可生物降解、肿瘤响应型纳米粒子实现双模态乳腺癌成像

摘要

气体填充超声（US）造影剂在体内易塌陷、气体易溢出，限制了US成像效果。为解决此问题，开发了一种可注射气体生成多模态系统，携带MRI负性造影剂Fe₃O₄、荧光染料Cy5.5和CO₂释放给体（Na₂CO₃）。纳米粒子可在体内酸性肿瘤组织持续生成二氧化碳（CO₂）气体，使肿瘤在超声成像下产生强回波信号。此外，纳米粒子赋予肿瘤组织优异的MRI和荧光成像效果。结果表明该pH响应NP系统在MRI/US/荧光成像中效果良好。本研究为多模态肿瘤成像提供有益参考。

引言

临床实践中，微气泡主要作为超声造影剂用于各器官和血管实时成像[1-3]。传统超声造影剂通常由脂质或蛋白质包裹空气或全氟碳气体。微球内封装气体在血液中稳定性低、半衰期短，因微气泡缺陷快速扩散[4-6]。此外，气体填充微气泡粒径通常较大（约1-8 μm），难以通过组织渗漏渗透进宿主肿瘤微环境。因此微米级气泡在血管内成像应用受限[7]。理想超声造影剂通常应具备：适合组织血管空间转运的最佳尺寸、足够声学效应持续时间、良好靶向性和生物相容性、易从体内排出[8, 9]。“气体生成纳米粒子”概念前人研究中提出，此类纳米粒子有潜力用于超声造影成像[10-12]。气体生成纳米粒子性能优于当前气体填充微气泡，持续生成气体实现强超声成像。气体生成纳米粒子可增强渗透滞留效应，可稳定循环血液中并有效富集肿瘤组织[13, 14]。

传统成像方法如磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、超声，受限于采集时间长、辐射剂量高、灵敏度差，难以检测微小隐匿肿瘤[15, 16]。有必要整合不同成像方法开发多模态成像技术，实现癌症早期检测的协同增效[17-19]。超顺磁性氧化铁（Fe₃O₄）纳米粒子可作为T2加权成像MRI负性造影剂[20, 21]。Fe₃O₄具吸引人整体性质：粒径小、穿透力强、高磁化率、代谢好、相对低毒性[22, 23]。Fe₃O₄造影剂用于早期癌症MRI诊断因高弛豫和对比度被广泛研究[24-26]。此外实时荧光成像分辨率优异，可作为确定肿瘤分期、引导肿瘤切除、监测治疗效果的有价值方法[27, 28]。

本文纳米粒子主要由聚（乳酸-共-乙酸）酸（PLGA）封装，PLGA经美国食品药品监督管理局（FDA）批准作为生物安全材料[29, 30]。PLGA颗粒修饰RGD肽使其能结合乳腺癌细胞表面αvβ3整合素，修饰Cy5.5作为荧光染料用于体内成像，封装Fe₃O₄作为MRI T2负性造影剂（方案1a）。因肿瘤组织上调糖酵解产生更多乳酸和质子，肿瘤组织pH（6.8-7.2）低于正常组织（pH 7.4）[31-33]。故在PLGA中设计碳酸钠（Na₂CO₃）在肿瘤组织较低pH下产生CO₂气泡用于超声成像。为验证其肿瘤成像应用前景，系统表征多模态纳米粒子体外成像综合性能，包括细胞毒性、靶向特异性、肿瘤组织生物分布，通过三种成像模式。

结果与讨论

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs合成与表征

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs设计为RGD靶向多模态造影剂，通过可生物降解化学键在生物相容聚合物PLGA中封装Fe₃O₄和Na₂CO₃及整合素靶向剂（方案1b）。

透射电镜图像显示Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs为清晰球形，壳层中均匀分散氧化铁颗粒可见（图1a）。动态光散射测得平均流体动力学尺寸117.6 nm，平均多分散指数0.234（图1b）。Zeta电位测得表面电荷-21.7 mV（图1c）。荧光光谱显示最大发射波长685 nm，表明Cy5.5成功封装于PLGA核中（图1d）。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD和游离Fe₃O₄ NPs饱和磁化值分别为32.6和42.5 emu/g（图1e），表明纳米粒子室温超顺磁特性。FTIR光谱显示N-H伸缩振动和-OH吸收峰出现在3432 cm⁻¹附近。此外发现C=O伸缩振动增强（1628 cm⁻¹）。与非靶向NPs相比，靶向NPs羧基特征峰（1735 cm⁻¹）显著降低，显示微球表面羧基与RGD肽氨基结合。体外Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs结合见图1f。

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs体外结合

αvβ3整合素通常在乳腺癌肿瘤内皮细胞高表达并促进肿瘤转移[33-36]。MDA-MB-231细胞αv整合素细胞免疫荧光表达远高于MCF-7细胞；A549细胞作阳性对照（图2a）。用CLSM研究NPs细胞摄取（图2b）。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs对MD-MB-231细胞结合率远高于非靶向NPs。荧光图像显示NPs结合细胞质，合并图像显示与αv整合素表达位置相同[37, 38]。

