经氢氧化钾处理的聚苯乙烯 ELISA 表面上的胺-醛化学偶联，用于纳米传感 HIV-p24 抗原

背景

在医学诊断领域，检测完整病原体的疾病生物标志物和表面抗原对于延长人类寿命和支持更健康的生活是必要的。不同的检测系统可用于诊断病原体和威胁生命的疾病，包括癌症 [1,2,3,4]。探针和传感策略的范围已被证明可以识别多种疾病 [5, 6]。在这些结果中，酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是检测和诊断包括 HIV 在内的主要疾病的成熟策略，并且 ELISA 已被视为质量控制测试 [7,8,9,10]。作为免疫测定法，ELISA 使用适当的抗体检测抗原。为了发挥这一作用，抗原被固定在聚苯乙烯 (PS) 表面上，然后与伴侣抗体（一抗）相互作用，然后是宿主特异性抗体（二抗）与偶联酶结合，使其与一抗。最后，这些分子相互作用由合适的底物监测。研究人员使用了不同的基于 ELISA 的方法，包括使用合适的多克隆和单克隆抗体或适体-抗体组合的夹心法来改进检测 [11,12,13,14]。

ELISA 的灵敏度取决于参数，例如抗原和抗体之间的相互作用、温度、pH 以及抗原在 PS 表面的附着效率。在这些因素中，将抗原或抗体固定在 PS 板上对提高检测限起着至关重要的作用。此外，PS 表面上蛋白质的附着和不均匀分布所造成的限制极大地影响了检测灵敏度 [5]。适当固定蛋白质的更高数量有助于在 PS 表面实现正确的方向，从而可能改进检测。已采用不同的策略将蛋白质正确固定在 PS 表面。蛋白质或抗体能够通过化学或物理吸附或静电相互作用简单地固定在 PS 板上。博拉等人。 [15] 使用光化学将蛋白质固定在 PS 表面上，他们发现与未经处理的表面相比，性能提高了 1.5 到 2 倍。在另一项研究中，显示了使用称为聚乙烯苄基内酯酰胺 (PVLA) 的聚合物在 PS 板上有效固定蛋白质 [16]。基于聚乙二醇 (PEG) 的聚合物还可以有效地将生物分子固定在传感表面上。拉克什米普里亚等人。 [17] 通过将其硫醇化寡聚体与两种聚合物（PEG-b-PAAc 和 N6-PEG）固定在镀金表面上，改进了凝血蛋白因子 IX 的检测。

在 ELISA 板表面，PS 由脂肪族碳链组成，每个碳上都有侧链苯环，并提供疏水表面。 PS 表面的羧基通过与其暴露的胺基的静电相互作用来结合抗原或抗体。然而，这种结合策略有缺点，例如蛋白质的结合较低和分子的不规则定位。由于可用的表位较少，具有较少氨基酸组成的较小尺寸的蛋白质和肽特别难以结合到 PS 表面。此外，已经表明，如果传感基板上的分子很拥挤，那么探针之间的距离就会受到干扰，无法进行真正的相互作用。因此，以正确的方向增加蛋白质或抗体在 PS 板上的结合可提高检测限。一般来说，蛋白质直接固定在 ELISA 表面，研究人员专注于改善蛋白质在 ELISA 表面的固定，以开发高性能检测。特别是，一些研究人员观察到通过化学功能化在 PS 表面固定蛋白质以改进这种策略。基于胺的化学修饰可有效地通过适当的交联剂固定不同的抗体。 3-（氨基丙基）三乙氧基硅烷 (APTES) 通常用于修饰传感表面以与胺一起使用。抗体可以通过其 COOH 基团固定在胺修饰的 APTES 表面。然而，蛋白质的固定不能像抗体一样直接连接到胺表面；特别是，较小尺寸的蛋白质需要合适的交联剂。在这里，我们介绍了使用 APTES 和戊二醛 (GLU) 进行化学修饰的简单蛋白质固定步骤。我们将蛋白质共价固定在胺修饰的表面上并使用 GLU 连接。 GLU 是一种有机化合物，分子式为 CH2(CH2CHO)2，已被发现是最有效的蛋白质交联剂之一 [4, 18,19,20]。它的末端有两个醛基；一端与胺修饰的ELISA表面结合，另一端自由结合蛋白质或抗体。一般来说，在 ELISA 表面固定较小尺寸的蛋白质或肽确实具有挑战性，因为其表面存在较少的胺。通过化学功能化策略，可以使用较小尺寸的蛋白质或肽将材料牢固地固定在 ELISA PS 板上。对于我们的方法，我们使用 APTES-GLU 作为链接器；通过使用这种修饰，我们可以固定任何类型的抗体、蛋白质和肽。与过去探索的其他化学策略相比，该策略下的信号和灵敏度增强更高[3, 4]。

