使用基于智能手机的阅读器灵敏检测疾病生物标志物的等离子体 ELISA

介绍

急性心肌梗死 (AMI) 是心脏病的医学名称，当流向心肌的血液突然中断，导致组织损伤时，就会发生心脏病发作 [1]。 AMI 的症状包括严重且持续的胸骨后疼痛、心律失常、休克和心力衰竭，这可能是致命的 [2]。 AMI是欧美最常见的疾病之一。仅在美国，每年就有大约 1,500,000 人患有心肌梗塞。近年来，中国也观察到了明显的 AMI 增加趋势，每年至少有 500,000 名新患者。生物标志物的即时检测对于AMI的早期监测和治疗具有重要意义。血清肌红蛋白 (Myo) 在 AMI 后 1-2 小时内增加，并在 6-9 小时达到峰值。 Myo被认为是AMI早期诊断最早的血清标志物之一[3,4,5]。

最近，通过将传统的酶联免疫吸附测定 (ELISA) 和纳米材料相结合，开发了等离子体免疫测定 [6, 7]。等离子免疫分析已广泛应用于临床诊断[8]、环境污染监测[9]和食品安全检测[10]。与其他免疫测定相比，等离子体免疫测定高度灵敏，无需使用精密仪器即可进行肉眼读数。金属纳米粒子，如金和银纳米材料，由于其优异的局域表面等离子体共振 (LSPR)，常用于等离子体纳米传感器。在等离子免疫分析中，酶标抗体催化其底物产生触发纳米材料聚集或形状变化的产物。 Chen 的团队 [11] 报道了一种使用乙酰胆碱酯酶 (AChE) 催化水解反应诱导金纳米粒子 (AuNPs) 聚集的等离子体免疫分析法，用于病原体检测。等离子体免疫测定的灵敏度与 RT-PCR 相当。然而，由于 AuNPs 的聚集过程是动态的，因此在比色测定中稳健、超快速和高度稳定的 AuNPs 聚集仍然是一个挑战 [12, 13]。另一种等离子体免疫测定基于诱导等离子体纳米粒子的形状变化。据报道，基于三角形银纳米棱镜 (AgNPR) 蚀刻的等离子体生物传感器可用于检测癌症生物标志物，该传感器使用葡萄糖氧化酶 (GOx) 产生的过氧化氢 (H2O2) 进行 AgNPR 蚀刻 [14, 15]。然而，为了定量测试分子靶标，需要用于测量纳米材料光谱的相对复杂和笨重的仪器以及等离子体免疫分析。与这些仪器相关的不便使得它们不适用于护理点分析。因此，迫切需要开发一种便携式、廉价且易于使用的等离子体免疫分析仪，用于即时检测（POCT）诊断。

金纳米棒 (AuNRs) 因其独特的物理、光学和电子特性而被广泛应用于生物传感器 [16,17,18]、等离子体成像 [19]、肿瘤光热疗法 [20] 和光动力疗法 [21] [22]。 ,23,24]。在这项工作中，我们报道了一种基于酶介导的 AuNRs LSPR 变化的灵敏等离子体免疫测定法，用于检测 Myo。为了促进 AMI 的 POCT 诊断，我们使用智能手机的环境光传感器 (ALS) 开发了一种新型等离子体免疫分析仪。等离子免疫测定的结果与血清标本传统ELISA的结果之间的高度相关性证明了这种新方法在AMI早期POCT诊断中的应用潜力，尤其是在技术资源有限的地区。

材料和方法

材料和试剂

Myo（来自人类心脏组织）购自 Abcam（英国剑桥）。抗肌单克隆抗体（mAb1 和 mAb2）由我们的实验室生产（附加文件 1）。硝酸银（AgNO3，99.8%）和硼氢化钠（NaBH4）购自 Sinoreagent（中国上海）。过氧化氢（H2O2，30 wt%）和 H2SO4 购自广州市化学试剂厂（中国广州）。发光二极管 (LED, 850 nm) 购自深圳 OCtai Co., Ltd. (Shenzhen, China)。氯金酸 (HAuCl4)、TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）、Tween-20 和十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB) 购自 Amresco（美国德克萨斯州休斯顿）。来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶VII型 (GOx)、VI 型辣根过氧化物酶 (HRP) 和牛血清白蛋白 (BSA) 购自 Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。在整个研究过程中使用电阻率为 18.2 MΩ cm 的去离子水（Milli-Q 级，Millipore）。血清样本来自广州华侨医院（中国广州）。

