脂质体微环境 pH 值对负载药物化学稳定性的影响

背景

脂质体是一种人工膜载体，由于其载药能力、生物降解性和生物相容性，在药物递送方面显示出巨大的潜力 [1,2,3,4]。经典脂质体在结构上与活细胞相似，通常由磷脂双层和水性内室组成 [5,6,7]。由于这种结构，脂质体能够溶解不溶性药物分子并防止负载的药物受到恶劣生理环境的影响[8,9,10]。此外，可以修饰脂质体的表面以延长血液循环时间和/或靶向特定组织 [11,12,13,14,15]。凭借上述优势，各种脂质体系统已获得临床批准[8, 9, 16]。

尽管通过掺入脂质体改善了许多药物的递送，但一些pH敏感药物的递送仍然受到药物分子本身在生理环境（中性pH值）中的不稳定性的限制。通常，脂质体是在中性缓冲溶液中制备的，因此负载的药物分子在掺入脂质体后也处于中性环境中。因此，那些仅在酸性环境中稳定的分子即使以脂质体的形式仍然不稳定。因此，开发一种提高pH敏感药物稳定性的新方法对于脂质体成功递送这些有效载荷具有重要意义。

如上所述，脂质体在其内腔中有一个水性空间，可用于为药物负载提供酸性微环境（图 1）。在目前的工作中，我们使用姜黄素作为模型药物，旨在提供一种提高脂质体中药物分子化学稳定性的新方法。众所周知，姜黄素是一种亲脂性分子，由于其多种生物活性而被广泛应用于食品、药品和化妆品中 [17,18,19,20,21]。然而，由于其在生物体液中的不溶解性和不稳定性，其递送受到高度限制 [22,23,24,25]。到目前为止，部分由于 pH 介导的不稳定性，它尚未实现其临床前景 [26]。因此，姜黄素是适合本工作的模型药物。

内水室微环境酸度不同的脂质体示意图

方法

材料

磷脂（注射用大豆卵磷脂）购自上海泰威药业有限公司（中国上海）。胆固醇购自 Amresco (Solon, OH, USA)。泊洛沙姆 188 (F68) 由巴斯夫（中国）有限公司（中国上海）友情捐赠。姜黄素由 Sigma (St. Louis, MO, USA) 提供。胎牛血清 (FBS) 购自 HyClone (Logan, UT, USA)。本研究使用的其他化学试剂均为分析纯及以上。

姜黄素脂质体 (Cur-LPs) 的制备

根据先前的工作并进行一些修改，使用蒸发方法制备具有不同微环境 pH 值的脂质体 [27, 28]。简而言之，将磷脂（75 毫克）和胆固醇（5 毫克）溶解在含有 2 毫克/毫升姜黄素的 0.5 毫升乙醇中。乙醇溶液与含有 1% (w /v ) F68 用作表面活性剂以缩小尺寸分布。磁力搅拌 1 分钟（恒温磁力混合器，DF-101S，郑州长城科工贸有限公司，郑州，中国）后，将所得乳液在真空和黑暗中在 35°C 下蒸发 30 分钟至除去乙醇。在制备过程中，通过使用具有 2.5、5.0 或 7.4 不同 pH 值的 PBS 来调节 Cur-LP 内室的酸度。将所得悬浮液以低速（3000 rpm，5 分钟）离心以沉淀游离姜黄素。然后以高速（16 krpm，10 分钟）离心上清液，并在进一步使用前将沉淀重新悬浮在 PBS（pH 7.4）中。此过程为这些 LP 提供了相同的外部环境。获得的具有不同微环境 pH 值的脂质体分别表示为 Cur-LP-2.5、Cur-LP-5.0 和 Cur-LP-7.4。空白脂质体也按上述方法制备。