为了证明这些化学物质的优势，我们选择检测一种主要的人类免疫缺陷病毒 (HIV) 蛋白 (p24)，该蛋白在 HIV 感染的早期阶段表达。 p24 抗原由病毒核心组成，在感染的第一周内以更高的水平存在。因此，使用 p24 生成敏感系统用于早期 HIV 检测是理想的。在本文中，p24 的检测是使用上述化学修饰的 ELISA 表面产生的。这种化学功能化策略使PS ELISA表面的p24检测提高了数倍，可推荐用于检测其他重要的临床生物标志物。

材料和方法

试剂和生物分子

重组 HIV-p24 和 Tat 蛋白以及 p24 抗体购自 Abcam（马来西亚）。 3-（氨基丙基）三乙氧基硅烷 (APTES)、戊二醛 (GLU) 和人血清购自 Sigma-Aldrich（美国）。抗小鼠 IgG 偶联辣根过氧化物酶（抗小鼠免疫球蛋白 HRP）购自 Thermo Scientific（美国）。 ELISA 板购自 Becton Dickinson (France)。 ELISA 5X 包被缓冲液购自 Biolegend (UK)。牛血清白蛋白 (BSA) 和 HRP 底物 [3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)] 从 Promega (USA) 获得。分析ELISA阅读器购自Fisher Scientific（马来西亚）。

PS 表面功能化的最佳 APTES 和 GLU 水平

用靶向 HIV p24 抗原对 PS 表面使用的 APTES 和 GLU 水平进行优化。为了确定合适的 APTES 和 GLU 浓度，ELISA 表面首先用 1% 氢氧化钾活化 10 分钟。然后，让三种不同量的 APTES（0.5%、1% 和 2%）结合在 ELISA 表面上，并将它们在室温 (RT) 下孵育过夜。之后，将两种不同量的 GLU（1% 和 2%）应用于胺改性的 PS 表面。此时，250-nM 浓度的 HIV-p24 被允许结合在 GLU 修饰的表面上，剩余的 GLU 表面用 2% BSA 封闭。以 1:1000 的稀释度引入 p24 抗体，然后让抗小鼠 IgG-HRP 与 p24 抗体结合。最后，通过添加 HRP 的底物（3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB）来监测这些相互作用。加入最佳量的底物（100 mM）后，用ELISA读数器在405 nm处读取吸光度。对照实验在没有靶标 HIV-p24 的情况下进行。

醛与胺基团的优化

为了确定 GLU 连接胺改性表面的合适孵育时间，观察了两种不同的孵育时间。 ELISA PS表面用APTES修饰后，将GLU固定3 h并独立孵育过夜，然后将250 nM HIV-p24抗原固定在GLU修饰的表面上。其余步骤如前一个实验所示。

GLU 修饰表面上的 HIV-p24 抗原与 GLU 预混-HIV-p24 抗原附件之间的比较检测

为了检测 ELISA 表面上的 HIV-p24 抗原，我们比较了两种使用 GLU 的不同表面修饰方法。在第一个（方法 1：胺-GLU-p24）中，PS 表面最初使用 2% APTES 通过胺改性，将 2% GLU 添加到表面以将板表面与醛基连接，然后 100添加了 nM HIV-p24 抗原。在第二种方法中（方法 2：胺-GLU 预混 p24），在表面被胺修饰后，GLU-p24（2% GLU 与 100 nM 的 HIV-p24 抗原混合并在室温下保持 30 分钟）是添加。最后，使用p24抗体进行检测。其他步骤如上所述进行。对照实验在没有靶标HIV-p24的情况下进行。