设备

通过 Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Microplate Reader (Bio-Tek Instruments, Inc. USA) 收集 96 孔板中 AuNR 的 LSPR 光谱。使用 MK3 酶标仪（Bio-Tek Instruments, Inc. USA）在 450 nm 处测量基于 HRP 的 ELISA 的吸光度。 AuNR 的表征使用 PHILIPS TECNAI-10 透射电子显微镜 (TEM) 在 120 kV 的加速电压下运行。用于 TEM 测量的样品是通过将一滴水分散体沉积在涂有碳薄膜的铜网上来制备的，然后通过在空气中蒸发除去溶剂。 3D 打印机购自 SHINING 3D（中国杭州）。华为P9智能手机（中国深圳）被选为等离子体免疫分析仪的基础智能手机。

基于智能手机的等离子体免疫分析仪的设计

基于智能手机的等离子体免疫分析仪的设计是用软件 (Solidworks 2014) 创建的，然后由软件 3D star 处理。对于打印设置，打印模式设置为质量，支持方式设置为内部支持和外部支持。使用免费的智能手机应用程序 Light Meter 在屏幕上显示测量结果。在这项工作中，等离子体免疫分析阅读器在安卓（开源）手机上运行。此阅读器也可以在iPhone上使用，前提是用户应用了iOS版软件（Light Meter）。

AuNRs 的合成

AuNRs 是通过种子金介导的生长制备的 [25]。金种子制备：制备在 0.01 M 氢氧化钠中的新鲜 0.01 M 硼氢化钠。然后，在搅拌 (300 rpm min ^-1 ）。金色种子的颜色从绿色变成了浅棕色。纳米棒的合成：将 AgNO3（70 μL，0.1 M）溶液添加到 0.1 M CTAB 中的 10 mL HAuCl4 溶液（0.5 mM）中。随后，在搅拌 (300 rpm min ^-1 ）。最后，加入 12 μL 金种子，并在搅拌（300 rpm min ^-1 ) 使用前 12 小时。

用于肌检测的基于 AuNRs 的等离子体免疫分析的程序

对于等离子体免疫分析，为了制备具有抗 Myo 抗体 1 (Ab1) 的 96 孔聚苯乙烯板，将稀释的 Ab1 在 96 孔聚苯乙烯板中在 4°C 下孵育过夜。用 PBST 洗涤 3 次后，96 孔聚苯乙烯板用封闭缓冲液（1 mg mL ^-1 PBST 中的 BSA）在 37°C 下保持 1 小时。然后将96孔聚苯乙烯板用洗涤缓冲液洗涤3次，并储存在- 20°C。 GOx标记的抗Myo抗体2（GOx-Ab2）按照附加文件1中的步骤制备。

对于 Myo 检测，将不同浓度的 Myo 溶液（100 μL）添加到 Ab1 包被的 96 孔聚苯乙烯板中。孵育 1 小时后，用 PBST 缓冲液洗涤平板 3 次，然后用 0.01 mg mL ^-1 添加 GOx-Ab2 并在 37°C 下再孵育 1 小时。然后，将板用 PBST 缓冲液洗涤 3 次，加入 50 μL 葡萄糖（0.5 mM）并在 37°C 下孵育 30 分钟。随后，将上清液与含有 AuNR（[Au0] 0.24 mM）、CTAB（12.5 mM）和 HRP（3 μM）的 50 μL 柠檬酸盐缓冲液（40 mM，pH 4.0）混合，孵育 30 分钟。 AuNRs 的相应 LSPR 光谱由商业微孔板读取器收集，AuNRs 的透射光强度 (850 nm) 由基于智能手机的等离子体免疫分析读取器测量。通过将测量的透射光强度与相关的 Myo 浓度进行拟合，构建了用于 Myo 的等离子体免疫测定的校准曲线。为了检测 Myo，使用 PBS 缓冲液将血清样品稀释十倍。然后，将 100 μL 稀释的血清样品添加到 Ab1 包被的 96 孔聚苯乙烯板中。如上所述测试了 Myo 的浓度。每个值代表三个重复的平均值。

