优化固态纳米孔中DNA易位以提高测序准确性

摘要

与生物纳米孔相比，固态纳米孔在商业化DNA测序应用前仍面临多项挑战。空间分辨率低和时间分辨率低是两大核心难题。受限于纳米孔长度和固态纳米孔表面特性，空间分辨率仍有提升空间；而在电场驱动下DNA易位速度过快，导致有效数据点极少，限制了时间分辨率。若能有效控制DNA易位速度，固态纳米孔的时间分辨率将显著提升。本文简要综述了提升空间分辨率的方法，重点探讨了通过可控手段提高纳米孔检测分辨率的策略，并展望了纳米孔DNA测序的发展前景。

引言

近几十年来，DNA测序技术在读取基因组碱基序列方面取得长足进步。为发展个性化医疗，研究者致力于寻找更快、更廉价的测序方法，以实现针对个体的靶向用药和治疗。自纳米孔技术被用于DNA检测以来，被视为下一代测序的有效途径。该技术是识别高灵敏度单分子DNA或RNA探测器的有前景平台。基本检测方案中，电化学池通过一根带有纳米孔的薄膜分为顺式和反式两个储液池，纳米孔连接电化学池中的导电溶液和待测分析物。施加跨膜电压后，电解质离子穿过固态纳米孔形成孔道电流，利用钳夹装置及超灵敏电子器件进行测量。当分子或分子复合物通过纳米孔时，会排除纳米孔体积内的部分离子，通过监测电流的短暂变化即可检测。利用分子在纳米孔内的驻留时间和电流幅度特征，可获取分子信息。纳米孔测序的空间分辨率取决于纳米孔尺寸，意味着其可作为小分子物体的单一传感器，产生可检测的电流特征。此外，纳米孔传感器易于集成到高度便携的芯片实验室设备中并实现微型化。

纳米孔DNA测序取得显著进展，包括固态纳米孔和蛋白纳米孔。蛋白纳米孔已实现DNA测序，但受限于研究生物分子的条件。固态纳米孔限制较少，可在更宽温度、电压和溶剂条件下工作，且孔径可亚纳米精度调控，极具下一代DNA测序应用潜力。

尽管已制备多种材料和结构的固态纳米孔用于DNA传感，但固态纳米孔尚未实现DNA测序。商业化应用前需攻克空间分辨率和时间分辨率两大障碍：空间分辨率难点在于区分相邻核苷酸的微小间距以实现单碱基分辨；时间分辨率瓶颈在于电场驱动下DNA易位过快，现有钳夹或信号采集系统仅能获取极少有效数据点。本文综述了提升固态纳米孔DNA检测空间与时间分辨率的各类方法，重点探讨减缓DNA易位的策略。

空间分辨率

2001年，Li等首次报道氮化硅固态纳米孔。此后，二氧化硅、硅、Al₂O₃、HfO₂等材料制备的固态纳米孔均展示了DNA分子检测能力。尽管固态纳米孔在化学和机械性能上更稳健，但空间分辨率低是其局限。受材料厚度限制，数十个碱基可同时通过纳米孔。目前最薄氮化硅纳米孔达3 nm，仍无法区分四种碱基。

二维（2D）材料单层厚度约3.0–11.0 Å，与单链DNA相邻核苷酸间距（3.2–5.2 Å）相当。石墨烯（3.4 Å）、MoS₂（6.5 Å）、WS₂（7 Å）、h-BN（11 Å）等二维膜因高信噪比和空间分辨率，已证实可检测DNA易位。成熟的生长技术和大规模转移工艺使亚纳米孔在二维膜上大规模制备成为可能。

石墨烯是碳原子构成的二维蜂窝晶格单原子层。研究证实石墨烯纳米孔可检测和表征溶液中单个DNA分子。但DNA核苷酸与石墨烯存在强疏水相互作用，导致DNA严重堵塞和粘附，显著影响易位速度。通过亲水基团修饰或包覆亲水材料可改善石墨烯亲水性，防止DNA粘附，但会增加悬浮膜厚度，降低空间分辨率。

层状过渡金属二硫化物（如MoS₂、WS₂）是另一类二维材料。DNA穿过MoS₂纳米孔时检测到高信噪比（SNR > 10）和五倍离子电流信号增强。MoS₂亲水，无需特殊表面处理即可避免疏水相互作用。WS₂具有2.1 eV直接带隙，光致发光（PL）比MoS₂更强。Danda等利用短光脉冲实现WS₂纳米孔原子级尺寸控制，对固态纳米孔DNA检测有积极意义。