细胞毒性实验

用CCK8法在MDA-MB-231细胞估算Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs体外细胞毒性，A549和MCF-7细胞作对照（图2c）。Fe浓度5-80 μg/mL范围内，A549和MB231细胞活率无显著降低，均维持70%以上。相反MCF-7细胞在Fe浓度超40 μg/mL时活率显著降至约50%。CCK8结果表明Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs在给定浓度范围内对MDA-MB-231细胞细胞毒性显著较低。

体外造影成像

用琼脂凝胶模体研究不同pH值下Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs体外性能（图3a）。弱酸性pH（6.8）下靶向NPs超声造影图像显著增强，pH 7.2时不增强，因pH 7.2不产生足够CO₂气泡用于超声成像。相反弱酸环境中可生成足够气泡用于超声成像。此特性与肿瘤相关，肿瘤体内表现高组织异质性和多样pH水平（6.8-7.2）[32, 39, 40]。随后分析超声图像信号强度（图3b）。非靶向NP（pH 7）、非靶向NP（pH 5）、靶向NP（pH 7）、靶向NP（pH 5）组信号强度相对空白组比率分别为112%、145%、167%、178±4%，明确表明靶向NP（pH 5）组US信号最强。

体外MRI研究中，随Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs中Fe浓度增加，T2加权信号强度显著降低，表明其作为T2 MRI造影剂可能性（图3c）。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs横向弛豫率(r₂)计算为19.597 mM⁻¹ s⁻¹。虽r₂低于许多其他MRI超顺磁剂，但Fe₃O₄组分可提高r₂，为临床用超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO）r₂的2.94倍。

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs超声造影成像

为演示Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs肿瘤超声成像潜力，向乳腺癌异种移植裸鼠尾静脉注射NPs并随时间监测超声图像（图4a）。注射前记录肿瘤、肝脏、皮下区域图像。注射后即刻肿瘤区域无造影增强。注射30 min起观察到肿瘤区域增强，持续90 min。体内超声结果显示NPs在酸性肿瘤组织生成足够气泡产生超声回波反射率。对照组同样在不同时间获取肝脏和皮下组织图像。观察期内皮下注射区无显著增强，肝脏增强随时间减弱且显著低于肿瘤（图4b）。结果表明NPs在体内生理pH循环不产生大量CO₂气泡用于超声造影增强。

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs MRI

体内MRI为演示NPs可用于肿瘤特异性成像，将Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs直接注射入肿瘤和肌肉。结果显示靶向NPs注射后肿瘤区域T2-MRI造影显著降低，信号强度从0 min 8875显著降至120 min 5972（图5a, b）。但同量NPs注射皮下肌肉区域T2信号降低幅度小得多。这证明Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs具有高灵敏整合素靶向T2-MRI造影剂用于肿瘤靶向成像效果。尾静脉注射组T2-MRI成像注射24 h后肿瘤造影明显降低，证明NPs高肿瘤富集（图5c, d）。此外肝脏和肾脏观察到T2信号降低，表明NPs中铁离子可快速体内清除。因此MRI揭示PLGA包裹Fe₃O₄纳米粒子通过增强渗透滞留（EPR）效应实现高效被动肿瘤靶向，特别是RGD介导靶向，但可在体内分解快速排出。

荧光成像与组织学

静脉注射200 μL NPs进行体内荧光成像。RGD靶向NPs组Cy5.5荧光信号在肿瘤区逐渐增强，注射4 h达峰值，表明NPs能有效富集肿瘤。非靶向组注射后NPs分布全身并快速清除，长时间不在肿瘤富集（图6a）。随后解剖小鼠收集主要器官和肿瘤体外荧光成像，显示靶向NPs高肿瘤摄取（图6b, c）。靶向NPs注射小鼠肿瘤Cy5.5荧光强度为非靶向组1.5倍。

进一步用冻切肿瘤切片组织荧光成像验证NPs肿瘤特异靶向（图7a）。抗αv和β3整合素抗体免疫荧光染色显示肿瘤组织αvβ3整合素显著表达。αv和β3整合素荧光与NPs Cy5.5荧光合并获免疫染色图像显示共定位。肿瘤组织免疫荧光结果表明NPs特异性结合MB231恶性乳腺癌αvβ3整合素。此外H&E染色显示靶向NPs组与非靶向组相比所有器官切片病理形态正常、无组织病理损伤反应（图7b）。上述所有细胞毒性和组织学分析结果表明NPs未对体内主要器官组织诱导显著毒性，良好生物相容性可合理归因于PLGA。

结论

总之，上述结果展示一种通过磁靶向和肿瘤微环境激活气体生成系统实现乳腺癌MRI的创造性成功方法。Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NPs在MRI/超声/荧光成像模式下展现优异成像性能和良好生物相容性。本工作显示利用改进多模态成像进行肿瘤诊断的强大潜力。