通过固态纳米孔控制 DNA 易位

介绍

近几十年来，在应用 DNA 测序来读取基因组中的碱基序列方面取得了很大进展 [1, 2]。为了开发个性化药物，研究人员一直在寻求一种更快、更便宜的 DNA 测序方法，在这种方法中，目标药物和药物治疗可以专门应用于个体 [3, 4]。由于纳米孔技术用于DNA检测[5]，被认为是新一代测序的有效方法[6、7]。纳米孔技术是一个很有前途的平台，可以识别 DNA [5] 或 RNA [8] 的高灵敏度单分子检测器。在基本检测方案中，电化学室被带有纳米孔的薄膜分隔成两个储层（顺式和反式隔室）[9]，将导电溶液和电化学室中的分析物连接起来。通过跨膜施加电压，电解质离子流过固态纳米孔并形成孔电流，该电流使用带有相关超灵敏电子设备的膜片钳装置进行测量。当分子或分子复合物通过纳米孔时，分析物可以从纳米孔限定的体积中排除一些离子，这可以通过监测电流的短暂变化来检测。从纳米孔内的停留时间（停留时间）和电流振幅特征，可以获得有关分子的信息。纳米孔测序的空间分辨率由纳米孔的尺寸决定，这表明它可以用作小分子物体的单个传感器，从而产生可检测的电流特征。此外，纳米孔传感器易于集成到高度便携的芯片实验室设备中并实现小型化[10]。

通过纳米孔（例如固态纳米孔 [2, 11] 和蛋白质纳米孔 [2, 7]）进行 DNA 测序已取得重大进展。已经实现了通过蛋白质纳米孔进行 DNA 测序 [7]。然而，蛋白质纳米孔系统在研究生物分子方面存在局限性。与生物/蛋白质纳米孔相比，固态纳米孔的限制更少。这些困难可以通过固态纳米孔来克服。与蛋白质纳米孔相比，它们可以在更宽的温度、电压和溶剂条件范围内发挥作用，并且可以以亚纳米精度调整直径。它们有望应用于下一代DNA测序技术。

已经为 DNA 传感器制造了许多不同材料和结构的固态纳米孔。然而，固态纳米孔无法实现 DNA 测序。对于固态纳米孔传感器，在将其商业应用到 DNA 测序之前，需要克服两个主要障碍，即空间分辨率和时间分辨率。空间分辨率的难点在于固态纳米孔可以区分两个相邻核苷酸之间的微小间距，以实现单碱基分辨率。时间分辨率的障碍是 DNA 易位在电力作用下过快，导致现有膜片钳或其他信号采集系统采集到的有效数据点非常少。这篇小型综述概述了提高固态纳米孔 DNA 检测的空间分辨率和时间分辨率的各种方法。这篇小综述还更多地关注了通过固态纳米孔减缓 DNA 易位的方法。

空间分辨率

2001 年，Li 等人首次报道了氮化硅固态纳米孔。 [12]。各种固态纳米孔已被证明可用于 DNA 分子检测，例如氧化硅 [13]、硅 [14]、Al2O3 [15] 和 HfO2 [16]。虽然固态纳米孔最终可能对化学和机械条件保持稳健，但它们也有一些局限性，例如空间分辨率低。由于材料的厚度，几十个碱基一次可以通过固态纳米孔。目前最薄的氮化硅纳米孔为3 nm，仍无法区分四种基体[17]。

有趣的是，单层二维 (2D) 材料的厚度约为 3.0–11.0 Å，这与沿 ssDNA 的两个相邻核苷酸之间的间距 (3.2–5.2 Å) 相当 [18]。二维膜，例如石墨烯 (3.4 Å [19])、MoS2 (6.5 Å [18])、WS2 (7 Å [20]) 和 h-BN (11 Å [21])，已被证明可以检测 DNA 易位 [21,22,23]，因为它们具有高信噪比和空间分辨率。从它们的空间分辨率可以清楚地看出，这些材料可用于 DNA 检测。此外，可重复生长技术和大规模转移程序使得在二维膜中大规模制造亚纳米孔成为可能。