基于 HRP 的 ELISA 的程序显示在附加文件 1 中。

数据分析方法

线性回归分析用Origin 9.0处理。所有实验均独立重复 3 次。每个值代表三个重复的平均值。

结果与讨论

基于 AuNRs 的 Myo 检测免疫分析原理

等离子体免疫分析将夹心免疫分析与 AuNRs 的等离子体特性相结合。 Ab1 和 Ab2 与葡萄糖氧化酶 (GOx-Ab2) 结合（图 1）。结合后，GOx 标记的 Ab2 可催化其底物葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢 (H2O2)。 H2O2 作为氧化剂在一定浓度的 HRP 和 Br ⁻ 下蚀刻 AuNRs ，这会导致 AuNRs 的 SPR 光谱发生明显的蓝移，并且 AuNRs 在 850 nm 处的吸光度降低。在等离子体免疫分析中，GOx 的量与目标浓度成正比。 AuNRs SPR 光谱中的蓝移程度和 AuNRs 在 850 nm 处的吸光度降低与目标浓度呈正相关。使用酶标仪测量AuNRs SPR光谱的蓝移或使用智能手机阅读器测量AuNRs在850 nm处的吸光度变化可以确定等离子体免疫测定的结果。

基于AuNRs的等离子免疫检测Myo检测示意图

用于肌检测的等离子体免疫分析的优化

HRP 和 CTAB 浓度直接影响检测结果。在这项工作中，AuNRs 被包含 100 μM H2O2 和不同浓度的 HRP 和 CTAB 的柠檬酸盐缓冲液（40 mM，pH 4.0）的溶液蚀刻，从中记录了 AuNRs 的 LSPR 位移。在这项研究中，由于在这些浓度下观察到的 AuNR 的最大 LSPR 偏移，选择了 1.5 μM HRP 和 6.25 μM C​​TAB（图 2a）。在优化的 HRP 和 CTAB 浓度下，AuNP 被柠檬酸盐缓冲液（20 mM，pH 4.0）中的 100 μM H2O2 蚀刻。 AuNRs 的 LSPR 光谱发生蓝移，并且 AuNRs 在 850 nm 处的吸光度随时间降低（图 2b）。 30 分钟后，AuNR 的 LSPR 稳定。因此，选择 30 分钟作为 AuNR 的 H2O2 蚀刻时间。 AuNPs 被不同浓度的 H2O2 蚀刻。 AuNRs LSPR 光谱随着 H2O2 浓度的降低而蓝移（图 2c）。 AuNRs 的 TEM 图像显示，随着 H2O2 浓度的增加，AuNRs 的形状从矩形变为椭圆形（图 2d-f）。这些结果表明，AuNRs LSPR 光谱依赖于H2O2 的浓度。

基于用于 Myo 检测的等离子体免疫分析的 AuNR 的优化和表征。 一 基于等离子免疫分析的 AuNRs 中 HRP 和 CTAB 浓度的优化。不同颜色的线代表不同浓度的 CTAB，其中 6.25 mM CTAB 和 1.5 μM HRP 是首选。 b 优化 H2O2 蚀刻 AuNR 的时间，其中优选柠檬酸缓冲液（20 mM，pH 4.0）中含有 1.5 μM HRP、6.25 mM CTAB 和 100 μM H2O2 30 分钟。 c 添加了 50 μL 不同浓度的 H2O2 的 AuNR 的 LSPR 光谱。 d –f 用不同浓度的 H2O2（0 μM、10 μM 和 100 μM）蚀刻 30 分钟的 AuNR 的 TEM 图像。 g AuNRs 在不同浓度 GOx 下的 LSPR 位移。 h 在不同稀释比下，在 GOx-Ab2 存在下 AuNRs 的 LSPR 光谱。 我 涂有不同浓度 Myo 的直接等离子体免疫测定中 AuNRs 的 LSPR 光谱位移。每个值代表三个重复的平均值