检测限：常规与化学修饰 ELISA

为检查检测限，在0.5～500 nM范围内滴定不同浓度的p24，并采用常规方法和方法1和方法2进行评价。

常规方法

HIV-p24抗原先用1%ELISA包被缓冲液稀释，加入ELISA表面，4 °C保持过夜，然后剩余区域用2%BSA室温封闭1 小时。之后，加入1:1000稀释的p24抗体并孵育1 小时，然后将1:1000稀释的抗小鼠-IgG-HRP加入ELISA表面并静置1 小时。最后加入HRP底物(TMB)，ELISA酶标仪在405 nm波长下测定。

方法一

将不同浓度的 HIV-p24 抗原添加到 APTES 和 GLU 修饰的表面。抗原固定后，按照常规 ELISA 中所述进行剩余步骤。在每个固定步骤之间进行五次洗涤。使用ELISA酶标仪在405nm波长处记录吸光度并拍照。

方法二

在 APTES 修饰的 ELISA 板上，固定了与 GLU 预混合的不同浓度的 p24。遵循用于常规ELISA的所有其他步骤。在每个固定步骤之间进行五次洗涤。使用ELISA读数器在405 nm波长处记录吸光度，并记录照片。对照实验在没有靶标 HIV-p24 的情况下进行。

在 APTES 修饰表面上特异性检测 HIV-p24 抗原

为了检查测定特异性，我们进行了两个不同的对照实验。我们使用与 1% GLU 预混合的人血清或 HIV-TAT 蛋白代替 HIV-p24 抗原，并将它们添加到 APTES 修饰的表面。所有其他步骤均按照上述说明进行。对照实验在没有靶标 HIV-p24 的情况下进行。

结果与讨论

酶联免疫吸附测定 (ELISA) 是一种有效的免疫测定，可帮助研究人员使用适当的抗体识别不同的生物分子。分析物（蛋白质、肽、抗体和适体）的高度固定化 [21,22,23] 和捕获分子（单克隆抗体、多克隆抗体和抗体的 Fc 区）的能力 [24, 25] 可以显着提高检测限并有助于支持分析的特异性。考虑到这一点，几种类型的研究都集中在对 ELISA 表面进行化学修饰以捕获更多数量的正确定向的探针或分析物。通常，抗体或蛋白质通过 PS 上的羧基与蛋白质或抗体上的胺基之间的静电相互作用固定在 ELISA PS 表面上。然而，由于其结合限制，该方法的效率不足以获得更高的灵敏度和特异性。为了克服这个基本问题，在本研究中，我们使用 3-（氨基丙基）三乙氧基硅烷 (APTES) 和戊二醛 (GLU) 制备了化学功能化的 ELISA 表面，以实现有效的蛋白质固定。如图 1a 所示，氢氧化钾激活的 PS 表面使用 APTES 通过胺进行修饰，然后与 GLU 交联以附着蛋白质。在没有氢氧化钾处理的情况下，附着在 PS 表面上的 APTES 的最佳水平显着降低，因为没有极性氢键受体会增强初始吸附并触发 APTES 的更高结合。图 1b 显示了在化学修饰的 ELISA 表面与其伴侣抗体检测固定化蛋白质的建议。

化学修饰 ELISA 的示意图 (a ）。 ELISA 表面在氢​​氧化钾处理后使用 APTES 和 GLU 进行化学修饰。抗原固定在 GLU 修饰的表面上。 b 固定化抗原通过其伴侣抗体检测

为了收集有关这种检测策略的证据，我们想使用一种来自人类免疫缺陷病毒 (HIV) 的重要蛋白质 p24。 HIV-p24 抗原是一种可以在 HIV 感染早期表达的蛋白质，并且正如其他病毒系统所揭示的那样，它会在宿主系统中繁殖（图 2）。完整的 HIV 在覆盖衣壳的包膜上具有糖蛋白，并且 HIV-p24 抗原位于衣壳区域（图 3a）。在检测 HIV-p24 抗原之前，我们首先优化了化学接头的浓度，以在 ELISA 表面捕获 HIV-p24 抗原。我们探索了 ELISA 表面上 APTES 和 GLU 的不同浓度和组合，并使用恒定浓度 250 nM HIV-p24 抗原评估结果。如图 3b 和 c 所示，1% 的 APTES 和 GLU 应用显示出饱和水平的 HIV-p24 抗原结合。如果 APTES 的含量低于 1%，则结合吸光度 (OD) 较低，与 2% APTES 的结合吸光度处于同一时间水平，这是因为非特异性增加（参照对照实验）。对于 GLU，2% 的水平在 0.25 的吸光度下显示出对 HIV-p24 抗原的良好检测，同时，对照实验（不含 HIV-p24）显示出最高的吸光度 (0.16)。最佳的 1% APTES 和 GLU 在对照实验中显示出最低的吸光度 (0.08)，在特定检测 HIV-p24 抗原期间显示出最高的吸光度 (0.22)。出现这一结果是因为，随着 APTES 和 GLU 的增加，有可能在剩余的游离胺表面（源自 APTES）和醛表面（源自 GLU）上捕获抗体。即使在上述情况下自由表面区域被 BSA 阻挡，该结果也是相同的。为了进一步微调该方法，我们还尝试增加 BSA 浓度以最小化背景信号。然而，即使在较高的 APTES 和 GLU 浓度下，也存在生物污垢。基于这些结果，优化条件为1% APTES和GLU，如实验所用。