石墨烯是排列成二维蜂窝晶格的碳原子薄片[24]。研究人员已经证明，可以用石墨烯纳米孔检测和表征溶液中的​​单个 DNA 分子 [22, 25]。然而，DNA核苷酸与石墨烯之间存在很强的疏水相互作用，DNA会严重堵塞并粘附在石墨烯纳米孔上，这会显着影响易位速度[26]。用亲水基团[26]修饰或涂覆在石墨烯上的亲水材料[25]可以提高石墨烯的亲水性并避免DNA粘附在其表面。遗憾的是，无论是亲水基团的修饰还是亲水材料的包覆都会增加悬浮膜的厚度，导致纳米孔的厚度增加，从而降低石墨烯的空间分辨率。

层状过渡金属二硫属化物是另一种二维材料，包括 MoS2 [18, 27] 和 WS2 [20]。当 DNA 易位通过二硫化钼纳米孔膜时，检测到高信噪比 (SNR> 10) 和离子电流信号的五倍增强 [18]。同时，MoS2 是亲水性的，因此不需要特殊的表面处理来避免 DNA 与其表面之间的疏水相互作用。另一种材料 WS2 的直接带隙为 2.1 eV [28]，其光致发光 (PL) 发射强度强于经过充分研究的 MoS2 [29]。丹达等人。 [20] 制备了 WS2 纳米孔并证明了使用短光脉冲实现原子控制纳米孔尺寸的实现，这可能对用于 DNA 检测的固态纳米孔产生积极影响。

此外，刘等人。 [21] 报道了第一个通过 h-BN 纳米孔进行 DNA 易位的实验。与石墨烯类似，h-BN 的亲水性较差，会导致 DNA 堵塞纳米孔。随后，周等人。 [23]利用紫外线臭氧处理后h-BN材料的抗氧化性和完整性，成功提高了h-BN纳米孔的亲水性。 h-BN 的绝缘特性在高离子强度溶液中比在石墨烯中表现出更显着的耐久性和绝缘性能。在超薄纳米孔结构上实现单碱基分辨率是一个有竞争力的候选者。

二维材料的使用可能会增加设备的空间分辨率，以实现单核苷酸分辨率。尽管已经报道了几种二维材料的DNA检测实验，但没有人报道固态纳米孔DNA测序的成就。纳米孔测序的时间分辨率也是一个挑战。

时间分辨率

通过固态纳米孔的 DNA 易位速度非常快，高达 0.01–1 μs/碱基 [30]，导致商业膜片钳收集的有效数据非常少。因此，不可能基于封锁电流信号区分每个碱基。石墨烯、MoS2、WS2 和 h-BN 等二维材料的固态纳米孔的 DNA 易位速度如图 1 所示。理想情况下，纳米孔中的 DNA 易位速度应为 1-100 bp/ms能够令人满意地记录每个核苷酸的信号[32]。

二维固态纳米孔的 DNA 易位速度 [18、20、21、22、23、25、27、31]。红色虚线表示DNA易位率为100 bp/ms

在此背景下，减缓DNA的易位速度是众多研究者追求的重要目标。已经开发了各种方法来减缓 DNA 易位，以提高固态纳米孔检测的时间分辨率。通常的方法是通过改变纳米孔的温度[33]、电解质粘度[27]、驱动电压[34]、离子浓度[35]、表面电荷密度[36]等实验因素的影响来改变DNA通过它易位。瓦努努等人。 [33] 专注于通过改变温度、电压和 DNA 长度来减缓 dsDNA 通过固态纳米孔的易位。此外，冯等人。 [27] 表明基于室温离子液体的粘度梯度系统可用于通过 MoS2 纳米孔控制 DNA 易位的动力学，并证明室温离子液体的高粘度提供了最佳的单核苷酸易位速度为 373 bp/ms。

