一种用于超灵敏检测癌胚抗原的新型磁弹性免疫传感器

背景

癌症是世界上的致命疾病之一[1]。当血清中肿瘤生物标志物的浓度达到一定量时，就可以临床检测到患者的癌症[2]。因此，对肿瘤标志物进行灵敏、快速、准确的检测是非常必要的，这为癌症的诊断提供了一种有效的策略[3]。癌胚抗原（CEA）属于细胞表面糖蛋白家族，分子量为180～200 kDa。 1965年首次在人结肠癌组织中发现[4, 5]。 CEA 在健康成人的血液中通常含量非常低 (0~5 ng/mL) [6]。通常，CEA 水平异常可能被视为癌症的征兆，例如胃癌 [7]、胰腺癌 [8]、结直肠癌 [9]、肺癌 [10] 和乳腺癌 [11]。这意味着 CEA 可以用作肿瘤生物标志物。监测血液中的 CEA 水平可用于预警、筛查和诊断癌症。同时，CEA还可用于临床治疗后的随访研究。 CEA对肿瘤复发的敏感性超过80%，早于临床和病理检查。因此，CEA的持续观察为疗效的诊断和预后判断提供了重要依据[12]。

生物传感器响应某些学科对生物分子输出可测量信号的特定识别，允许快速响应、高灵敏度和低成本。最近，免疫生物传感器得到了深入研究，如酶免疫测定[13]、氟免疫测定[14]和电化学免疫测定[15,16,17]。由于其优异的特异性和灵敏度，免疫传感器为分析肿瘤生物标志物提供了有前景的手段，即使目标化合物浓度很低[18,19,20,21]。

纳米技术为纳米颗粒 (NPs) 在生物传感技术中的应用提供了新的方法。金属纳米粒子表现出许多特殊的特性，为连接生物识别元件提供了卓越的平台 [22, 23]。基于 NPs 的免疫测定引起了研究人员的极大关注 [24,25,26]。磁弹性生物传感器不受环境温度和pH值的影响，具有高响应灵敏度。因此，在本研究中，我们提出了一种基于金纳米粒子 (AuNPs) 和磁弹性微芯片的磁弹性免疫测定方法。成功开发了一种用于检测CEA生物标志物的免疫传感器。

结果与讨论

鉴于磁致弹性 (ME) 微芯片的带状形状，磁导率沿其长度最大 [27]。初步结果表明，ME 芯片的最佳宽度和厚度分别为 1 mm 和 28 μm [28]。仿真被用来优化芯片的长度，如图1b所示。

ME芯片的最佳长度。 一 相对位移随长度的变化而不同。 b 仿真优化芯片长度

相对位移随图 1a 中长度的变化而不同。在一阶模态分析下，长度为6mm时得到最大相对位移。这意味着理论上最高的灵敏度。因此，本文将芯片的最佳尺寸设计为6 mm × 1 mm × 28 μm。

Nano-ME 生物传感器的示意图如图 2 所示。首先，Nano-ME 芯片用半胱氨酸化学处理，在表面制造自组装分子 (SAM) 膜，作为固定CEAAb。然后，牛血清白蛋白 (BSA) 通过减少非特异性结合和空间位阻来提高 CEAAb 的性能。进行原子力显微镜（AFM）图像以观察芯片的表面形态。如图 3a 所示，SAM 层的厚度为 120 nm。图 3b 中的成像显示，随着粗糙度的增加，CEAAb 共价连接到 SAM 层。图3c清楚地显示出CEA被特异性识别并有效结合，高度约为200 nm，尺寸更大。

Nano-ME生物传感器的构建示意图

SAM 层的 AFM 图像 (a ）。 CEAAb-SAM 层 (b ）。 CEA-CEAAb(c )

在芯片的某个维度中，抗体的浓度是关系到免疫传感器灵敏度的重要因素。因此，有必要评估不同浓度的 CEAAb（20、50、70 和 100 μg/mL，如图 4a 所示）的响应信号。结果表明，当 CEAAb 的浓度为 50 μg/mL 时，在大约 448 Hz 处获得最佳响应（图 4b）。当CEAAb的浓度增加到70 μg/mL时，由于空间位阻和静电排斥反应开始下降[29]。

一 频率响应与 CEAAb 的曲线。 b 频率直方图

原则上，CEA被抗体特异性识别，导致响应频率降低。图 5a 显示了免疫传感器对 CEA 的实时响应曲线。同时，我们获得了图 5b 中的线性拟合曲线。

实时响应 (a ) 和拟合曲线 (b ) 生物传感器与 CEA

通常，传感器的稳定响应是在 40 分钟时实现的（图 5a）。用相应浓度的 CEA 记录共振频率的变化。 Hz 的变化与 CEA 浓度范围从 0.1 到 100 ng/mL (R ² =0.9688），检测限为 2.5 pg/mL（图 5b）。据我们所知，线性范围和检测限明显低于以前的方法[28]。结果表明，成功建立了一种无线的、高灵敏度的CEA检测方法。