Liu等首次报道DNA通过h-BN纳米孔易位实验。h-BN疏水性差，易导致DNA堵塞。Zhou等利用紫外臭氧处理改善h-BN纳米孔亲水性，发挥其抗氧化性和完整性优势。h-BN的绝缘特性在高离子强度溶液中比石墨烯表现出更优异的耐久性和绝缘性，是超薄纳米孔结构实现单碱基分辨率的有力竞争者。

二维材料有望将器件空间分辨率提升至单核苷酸级别。虽有多种二维材料DNA检测实验报道，但尚无固态纳米孔DNA测序成功案例。时间分辨率仍是挑战。

时间分辨率

固态纳米孔中DNA易位速度极快，达0.01–1 μs/碱基，商业钳夹采集的有效数据极少，无法根据阻塞电流信号区分每个碱基。二维材料（石墨烯、MoS₂、WS₂、h-BN）固态纳米孔的DNA易位速度如图1所示。理想情况下，纳米孔中DNA易位速度应为1–100 bp/ms，以满意记录每个核苷酸信号。

针对这一背景，减缓DNA易位速度成为众多研究者追求的重要目标。已开发多种方法通过改变实验因素（温度、电解质粘度、驱动电压、离子浓度、纳米孔表面电荷密度）来减缓DNA易位。Wanunu等通过调节温度、电压和DNA长度减缓dsDNA易位。Feng等展示了基于室温离子液体的粘度梯度系统可控制DNA在MoS₂纳米孔中的动力学，高粘度离子液体提供了373 bp/ms的最优单核苷酸易位速度。

尽管许多方法有潜力降低DNA易位速度并促进离子电流检测，但仍难满足DNA测序要求。因此需开发更根本的方法控制DNA通过纳米孔。本文讨论通过控制纳米孔结构和定量DNA运动来提高时间分辨率的方法。

双纳米孔系统

研究者利用双纳米孔系统操控DNA分子易位，可控重复检测同一分子。两个堆叠纳米孔由微米级腔室隔开（图2a），可捕获DNA分子一段时间并可控释放。通过两孔信号相关分析可推导DNA动力学，提供易位的直接电学证据。双层纳米孔系统的熵能垒可限制DNA布朗运动，提高测序准确性。与单分子传感技术不同，双层系统通过串联多孔而非单孔往复，可多次测量同一DNA分子。

双纳米孔系统提供控制分子运输和高效连接两孔分子的新方法，是一种无标记DNA操控机制。同一固态膜上两个独立可寻址的相邻纳米孔中，DNA分子电泳驱动通过其中一个纳米孔时，可被同时捕获到两个孔中，形成两孔间的“拔河”状态（图2b）。因此，DNA两端受力减缓甚至完全停止运动。双纳米孔系统为固态纳米孔机械捕获DNA开辟新路径，具备无标记、高信噪比、低成本优势，可高效限制和捕获DNA分子减缓易位，也可研究纳米尺度DNA拔河物理过程。

光学陷阱纳米孔

光学陷阱纳米孔利用光学镊子捕获数十纳米以下颗粒，实现蛋白质、DNA片段、其他生物分子及小病毒的光学捕获。基本原理是自感应背作用光学陷阱。聚焦激光束在纳米孔阵列区域形成孔洞金属层边缘的高功率密度局域光场。颗粒移动通过局域光场时，导致局域光透射率大幅变化，产生巨大光学和介电力。双纳米孔结构打破捕获颗粒尺寸瓶颈。Muhammad等演示了光学陷阱纳米孔对20 nm二氧化硅和金纳米颗粒的潜在应用。哑铃状双纳米孔铣刻于金膜，25 nm纳米孔穿过悬浮SiₓNᵧ膜位于双纳米孔中间（图3a）。电泳力驱动纳米颗粒穿过纳米孔，通过孔洞边缘时，双纳米孔尖端间的自感应背作用等离子体力对抗电泳力，降低颗粒速度。结果显示光学捕获将电泳易位时间延长四个数量级。Kim等利用单纳米孔纳米等离子体结构实现质粒DNA和λ-DNA光学捕获。该技术在DNA检测有潜在应用，多个局域光场可实现并行检测。但高频离子电流振荡可能影响DNA电流检测结果，可能因电泳力与自感应背作用力竞争导致纳米颗粒在纳米孔口上下浮动。

光学镊子

光学镊子常用于控制分子通过纳米孔易位。2006年Keyser等首次演示利用光学镊子控制DNA通过SiNₓ纳米孔易位，实现电泳力与机械力的分子拔河。该系统表现为简谐弹簧，根据胡克定律计算微珠张力：Fₒₜ = -kₜᵣₐₚZ。光学镊子捕获DNA系聚苯乙烯微珠于聚焦激光交叉处，可三维操控微珠，具皮牛顿级力灵敏度（图4a）。为捕获纳米孔内易位DNA，调节张力平衡DNA上的电场力（Fₑₗ）。张力既可减缓DNA易位速度，也可将DNA从纳米孔拉出。该系统允许同时进行核酸和蛋白质的空间采样和高分辨力测量，在DNA测序取得显著进展。但光学镊子技术存在根本困难：难以扩展到大量纳米孔；激光加热严重影响纳米孔离子电流和噪声水平，要求光学捕获微珠距纳米孔数微米远。

