阻断RAF的药物仍待开发。

天冬氨酸糖蛋白受体（ASGPR）即肝半乳糖受体，为肝窦内皮细胞表面C型凝集素[16]，在结合、内化、清除末端半乳糖残基物质中起关键作用[17]，是肝靶向纳米系统的重要靶点。多种单糖（半乳糖、甘露糖、乳糖等）均能与ASGPR结合，半乳糖亲和力最强[18]。ASGPR高表达于肝实质细胞表面[19]，半乳糖修饰的前药/递送系统可特异靶向肝脏。半乳糖纳米颗粒[20]、胶束[21]、脂质体[22]均被确认为肝靶向给药系统。

金纳米棒（GNR）作为纳米载体优势显著[23]：生物相容性好、稳定递送siRNA[24]；比表面积大、易修饰肿瘤靶向配体[25]；近红外光下局域表面等离子体共振（LSPR）光热转化效率高，成优异光热抗肿瘤材料[26]；调节长径比可达最大光热效率。金纳米颗粒体内毒性取决于尺寸、表面电荷、包被层[27]。但GNR合成必需的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）细胞毒性明显，限制生物应用[28]。

RNA干扰（RNAi）通过小干扰RNA（siRNA）高效敲除/沉默靶标基因，成癌症治疗有前景途径[29]。siRNA已进入人体临床试验，被视为治疗多突变基因癌症的希望[30]。但应用面临血清不稳定（核酸酶降解）、脱靶效应[31]、负电荷难穿透细胞膜[32]等挑战，裸siRNA难直接递入细胞。化学修饰siRNA或将其封装进保护性载体可提升稳定性[33]。

本研究新构建多功能纳米载体GAL-GNR-siBRAF：以具光热能力的GNR为内核，外修饰d-半乳糖（GAL）实现肝肿瘤特异靶向。该系统降低了GNR表面CTAB生物毒性，具高siRNA负载量，有效沉默肝癌BRAF基因。GAL-GNR-siBRAF显著抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移，且基因沉默与光热效应协同增强杀瘤能力，为肝癌临床治疗提供新思路。

材料与方法

细胞系

小鼠肝癌细胞系Hepa1-6购自中国科学院干细胞库，DMEM培养基（含10% FBS）培养，37℃、5% CO₂条件下。

BRAF siRNA合成

靶向BRAF基因siRNA序列：5′-GCUUACUGGAGAGGAGUUACA-3′，由Dharmacon公司合成。市售靶向荧光素酶基因siGL2作阴性对照。

CTAB-GNR合成

采用种子介导生长法[34]制备水溶性GNR。种子液：0.2 M CTAB与0.5 mM HAuCl₄混合，28℃搅拌，加0.01 M NaBH₄至变褐色备用。生长液：0.2 M CTAB、1 mM HAuCl₄、4 mM AgNO₃混合，28℃下加0.079 M抗坏血酸至无色，再加种子液120 μL，颜色经紫色变为紫黑透明，恒温搅拌24 h，12000 rpm离心10 min除去多余CTAB，真空冻干得GNR粉末。

MUA-PEI与GAL-PEI-MUA合成

巯基十一烷酸（MUA，654 mg）溶于30 mL氯仿，与100 mmol EDC、100 mmol NHS室温反应15 min，加100 mmol聚乙烯亚胺（PEI）反应24 h，等体积去离子水提取水溶性PEI-MUA。同法活化d-半乳糖，加500 mmol活化半乳糖反应24 h得水溶性GAL-PEI-MUA复合物。

GAL-PEI-MUA-GNR（GAL-GNR）与PEI-MUA-GNR（PEI-GNR）合成

冻干CTAB-GNR粉末（10 mg）悬浮于10 mL水溶性PEI-MUA或GAL-PEI-MUA中，室温搅拌24 h使CTAB被Au-S键取代。12000 rpm离心15 min，沉淀用蒸馏水洗涤3次，冻干得PEI-GNR或GAL-GNR粉末，溶于无核糖核酸酶水，多功能酶标仪（Spectra Max M5e）检测等离子体共振效应。