HIV 和宿主细胞的相互作用。 HIV增殖的一般策略如图所示

一 完整的 HIV 结构。指示了 p24 抗原。 b APTES 和 GLU 的优化。 APTES（0.5%、1%和2%）和GLU（1%和2%）不同组合用于检测HIV-p24抗原的恒定浓度（250 nM）

在 APTES 和 GLU 优化之后，我们还调整了将 GLU 连接到 APTES 修饰表面的孵化时间。如图 4a 所示，与较短的孵育时间 (3 h) 相比，将 GLU 孵育过夜会产生最高的吸光度。出现这种结果是因为 GLU 连接到 APTES 修饰表面的孵育时间不足；最终，抗体能够结合剩余的 APTES 表面。随着 GLU 孵育时间的增加，这种化合物有机会完全覆盖 APTES 表面。这种饱和增加了 GLU 表面上的蛋白质固定，并提高了检测灵敏度。在 250-nM HIV-p24 浓度下，GLU 过夜孵育的吸光度几乎提高了两倍（图 4a）。

优化 GLU 的潜伏期。 一 使用 1% GLU 在 1% APTES 修饰的表面上进行优化以具有 3 h 的孵育期和过夜孵育。 b 通过三种不同的方法检测 125 nM p24，常规方法、APTES-GLU-p24（方法 1）和 APTES-GLU-预混 p24（方法 2）

由于 GLU 过夜孵育后具有更高的真实信号，吸光度和 p24 的特异性检测增加，我们使用类似的条件进行进一步的实验。在这种情况下，我们将 GLU 固定在 APTES 修饰的表面上，然后附着蛋白质（方法 1）。我们还尝试了另一种方法；首先，我们将 1% GLU 与 125 nM HIV-p24 抗原混合，然后将此混合物添加到胺修饰的 PS 表面（方法 2）。令人惊讶的是，与方法 2 中使用的浓度相同的 HIV-p24 抗原浓度（从 OD 0.161 到 0.23）的吸光度增加。当我们让蛋白质作为预混物与 GLU 结合时，几乎所有的蛋白质都是能够结合 GLU，然后这种混合物很容易吸附到胺改性的表面上。然而，当蛋白质被允许与预固定的 GLU 表面结合时，GLU 的大部分醛基不可用。图 4b 表明混合方法显示检测到类似浓度 (125 nM) 的 HIV-p24 抗原具有更高的吸光度。此外，在相同浓度的HIV-p24抗原下，方法1和方法2比常规方法显示出更高的吸光度。