GOx 可以催化葡萄糖产生 H2O2，H2O2 可以蚀刻 AuNR。在这项工作中，0.5 mM 葡萄糖由不同浓度的 GOx 催化，产生的 H2O2 用于蚀刻 AuNR（图 2g）。当 GOx 浓度为 100 pg mL ^-1 (6.66 × 10 ⁻¹¹ mol L ⁻¹ )，AuNRs 的 LSPR 光谱显示出明显的蓝移，表明基于 AuNRs 的等离子体免疫分析具有高灵敏度。 GOx 与 Ab2 结合，然后稀释到不同的浓度。 GOx-Ab2 的催化活性通过分解的 GOx 和蚀刻的 AuNRs 得到验证。 AuNRs 的 LSPR 光谱随着 GOx-Ab2 浓度的增加发生蓝移（图 2h），这表明 GOx-Ab2 保持良好的催化活性。此外，将 Myo 包被在微孔板上并与 GOx-Ab2 一起孵育。 30 分钟后，GOx-Ab2 用 PBST 缓冲液洗涤 3 次。然后将葡萄糖添加到微孔中，然后在 30 分钟后将 AuNR 添加到葡萄糖溶液中。 AuNRs的LSPR光谱蓝移随着GOx-Ab2浓度的增加而增加（图2i），表明Ab2保持其免疫活性，而GOx保持其催化活性。

用于现场肌检测的基于智能手机的等离子体免疫分析仪

通常报道的等离子体免疫分析由商业酶标仪或光谱仪进行定量解释，这限制了它们在资源有限地区的实用性。为了提高我们的等离子体免疫测定的可访问性，我们准备了一个基于智能手机的等离子体免疫测定阅读器，它依赖于智能手机的环境光传感器 (ALS) 来测量 AuNRs 的透射光强度。在大多数智能手机中，ALS 是默认配置，用于根据各种情况自动调整屏幕的光强。我们之前报道过在比色测定阅读器中使用 ALS [26,27,28]。等离子体免疫测定阅读器的原理和说明在之前的出版物中有所记载 [29]。 3D 打印等离子体免疫分析仪由两部分组成：第 1 部分（100 毫米 × 40 毫米 × 40 毫米）可以固定在智能手机上，以提供由两块电池 (1.5 伏) 供电的稳定光源，第 2 部分 ( 76 mm × 13 mm × 12 mm) 可用于承载微孔。等离子免疫测定完成后，将微孔组装到第 2 部分，如图 3a 所示，然后将第 2 部分固定到第 1 部分。然后将第 1 部分连接到智能手机的 ALS。在此设计中，LED 与智能手机的 ALS 对齐。一旦开关打开，LED 发出的光就会穿过 AuNR 并由 ALS 测量。通过滑动第2部分可以读取每个微孔的透射光强度。通过Android应用程序Light Meter，测量结果可以显示在智能手机的屏幕上。在等离子体免疫分析中，AuNRs 的最大吸收光谱为 850 nm，随着 H2O2 浓度的增加，AuNRs 在 850 nm 处的吸光度逐渐降低。因此，选择 850 nm 作为等离子免疫测定读取器中 LED 激发光的波长。基于智能手机的等离子体免疫分析仪的总成本约为两美元。为了比较基于智能手机的等离子体免疫分析仪的测量结果和商用微孔板读数仪的测量结果，测量了微孔中 AuNRs 的透射光强度和吸光度。从这些设备获得的结果经过拟合并显示出 99.1% 的相关性（图 3b），表明基于智能手机的等离子体免疫测定阅读器在准确性方面是可比的工具。

基于智能手机的等离子体免疫分析阅读器的机制。 一 基于智能手机的等离子体免疫分析仪的 3D 打印附件示意图。 AuNRs 的透射光强度由智能手机的 ALS 测量，并将值显示在屏幕上。 b 基于智能手机的等离子体免疫分析仪的结果与商业酶标仪的结果之间的相关性。每个值代表三个重复的平均值