透射电镜、紫外-可见吸收、Zeta电位与流体动力学直径、核磁共振、凝胶阻滞实验、血清中siRNA稳定性、竞争性抑制实验、肝癌靶向递送能力、光热效应、MTT实验、钙黄绿素-AM/PI染色、实时定量PCR、Western Blot、划痕实验、Transwell迁移/侵袭实验、统计学分析

（详细实验步骤见原文，此处省略冗长描述，保留关键参数与结果。）

结果

纳米载体GAL-GNR-siBRAF的合成与表征

设计GAL-GNR纳米载体可同时递送siRNA至肝细胞并保持GNR光热效应。合成流程见图Scheme 1。系统含三功能组分：① GNR骨架，TEM显示长约30 nm、直径约10 nm（图1a），修饰后尺寸无显著变化、分散性良好（图1b）；粒径分析显示GNR平均30.23 nm，GAL-GNR 50 nm、PEI-GNR 42.35 nm，因GAL/PEI接枝增加水化层（图1c）。② CTAB被带正电MUA-PEI取代，可静电负载带负电siRNA。Zeta电位由GNR的35.6 mV升至PEI修饰42.7 mV、GAL-PEI修饰41.8 mV（图1d），证实强siRNA结合能力。③ GAL作导向分子修饰GNR，实现肝癌特异性归巢。UV-Vis吸收光谱初步表征：未修饰GNR吸收峰763 nm，MUA-PEI修饰红移7 nm，GAL修饰再红移8 nm（图1e）。NMR氢谱仅在GAL-GNR谱中检测到半乳糖H信号（δ: 3.60, 3.65, 3.70, 3.78, 3.90, 4.53），确认GAL成功接枝（图1f）。

siRNA包裹能力与GAL-GNR稳定性

带正电PEI修饰的GAL-GNR骨架可静电结合带负电siRNA。凝胶阻滞实验评估结合能力：游离siRNA迁移，结合siRNA滞留且荧光减弱。最佳饱和质量比为6:1（w/w）（图2a）。裸siRNA极易降解，载体保护功能关键。新鲜小鼠血清中孵育显示：裸siRNA 12 h降解，GAL-GNR包裹siRNA 48 h仍丰富（图2b），证实有效防护siRNA血清降解，保障体内靶向递送。

纳米材料细胞毒性

低生物毒性是纳米药物关键属性。MTT实验评估生物相容性（图3）：未修饰GNR 30 μg/mL即现死细胞，75 μg/mL培养24 h死亡率56.09%，48 h达75.5%。GAL修饰显著降低毒性：105 μg/mL培养48 h仍有>80%细胞存活。GAL-GNR生物相容性远优于GNR，保障应用安全。

体外肝癌细胞靶向递送siRNA与BRAF基因沉默

检测GAL-GNR负载siBRAF在Hepa1-6细胞中基因沉默效果（图4a）：空白组与阴性对照siGL2组BRAF表达无变化，GAL-GNR-siBRAF组显著下调，呈剂量依赖性。qPCR显示最佳转染浓度30 μg/mL，沉默效率90.29%，接近脂质体2000阳性对照。Western Blot结果一致，48 h转染后BRAF蛋白下调（图4b）。

乳糖酸结构似GAL，可竞争结合Hepa1-6细胞膜ASGPR[35]。预孵乳糖酸后转染GAL-GNR-siBRAF验证靶向特异性（图4c,d）：未处理组作空白，脂质体2000作阳性对照。GAL-GNR转染组红色荧光（Cy3标记）强度接近阳性对照，PEI-GNR组显著降低；乳糖酸预处理组荧光减弱，qPCR一致。证实GAL有效促进Hepa1-6内吞siRNA，可作为HCC靶向配体。