在对检测步骤进行完全优化后，为了找到检测限，我们将 HIV-p24 抗原从皮摩尔滴定到纳摩尔范围（500 pM 到 500 nM）。我们比较了三种不同的方法，即传统的 APTES-GLU-p24（方法 1：p24 固定在 APTES 上，然后进行 GLU 修饰）和 APTES-GLU 预混的 HIV-p24（方法 2：p24 和 GLU 的预混物紧随其后）通过固定在具有相同 p24 浓度的 APTES 上。如图 5 所示，发现传统 ELISA 的 p24 检测限为 30 nM。与传统ELISA相比，方法1的检测限提高了8倍（4 nM）。出现这一结果是因为当我们使用化学修饰的 PS 表面时，蛋白质固定在均匀排列下是稳定的，并且与 ELISA 表面上的常规蛋白质吸附相比，固定率也相当高。瓦希斯特等人。 [12] 已经表明，与传统 ELISA 相比，抗体在 APTES 修饰的 ELISA 表面上更高的固定化与显着提高的检测水平有关 [12]。在他们的工作中，APTES 中的胺可以与抗体上的羧基结合，通过这种方式，他们将抗体化学固定在 ELISA 表面上。使用这种方法，我们只能通过其羧基将抗体固定在 ELISA 表面，但不能在 APTES 上进行基于蛋白质的抗原固定。为此，我们引入了 GLU 接头以将蛋白质固定在 ELISA PS 表面。使用这些化学接头，不仅蛋白质而且抗体也通过胺偶联与戊二醛上的醛化学连接。使用对照实验监测生物分子在 ELISA 底物上的非特异性附着。在没有靶分子 (HIV-p24) 的情况下进行对照实验。没有靶标，p24 的特异性抗体无法结合在表面，因此酶联二抗也不会固定在 ELISA 表面。在这种情况下，当我们添加底物（TMB）时，我们无法发现吸光度有任何变化。

HIV-p24 抗原的检测限。 p24 从 0.5 滴定到 500 nM。遵循三种不同的方法，常规方法和方法1和2

为了提高检测限，我们尝试在 APTES 修饰表面上的固定步骤之前预混合 GLU 和 HIV-p24 抗原。预计 GLU 和 HIV-p24 抗原的预混物会随着蛋白质在 ELISA 表面上的更大程度的固定而得到改善。当我们将 GLU 与 HIV-p24 抗原预混合时，醛与 GLU 的结合率很高。当我们将此混合物添加到 ELISA 表面时，它会提高固定率。迪克西特等人。发现当他们在 ELISA 板上固定之前预混合抗体和 APTES 时，他们的方法增强了抗体在 ELISA 表面上的固定，检测限增加[12]。在我们的研究中，正如预期的那样，当我们在固定前预混 GLU 和 HIV-p24 抗原时，检测限提高到 1 nM，比传统 ELISA 检测限高 30 倍，后者显示检测限为 30纳米。我们的策略不仅提高了检测限，而且还提高了所有浓度的 HIV-p24 抗原的吸光度。在 250 nM p24 处，我们观察到吸光度为 0.35，几乎是相同浓度 HIV-p24 抗原的常规 ELISA 的两倍。对于所有 HIV-p24 抗原浓度，与传统 ELISA 相比，吸光度有很大差异（图 5），这在 HIV-p24 抗原的可靠检测中很明显。

为了评估测定特异性，我们用两个不同的对照实验进行了测试。我们选择了人血清和 HIV-TAT，并在使用前与 GLU 混合而不是 HIV-p24 抗原，我们评估了它们的特异性。如图6所示，在人血清和HIV-TAT的情况下，没有明显的吸光度；然而，250 nM HIV-p24 抗原的吸光度明显增加。该结果证实了化学修饰ELISA表面对HIV-p24抗原的特异性检测，具有更高的灵敏度。

HIV-p24抗原的特异性检测。用人血清和HIV-TAT蛋白代替HIV-p24检测特异性

结论

在 ELISA 表面上更高且适当的蛋白质或抗体固定化显着提高了检测限。在这里，我们引入了一种有趣的化学功能化方法，以在 APTES 和 GLU 的协助下固定结合在 ELISA PS 表面上的蛋白质或抗体的数量。为了证明检测，我们使用了来自 HIV 的 p24 抗原。与传统ELISA相比，检测限提高了30倍。本研究的进一步发展可能会导致其他传感表面类似的基于化学的改进，并将有助于检测低丰度的不同抗原，这将代表医学诊断的进步。

缩写

APTES：

3-(氨基丙基)三乙氧基硅烷

BSA：

牛血清白蛋白

COOH：

羧基

ELISA：

酶联免疫吸附试验

Fc：

碎片可结晶

GLU：

戊二醛

HIV：

人类免疫缺陷病毒

HRP：

辣根过氧化物酶

IgG：

免疫球蛋白

OD：

一光密度

PEG：

聚乙二醇

附注：

聚苯乙烯

PVLA：

聚乙烯苄基内酯酰胺

TMB：

3,3',5,5'-四甲基联苯胺