结论

在此贡献中，基于 ME 芯片成功开发了一种用于高灵敏度检测 CEA 的 Nano-ME 免疫传感器。 AuNPs和BSA有效地提高了灵敏度和稳定性。所提出的 Nano-ME 免疫传感器表现出从 0.1 到 100 ng/mL 的广泛 CEA 测定范围，具有 2.5 pg/mL 的低检测限。因此，所制备的免疫传感器准确测定了CEA，结果令人满意。受益于其特异性、简单性和可重复性，所提出的平台在非侵入性癌症检测的发展中显示出有前景的应用。

方法

在时变磁场下，ME微芯片沿长度方向振动。在调制磁场使ME微芯片振动的过程中，磁场的能量转化为弹性势能达到最大值。由于带状传感器芯片的形状，沿其长度方向的磁导率最大；因此，除了垂直于传感器基面之外，入射磁场几乎可以从任何方向在传感器中产生纵向振动。由方程给出。 (1):

其中 E 表示弹性模量，v 是泊松比，ρ 是传感器材料的密度，L 是芯片的纵向尺寸。当测试温度、湿度等环境参数恒定时，磁弹性传感器的谐振频率变化灵敏地仅依赖于质量变化(△m ) 在它的表面上，由方程给出。 (2)

基于方程。 (2)、谐振频率的变化与CEA的量成正比。因此，CEA 浓度可以通过频率的变化来实现，其中 f 0 是初始共振频率，M 是初始质量，△m 是质量变化，△f 是传感器谐振频率的偏移。等式 2 表明传感器灵敏度 (△f /△米 ) 与传感器的初始磁弹性质量 (M) 成反比。物理尺寸较小的传感器具有较低的初始质量，从而导致较高的灵敏度。等式中的负号表示频率降低（△f ) 加上非磁弹性质量 (△m ) 在传感器上。因此，目标生物与生物传感器表面的结合导致质量增加，基本共振频率相应降低。

Metglas 合金 2826MB (Fe40Ni38Mo4B18) 的磁弹性基底由 Honeywell Corporation (Morristown, NJ, USA) 加工。 CEA、CEA抗体、牛血清白蛋白（BSA，99%）和磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH =7.4）购自Sangon（中国上海）。丙酮、异丙醇、乙醇、1-乙基-3-碳二亚胺 (EDC) 和 N -羟基磺基琥珀酰亚胺 (NHS) 购自 Sigma-Aldrich Corporation (Saint Louis, MO, USA)。所有其他试剂均为分析纯。超纯水来自 Mill-Q 系统（美国 Milli-pore）。 AFM Park System（ND-100，韩国）、Plasma（P3C，中国上海）、高斯欧姆计（GM500）、ZNB 矢量网络分析仪（R&S，德国）、激光切割机（AV3620A，中国青岛）和 HT20 高斯计（上海恒通）使用。

将合金 ME 基体激光切割成 6 mm × 1 mm × 28 μm 的微芯片，然后用丙酮、异丙醇、乙醇和去离子水超声清洗 5 min，并用氮气干燥。清洁后的微芯片表面改性的活化是通过等离子体方法进行的。在微芯片的两侧溅射铬层（100 nm），然后涂覆 AuNP 层（40 nm）以制造 Nano-ME 芯片。 Nano-ME 芯片用高纯氧 (0.9999) 处理等离子体，然后浸入 40 mM 半胱胺溶液中，并在室温下保持 12 小时。之后，将 Nano-ME 芯片进行生物修饰，并在 1-乙基-3-碳二亚胺 (EDC) 和 N 存在下与不同浓度的 CEAAb 在 37°C 下孵育 1 小时 -羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）。 CEAAb 首先用 10 mg/mL EDC 和 10 mg/mL NHS 激活。最后，经CEAAb修饰的Nano-ME芯片再加入0.1% BSA反应30 min。

Nano-ME 生物传感器的构造如下：玻璃管被线圈包裹并连接到矢量网络分析仪。同时，外加磁场提供交流电，使线圈产生交变磁场。 Nano-ME生物传感器的谐振频率可以通过矢量网络分析仪获得。将不同浓度的 CEA (0–100 ng/mL) 加入试管中，每 5 分钟记录一次频移，直至 40 分钟。之后，用PBS冲洗Nano-ME芯片进行AFM表征。

缩写

原子力显微镜：

原子力显微镜

AuNPs：

金纳米粒子

BSA：

牛血清白蛋白

CEA：

癌胚抗原

CEAAb：

CEA抗体

EDC：

1-乙基-3-碳二亚胺

赫兹：

频率

我：

磁弹性

NHS：

N -羟基磺基琥珀酰亚胺

PBS：

磷酸盐缓冲盐水

SAM :

自组装分子