脂质体内酸性微环境显著增强姜黄素稳定性与抗癌疗效

摘要

脂质体为生物活性化合物递送提供多功能平台，但pH敏感药物在生理条件下的内在不稳定性仍是挑战。我们设计了一种脂质体制剂，在其水相核心内创造酸性微环境，从而保护封装药物。制备了内部pH值为2.5、5.0和7.4的姜黄素负载脂质体（Cur-LPs），均表现出可比粒径（~300 nm）、窄多分散性（<0.2）和相似体外释放曲线。值得注意的是，50%胎牛血清中姜黄素化学完整性及其对HepG2细胞细胞毒性强烈依赖内部pH：Cur-LP-2.5 > Cur-LP-5.0 > Cur-LP-7.4。研究表明脂质体内酸性核心是稳定pH敏感治疗药物的实用高效策略。

背景

人工脂质囊泡即脂质体，以磷脂双分子层包裹水相内核模拟细胞膜，具备高药物负载、可生物降解和生物相容性[1-5]。两亲结构允许疏水药物溶解同时屏蔽细胞外恶劣环境[6-9]。表面修饰可延长体循环或定向递送[10-14]，多款脂质体制剂已获临床批准[15-18]。

尽管优势明显，中性pH不稳定药物递送仍成问题。常规脂质体典型制备于pH 7.4 PBS中，使pH敏感药物暴露于不利环境。姜黄素作为疏水多酚，具强抗炎抗癌活性，但水溶性差和pH介导降解限制临床转化[19-23]。因此，在脂质体核心创造酸性微环境可保存此类药物完整性。

本研究利用脂质体内部水相室构建可调酸度梯度，评估其对姜黄素封装、稳定性和抗癌活性的影响。

方法

材料

大豆卵磷脂（注射级）购自上海泰维制药；胆固醇购自Amresco；聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物188（F68）由BASF（中国）赠予；姜黄素（≥98%）购自Sigma；胎牛血清（FBS）来自HyClone。所有试剂均为分析纯。

姜黄素负载脂质体制备

采用薄膜分散法[27,28]改良制备Cur-LPs。磷脂（75 mg）和胆固醇（5 mg）溶于含2 mg/mL姜黄素的0.5 mL乙醇。混合含1%（w/v）F68的5 mL 0.001 M PBS（pH 2.5、5.0或7.4）。35°C磁力搅拌1 min后，真空避光旋转蒸发30 min除去乙醇。低速离心（3000 rpm, 5 min）除游离姜黄素；沉淀高速离心（16000 rpm, 10 min）重悬于PBS（pH 7.4）。所得制剂分别记为Cur-LP-2.5、Cur-LP-5.0、Cur-LP-7.4；空白脂质体同法制备。

表征

动态光散射（DLS）测水动力学尺寸和多分散指数（PDI）；电泳光散射（ELS）用Malvern Zetasizer Nano ZS90测Zeta电位（25°C）。高速离心分离包封与游离姜黄素后荧光法计算包封率（EE）[29]。

扫描电镜

100倍稀释蒸馏水，滴铸玻璃片，自然干燥，喷金后FEI INSPECT F拍摄SEM图像。

物理稳定性

37°C下监测72 h粒径变化和透射率（550 nm）评估胶体稳定性。分别量化团聚（热力学）和沉降（动力学）。

体外释放

透析法（10 kDa截留）在PBS（pH 7.4，0.1% Tween 80），37°C，100 rpm搅拌测姜黄素释放。定时取样替换等量新鲜培养基，荧光分析（Ex 458 nm, Em 548 nm）。

血清中化学稳定性

Cur-LPs（10倍稀释）与1 mL 50% FBS混合，37°C，100 rpm孵育。设定时间点取样，乙醇萃取，离心后荧光定量残余姜黄素。

体外抗癌疗效

HepG2细胞96孔板接种10000细胞/孔，PRIM-1640+10% FBS培养24 h，PBS洗涤后用无血清培养基含4 μg/mL姜黄素（游离或包封）处理。CCK-8法在1天和3天测活力，以未处理对照为100%。

统计学

数据为均值±SD（n=3）。双尾Student's t检验定显著性；p<0.05为显著。

结果与讨论

脂质体表征

所有Cur-LPs粒径相似（~300 nm），PDI<0.2（图1a）。Cur-LP-5.0和Cur-LP-2.5 Zeta电位更负（~-18 mV），Cur-LP-7.4为-9 mV，反映内部酸度影响表面电荷（图1b）。Cur-LP-2.5 EE较高（74%），Cur-LP-5.0（45%）和Cur-LP-7.4（64%）较低，提示酸化内核增强姜黄素负载，可能因低pH改变溶解度动力学[33]。

SEM成像确认所有制剂球形形貌（图2）。Cur-LP-7.4轻微团聚，一致于其较低Zeta电位；SEM直径因脱水效应小于DLS值。

物理稳定性

37°C下72 h内，所有制剂粒径无显著增加，透射率变化<10%，表明无论内部pH均具稳健热力学和动力学稳定性（图3）。

体外释放

游离姜黄素溶液快速释放（>80%在6 h内），证实透析膜不阻碍扩散。Cur-LPs呈现持续、近零级释放，72 h累计释放~30%（图4）。线性回归（R²>0.99）凸显一致释放动力学，有利于维持治疗浓度。

内部pH对化学稳定性影响

血清孵育显示显著pH依赖性：6 h后Cur-LP-2.5保留55%姜黄素，Cur-LP-5.0为43%，Cur-LP-7.4仅34%（图5）。此趋势镜像游离姜黄素已知pH敏感性[26]。酸性核心可能抑制酶活性并保护脂质双层内姜黄素，虽预期脂质双层阻隔，但少量水相渗透仍可影响药物稳定性。

体外抗癌疗效

空白脂质体1天轻微促进HepG2增殖，提示营养效应[27]。游离姜黄因溶解度差细胞毒性有限。相反，Cur-LPs以pH依赖方式显著抑制细胞生长：1天活力Cur-LP-2.5和Cur-LP-5.0为80%，Cur-LP-7.4为90%；3天降至24%（Cur-LP-2.5）、21%（Cur-LP-5.0）、39%（Cur-LP-7.4）（图6）。Cur-LP-2.5优异表现与其高EE和稳定性一致。

结论

调节脂质体内部酸度提供简便而强大的策略，增强pH敏感药物化学稳定性和治疗疗效，甚至适用于驻留脂质双层的疏水分子。Cur-LP-2.5创造的酸性微环境不仅保护姜黄素免受血清降解，还放大其在HepG2细胞抗癌活性。该方法易推广至其他易不稳定治疗药物，潜在改善其临床表现。