磁镊子

磁镊子提供另一种通过张力控制DNA易位的方式，已证实能有效减缓DNA易位。系统中（图4b），DNA通过金-硫醇或链霉亲和素-生物素强相互作用连接微米级磁珠。DNA自由端在电场作用下被捕获入纳米孔。两个小间隙磁铁产生磁场梯度，平衡被捕获DNA上的电场力，降低易位速度甚至反向电泳。相比光学镊子，磁镊子是大规模并行力谱的有力候选，可同时控制数百个微珠和DNA分子在数百个纳米孔中，易于扩展到多可寻址纳米孔，分析速度提升数量级。但明显劣势是缺乏分子三维控制能力。

力感应探针

尽管光学镊子和磁镊子在控制DNA易位速度上取得显著进展，但微珠捕获方法存在布朗运动问题，难以实现10 nm以下分辨率控制微珠运动。原子力显微镜（AFM）被用于控制DNA易位速度，可同时测量力和阻塞电流。研究中（图4c），DNA系于AFM探针尖端并夹持在探针架上。控制探针运动可减缓DNA易位速度甚至反向电泳。将探针收回至对应分子长度的高度可重复测量。AFM辅助下，阻塞电流和AFM力测量联合信号大幅提升检测分辨率，推动DNA检测实践和理论进展。但仍存在障碍：DNA在相对无摩擦情况下滑过纳米孔时，力（和电流）每0.35–0.72 nm出现周期性规律波动，归因于单个核苷酸以转盘式运动通过纳米孔。

研究表明音叉作为力检测传感器，可控制DNA以亚纳米速率通过纳米孔。集成装置中（图4d），DNA连接粘于音叉一支叉的探针尖端。具亚纳米精度的纳米定位系统固定音叉。探针尖端位置由音叉反馈力传感器感知，通过操控纳米定位系统控制。该运动速度比光学镊子操控DNA慢10倍，比DNA自由通过固态纳米孔慢1000倍。相比传统AFM，音叉在液体中具备更快扫描运动和高力灵敏度。将TFFS与纳米孔结合，可在DNA通过纳米孔过程中同时测量纳米孔离子电流、尖端位置和尖端振动幅度。

硅探针

上述磁镊子、光学镊子、AFM、TFFS均需扫描纳米孔位置，必须在DNA有效长度内定位纳米孔确保DNA通过。纳米孔寻址是重要但困难的环节。研究者将DNA连接在大面积硅探针表面（图5），面积大于芯片面积，可轻松将固定DNA插入纳米孔无需扫描膜上纳米孔位置。已验证DNA固定硅探针和位置控制器控制DNA进出纳米孔运动的可行性。难点在于硅探针浸没溶液中并通过肽偶联连接DNA，探针表面DNA密度难以控制，易导致多条DNA同时通过纳米孔影响检测电流。

光学镊子、磁镊子、AFM、TFFS可检测纳米孔中分子实际受力和位置，有望以适当速度控制DNA通过纳米孔。硅探针规避了纳米孔寻址难题。双纳米孔系统也是控制和减缓DNA通过纳米孔的可行方法。光学陷阱纳米孔在未来DNA检测中具有潜力。表1总结了固态纳米孔结合双纳米孔系统、光学陷阱纳米孔、光学镊子、磁镊子、AFM、TFFS、硅探针等DNA控制方法的DNA易位速度。

结论

单层二维材料（石墨烯、MoS₂、WS₂、h-BN）可能是最薄可实现材料，其厚度与核苷酸间距相当。相比传统固态纳米孔膜，单层二维膜展现高离子电流信噪比和相对较大感应区，是纳米孔器件理想选择。结合光学镊子、磁镊子、AFM、TFFS、硅探针、双纳米孔系统或光学陷阱纳米孔，有望实现DNA测序。但这些技术仍面临挑战：微珠或探针尖端靠近纳米孔时，离子电流信号更难区分DNA核苷酸，需用分子手柄或更长分子抵消微珠或尖端对电流信号的影响；纳米孔阵列实现高通量并行检测技术尚不成熟；现有制备方法难以高精度、高重复性制造双纳米孔系统和光学陷阱纳米孔系统，氦离子束可能是关键技术。预期DNA纳米孔测序将持续成为研究热点，融合更多新理念和创新方法，实现低错误率、快速高并行记录、高达100 kb的长读长。