尽管许多方法具有降低 DNA 易位速度和促进离子电流检测的潜力，但它们仍然不能满足 DNA 测序的要求。因此，有必要开发更激进的方法来控制 DNA 通过纳米孔的通道。在这里，我们讨论了控制纳米孔结构和定量 DNA 运动以提高时间分辨率的方法。

两个纳米孔系统

研究人员使用双纳米孔系统来操纵DNA分子易位，可以可控地多次检测同一分子。两个堆叠的纳米孔被一个微米大小的腔室隔开 [37]（图 2a），可以在一定时间内捕获 DNA 分子并可控地释放它们。 DNA分子的动力学可以通过相关分析从两个孔的信号中推导出来，这为易位提供了直接的电证据。此外，由于两层纳米孔系统的熵势垒，可以限制DNA分子的布朗运动，从而可以提高纳米孔DNA测序的准确性。与单分子传感技术相比，DNA分子在两层纳米孔系统中可以通过连续排列多个孔而不是来回穿过单个孔来进行多次测量[39]。

一 用于纳米孔 DNA 检测的两层纳米孔系统示意图 [37]。 b 用于纳米孔DNA检测的双纳米孔系统示意图[38]

双纳米孔系统提供了另一种控制分子传输和有效桥接两个孔之间的分子的方法；它们是一种用于 DNA 操作的无标签机械方法 [40]。在双纳米孔系统中，同一固态膜中有两个可独立寻址且相邻的纳米孔。在 DNA 分子通过其中一个纳米孔的电泳驱动通道期间，单个 DNA 分子可以被捕获到两个孔中，导致两个纳米孔之间的“拔河”[38]（图 2b）。因此，对 DNA 分子的不同末端施加力，这会减慢甚至完全阻止其运动。双纳米孔系统为在固态纳米孔中机械捕获 DNA 开辟了一条新途径，它是一种测量范围广泛的生物分子的有前途的技术，具有无标记和高信号的优点。噪声比和低成本。它可以有效地限制和捕获DNA分子以减缓DNA易位，也可以用于研究这种纳米级DNA拔河的物理过程[41]。

光阱纳米孔

光阱纳米孔允许光镊捕获尺寸小于几十纳米的粒子。它使蛋白质 [42]、DNA 片段 [43] 和其他生物分子 [44] 以及小病毒 [45] 的光学捕获成为可能。光阱纳米孔背后的基本理论是自诱导反作用光阱[46]。聚焦在纳米孔阵列区域的激光束将在孔中金属层的边缘形成高功率密度的局部光场。当粒子在局部光场之间移动时，它会导致局部光传输发生很大变化，这反过来又会对粒子产生很大的光学和介电力。双纳米孔结构用于打破捕获颗粒的尺寸瓶颈。穆罕默德等人。 [47] 证明了具有 20 纳米二氧化硅和金纳米颗粒的光阱纳米孔的潜在用途。将双纳米孔的哑铃形状磨成金膜，在双纳米孔中间的悬浮的SixNy膜上钻出一个25nm的纳米孔，如图3a所示。电泳力驱动纳米颗粒通过纳米孔，当通过孔的边缘时，双纳米孔尖端之间存在的自感应反作用等离子体力与电泳力相反，降低了纳米颗粒的速度。结果表明，光捕获将电泳易位时间延长了四个数量级。金等人。 [43]利用单个纳米孔的纳米等离子体结构实现了质粒DNA和λDNA的光学捕获。该技术在DNA检测方面具有潜在应用，可以设置多个局部光场实现并行检测。然而，高频离子电流振荡可能会影响DNA的电流检测结果。这可能是由于电泳和自诱导反作用力之间的竞争导致纳米颗粒在纳米孔口中上下浮动。