GAL-GNR-siBRAF对Hepa1-6增殖、迁移、侵袭的影响

BRAF在MAPK通路中调控细胞增殖、迁移、侵袭[36]。MTT检测增殖（图5a）：GAL-GNR-siBRAF组显著低于siGL2或PBS组。划痕与Transwell检测迁移/侵袭（图5b-f）：siBRAF组迁移侵袭能力显著降低。敲低BRAF可有效抑制肝癌细胞恶性表型。

光热效应与基因沉默联合治疗

GAL-GNR浓度依赖性产热（图6a）：100 μg/mL时温度从24℃速升超60℃，GAL修饰不影响光热转化效率。协同治疗研究（图6b）：仅激光不杀伤细胞；GAL-GNR-siGL2+激光光热杀伤力强；单独BRAF沉默致死有限；GAL-GNR-siBRAF+激光协同杀伤力最强，细胞死亡率超85%。基因沉默与光热效应协同增强抗肿瘤潜能。

讨论

肿瘤靶向递送难是临床治疗主要障碍。本研究首创多功能纳米载体GAL-GNR-siBRAF，优势多维：修饰后GAL-GNR生物相容性好，保留GNR骨架LSPR与光热转化能力；GAL通过ASGPR靶向肝癌细胞，分子靶向治疗潜力大；BRAF沉默抑制增殖、迁移、侵袭；光热与基因沉默协同杀瘤效果最强。

RNAi因基因调控核心地位备受关注，siRNA序列特异性敲低是有效靶向基因治疗新工具[29,31]。但血清不稳定、细胞摄取差限制临床应用[38]；负电荷阻碍膜结合[32,39]；转染效率低、内化差[40]。为提升稳定性与沉默效力，本研究构建三组分纳米载体GAL-GNR-siBRAF（Scheme 1）。尺寸小（~30×10 nm）、分散性好（图1）；低浓度高效负载siRNA（图2a）；血清中保护siRNA至少48 h（37℃，图2b）。

生物相容性是生物治疗纳米材料前提。CTAB虽是GNR合成必需但细胞毒性大[41]。本研究用带正电PEI与靶向配体GAL双重修饰GNR。结果显示：GAL-GNR生物相容性优于裸GNR，105 μg/mL、48 h细胞活力>80%（图3）。纳米棒小尺寸圆柱形利于穿透细胞膜[37,38,42]，靶向修饰导致GAL-GNR-siBRAF在肿瘤细胞高富集，高效下调BRAF（图4）。竞争抑制实验证实主要通过ASGPR介导内吞（图4c）。

高表达BRAF/RAF1的HCC增殖生长快[41,43,44]。B-Raf/Raf1作用于ERK/MAPK下游，级联放大调控核因子，通路激活致HCC异常增殖分化[41,44,45]。RAF还促进基质金属蛋白酶（MMPs）表达，改变细胞粘附、降解细胞外基质（ECM）与基底膜，促进侵袭转移[44,45]。BRAF激酶调控RAS-RAF-MEK-ERK通路，促进增殖、侵袭、转移、抑制凋亡[5,46,47]。前期发现BRAF在Hepa1-6高表达（数据未显示），推测敲低可阻断通路引发生物学改变。实验证实GAL-GNR-siBRAF显著抑制增殖、迁移、侵袭（图5），为HCC临床治疗提供新策略。

GNR的LSPR将近红外光能转化为热能杀伤细胞[42]。本研究验证GAL-GNR光热转化有效（图6a）。协同效应研究：单独BRAF沉默细胞毒性有限；GAL-GNR-siGL2+激光杀伤力强；两者结合致死率超85%（图6b），协同策略有望成为抑制肝癌理想方案。

结论

本研究表明GAL-GNR-siBRAF克服siRNA降解障碍，显著提升体外血清稳定性；可靶向递送siRNA至肝癌细胞，高效敲低BRAF表达，显著抑制增殖、侵袭、迁移；更重要的是，联合近红外光照时杀瘤能力大幅增强。GAL-GNR-siBRAF作为新型多功能纳米载体，在肝细胞癌治疗中潜力巨大，为临床转化提供新思路。