用于肌检测的等离子体免疫分析的分析性能

对于基于 AuNRs 的等离子体免疫测定的性能，分析了不同浓度的 Myo。 AuNRs的LSPR光谱由商用光谱仪记录，AuNRs的LSPR光谱的透射光强度由基于智能手机的等离子体免疫分析仪测量。随着 Myo 浓度的增加，AuNRs 的 LSPR 光谱发生蓝移，并且 AuNRs 的 LSPR 光谱的吸光度降低（图 4a）。 AuNRs的LSPR蓝移用于Myo浓度的定量分析。当 Myo 浓度为 0 pg mL ^-1 ，AuNRs 的 LSPR 蓝移为 0 nm。随着 Myo 浓度的增加，AuNRs 的 LSPR 峰发生蓝移（附加文件 1：图 S1）。测量的透射光强度用于量化 Myo 的浓度。基于LSPR光谱蓝移定性的等离子体免疫测定法的AuNRs线性检测范围为0.1–1000 ng mL ^-1 （附加文件 1：图 S2-S3）检测限为 57.81 pg mL ⁻¹ . AuNR 的测量透射光强度随着 Myo 浓度的增加而降低（图 4b）。测量的透射光强度用于量化 Myo 的浓度。通过 AuNRs 的透射光强度定量的等离子体免疫分析的线性检测范围为 0.1–1000 ng mL ^-1 （图 4c）检测限为 64.13 pg mL ^-1 . AMI 定义为血清 Myo 浓度高于 90 ng mL ^-1 .为了检测临床样本中的Myo，在分析前将血​​清稀释十倍以提高测量结果的一致性。

用于 Myo 检测的等离子免疫分析。 一 不同Myo浓度下AuNRs的LSPR峰位移。 b 用于检测不同浓度 Myo 的 AuNR 吸光度。 c 基于智能手机的阅读器读取的用于 Myo 检测的等离子体免疫测定校准线。每个值代表三个重复的平均值

等离子免疫测定和ELISA的比较

ELISA是临床诊断中使用最广泛的技术之一。在这项工作中，我们比较了 ELISA 和等离子免疫测定法在 Myo 分析中的检测性能。在两种方法中使用相同的抗体和抗原。 ELISA 的线性检测范围为 25–1000 ng mL ^-1 并且 LOD 为 22.7 ng mL ^-1 （图 5a，附加文件 1：图 S4）。与ELISA相比，等离子体免疫测定法更灵敏，检测范围更广。此外，为了证明使用等离子体免疫测定法进行临床应用的可行性，通过等离子体免疫测定法和 ELISA 测量了临床血清样品中的 Myo。等离子体免疫测定的结果分别由商业微孔板阅读器和基于智能手机的等离子体免疫测定阅读器读取。这两种方法的结果具有良好的相关性（图5b），表明基于AuNRs的等离子体免疫分析可用于临床AMI诊断。

用于 Myo 检测的等离子体免疫分析和常规 ELISA 的比较。 一 用于 Myo 检测的 ELISA 校准线。 b 等离子免疫测定法和常规 ELISA 在检测血清样品中的比较。横轴代表来自 ELISA 的结果，纵轴代表来自等离子免疫测定的结果。每个值代表三个重复的平均值

结论

通过利用 AuNRs 独特的光学特性，我们成功地开发了一种用于检测临床样本中急性心肌梗死的等离子体免疫测定法。为了提高免疫测定在现场测试中的效用，我们准备了一种基于智能手机的等离子体免疫测定阅读器，它依靠智能手机的 ALS 来测量 AuNRs 的透射光强度。智能手机阅读器读取的基于 AuNRs 的等离子体免疫分析的检测限为 0.057 ng mL ^-1 .这种生物传感器比传统的 ELISA 更灵敏，使其成为生物医学应用的有前途的平台。此外，通过使用基于智能手机的等离子体免疫分析仪，生物传感器不需要任何复杂的实验设备，这使得它在资源有限的地区更容易获得。

缩写

Ab1：

抗Myo抗体

Ab2：

抗Myo抗体2

AgNPR：

三角形银纳米棱柱

ALS：

环境光传感器

AMI：

急性心肌梗塞

AuNPs：

金纳米粒子

AuNR：

金纳米棒

ELISA：

酶联免疫吸附试验

GOx：

葡萄糖氧化酶

H2O2 :

过氧化氢

HRP：

辣根过氧化物酶

LSPR：

局域表面等离子体共振

妙：

血清肌红蛋白

POCT：

即时检测