一 光阱纳米孔芯片示意图 [47]。 b 自诱导反作用系统示意图

光学镊子

光镊可用于通过纳米孔控制分子易位，近年来已被普遍使用。 2006 年，Keyser 等人。 [48] 通过应用光镊控制通过 SiNx 纳米孔的 DNA 易位，首先证明了电泳力和机械力之间的分子拉锯战。这个系统就像一个简单的虎克弹簧，珠子上的张力可以根据虎克定律计算：F ot=-k 陷阱Z ，其中 F ot 是光学力，k trap 是沿位移方向的陷阱刚度，Z 是珠子的线性变形 [48]。光镊方法在聚焦激光束的交叉中捕获 DNA 拴聚苯乙烯珠，可以在三个维度上操纵 DNA 拴聚苯乙烯珠，并具有皮牛顿范围的力灵敏度，如图 4a 所示。 .为了将易位 DNA 捕获在纳米孔内，调整张力以平衡电场力 (F el) 在 DNA 上。因此，张力可用于降低 DNA 易位的速度并将 DNA 分子拉出纳米孔 [52]。该系统允许对核酸和蛋白质进行同步空间采样和高分辨率力测量，这在 DNA 测序方面取得了重大进展。然而，光镊技术存在几个基本困难。首先，难以放大到大量纳米孔。其次，激光在光镊中引起的加热对通过纳米孔的离子电流和噪声水平产生强烈影响，需要光学捕获的珠子距离纳米孔几微米[53]。

一 用于纳米孔 DNA 检测的光镊示意图 [48]。当光镊系统处于平衡状态时，光力（Fot）等于电场力（Fel）。 b 用于纳米孔 DNA 检测的磁性镊子示意图 [49]。当磁镊系统处于平衡状态时，磁力（FMt）等于电场力（Fel）。 c 用于纳米孔 DNA 检测的 AFM 示意图 [50]。 d TFFS用于纳米孔DNA检测的示意图[51]

磁性镊子

磁性镊子提供了另一种通过张力控制 DNA 易位的方法，并且已经证明磁性镊子技术可有效减缓 DNA 易位 [49]。在这个系统中，如图 4b 所示，DNA 分子可以使用强金-硫醇 [54] 或链霉亲和素-生物素 [49] 相互作用连接到微米大小的磁珠上。然后，DNA 的自由端可以通过施加的电场被捕获在纳米孔中。随后，可以使用两个具有小间隙的磁铁来产生磁场梯度。这种技术可以平衡被捕获的 DNA 上的电力，以降低易位速度甚至反向电泳。与光镊相比，磁性镊子是大规模平行力谱的有希望的候选者。在这个系统中，数百个珠子和 DNA 分子可以同时控制在数百个纳米孔内，这很容易扩展到许多可寻址的纳米孔。这可以将分析过程加快几个数量级。然而，与光镊相比，磁镊方法的一个明显缺点是缺乏对分子的三维控制[55]。

力传感探头

尽管通过光镊和磁镊在控制 DNA 易位速度方面取得了重大进展，但磁珠捕获方法存在布朗运动的问题，难以控制分辨率小于 10 纳米的磁珠的运动 [51] .为了克服这一点，AFM 已被用于控制 DNA 易位的速度 [50]，并且它还可以同时测量力和阻滞电流。在使用该系统的一项研究中，如图 4c 所示，DNA 被拴在 AFM 探针的尖端，然后被夹在探针支架中。通过控制探针的运动，可以控制DNA易位以降低其速度甚至反向电泳。此外，通过将尖端缩回到表面上方对应于分子长度的高度，可以重复测量。在 AFM 的帮助下，DNA 检测在实践和理论方面都取得了进步，因为检测分辨率可以通过封锁电流和 AFM 力测量的组合信号来大大提高 [56]。然而，纳米孔技术在 DNA 检测中的应用仍然存在一个障碍，即当 DNA 分子以相对无摩擦的方式滑过纳米孔。这些波动归因于单个核苷酸以类似旋转门的运动穿过纳米孔 [50]。

研究表明，音叉可用作力检测传感器，可以控制 DNA 以亚纳米速率穿过纳米孔 [51, 57]。在使用这种集成装置的研究中，如图 4d 所示，DNA 分子连接到探针尖端，探针尖端粘在音叉的一个尖头上。使用具有亚纳米精度的纳米定位系统来固定音叉 [51]。探针尖端的位置可以通过基于音叉的反馈力传感器进行感知，并通过操纵纳米定位系统进行控制。这种移动速度比光镊操作的 DNA 慢 10 倍，比自由通过固态纳米孔的 DNA 慢 1000 倍 [57]。与传统的原子力显微镜相比，音叉可以提供更快的扫描运动，并在浸入液体中时具有较高的力灵敏度。通过将TFFS与纳米孔结合，可以在DNA分子通过纳米孔的过程中同时测量通过纳米孔的离子电流、尖端位置和尖端振动幅度。

Si 探针

上述所有方法，即磁镊、光镊、AFM 和 TFFS，都需要扫描纳米孔位置。他们必须将纳米孔定位在 DNA 的有效长度内，以确保 DNA 可以通过纳米孔。纳米孔寻址是这些方法的重要组成部分，但很难 [32] 将 DNA 连接到硅探针的大表面（图 5），大于芯片的面积，这意味着它们可以轻松地将固定的 DNA 插入到纳米孔，无需扫描膜中纳米孔的位置。已经证明了使用固定 DNA 的 Si 探针和位置控制器来控制 DNA 进出纳米孔的运动的可行性。这种方法的难点在于将Si探针浸入溶液中，通过肽偶联与DNA相连。探针表面DNA密度难以控制，容易出现多个DNA同时通过纳米孔，影响检测电流。

用于纳米孔DNA检测的DNA固定Si探针系统示意图[32]

光镊、磁镊、原子力显微镜（AFM）和基于音叉的力传感（TFFS）可以检测纳米孔中分子的实际作用力和位置，有望以适当的速度控制DNA通过纳米孔。使用 Si 探针避免了处理纳米孔的困难。此外，使用双纳米孔系统是控制和减缓 DNA 通过纳米孔的可行方法。此外，光阱纳米孔在未来具有用于 DNA 检测的潜力。在这里，我们总结了与一些 DNA 控制方法相结合的固态纳米孔的 DNA 易位速度，例如双纳米孔系统、光阱纳米孔、光镊、磁镊、AFM、TFFS 和 Si 探针（表 1） .

结论

单层二维材料，如石墨烯、MoS2、WS2 和 h-BN，可能是可实现的最薄材料，因为它们与核苷酸之间的间距一样厚。与传统的固态纳米孔膜相比，单层二维膜是纳米孔器件的理想选择，因为它们具有高离子电流信噪比和相对较大的传感区域。它们有可能通过与光镊、磁镊、AFM、TFFS、Si 探针、双纳米孔系统或光阱纳米孔相结合来实现 DNA 测序。然而，这些技术带来了一些挑战，需要在纳米孔 DNA 测序商业化之前解决。第一个发生在珠子或探针尖端靠近纳米孔时，此时更难用离子电流信号区分 DNA 核苷酸。应使用分子柄或其他更长的分子来增加 DNA 链的长度，以抵消珠子或尖端对电流信号的影响。其次，应采用纳米孔阵列来实现高通量并行检测，但目前并行检测技术还不够成熟。第三，按照目前的制备方法，难以制备出高精度和重现性高的双纳米孔系统和光阱纳米孔系统，这对纳米孔DNA检测具有重要意义。氦离子束可能是解决这个问题的关键技术[11, 58]。因此，我们预计 DNA 纳米孔测序将继续成为研究重点，并可以与更多新思想和创新方法相结合，实现低错误率、快速和高并行记录以及长达 100 千碱基的长读长。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在这篇已发表的文章中。

缩写

二维：

二维

3D：

三维材料

TMD：

层状过渡金属二硫属化物

信噪比：

信噪比

PL：

光致发光

SIBA：

自我诱发的反作用

原子力显微镜：

原子力显微镜

TFFS：

基于音叉的力传感