脂质体的表征

流体动力学大小、大小分布和 zeta 电位是脂质体系统的三个基本参数。 LP 的大小和 zeta 电位分别通过动态光散射 (DLS) 和电泳光散射 (ELS) 确定，使用 ZetasizerNano ZS90（Malvern Instruments Ltd.，Malvern，UK）在 25°C [29]。测量周期由仪器系统自动确定。粒度用强度分布表示，粒度分布用多分散指数（PDI）评价。

封装效率 (EE) 确定

EE 是质量控制的重要参数，在开发基于脂质体的递送系统中具有重要意义。 EE 测定基于高速离心法。简而言之，将 100 μl Cur-LPs 低速（3000 rpm，5 分钟）离心以沉淀未溶解的游离姜黄素，50 μl 上清液进行高速离心（16 krpm，10 分钟）以分离 Cur-来自微小溶解姜黄素的 LP。将沉淀物重新悬浮在 500 μl PBS（即 10 倍稀释）中，将 10 μl 的等分试样与 300 μl 乙醇通过涡旋和超声处理混合 30 秒。测定所得溶液中姜黄素的荧光强度（激发波长 (Ex)，458 nm；发射波长 (Em)，548 nm）并表示为 F e ，即封装姜黄素的荧光强度。另外 50 μl 含有封装和游离姜黄素的新鲜 Cur-LP 也用 PBS 稀释 10 倍，并将 10 μl 稀释溶液与 300 μl 乙醇混合。测量所得溶液的荧光强度并表示为F t ，即总姜黄素的荧光强度。因此，EE 使用以下等式计算：EE =F e /F

扫描电子显微镜 (SEM)

通过扫描电子显微镜（SEM，INSPECT F，FEI，Netherlands）观察 LP 的形态 [30]。简而言之，LP 悬浮液用蒸馏水稀释 100 倍，并将一滴稀释的悬浮液放在干净的玻璃板上。风干后，样品在扫描电镜前镀金。

脂质体的物理稳定性

物理稳定性对于胶体系统的储存和运输来说是一个非常有意义的参数。脂质体的物理稳定性由胶体稳定性表示，并根据先前的方法进行研究 [31]。简而言之，将 100 μl LP 添加到管中并保持在 37°C。在不同的时间间隔，测量 LP 尺寸并与初始尺寸进行比较，以表明热力学稳定性。此外，还将另外 300 μl LP 加入管中并保持在 37°C。在相同的时间间隔，收集 100 μl 上层液体。在 550 nm 处测量采集样品的透光率并与初始值进行比较，以表明其动力学稳定性。

体外发布

脂质体的释放曲线在预测脂质体的体内命运和功效方面起着重要作用。使用动态透析方法研究了 Cur-LP 中姜黄素的体外释放 [32]。简而言之，将 1 ml 的每种 Cur-LP 加入透析袋（截留分子量，10 kD），用于保留脂质体但保持释放的姜黄素分子可渗透。将装有样本的透析袋浸泡在 4 ml 释放培养基（0.001 M PBS，含有 0.1% Tween 80，pH 7.4）中，并且在避光（37°C，100 rpm）下进行释放研究。在每个固定的时间间隔，收集释放培养基并更换为 4 ml 新鲜培养基以模拟水槽条件。收集的培养基用 PBS 稀释至 5ml，再用乙醇稀释 15 倍。所得溶液中的姜黄素通过荧光分光光度法（Ex 458 nm，Em 548 nm）定量。此外，将姜黄素粉溶解在上述释放介质中，在pH 7.4下进行姜黄素溶液的释放，考察透析袋是否会保留姜黄素分子。

脂质体姜黄素的化学稳定性

化学稳定性是预测药物代谢、功效和毒性的关键参数。在 50% FBS 中检查 Cur-LPs 的化学稳定性。简而言之，将 100 μl Cur-LP 用 PBS (pH 7.4) 稀释 10 倍，然后与 1 ml FBS 混合。在远离光线的水平振动器上振动样品（37°C，100 rpm）。在固定的时间间隔，收集 10 μl 样本的等分试样并与 300 μl 乙醇混合，然后立即离心（16 krpm，5 分钟）。上清液中残留姜黄素按上述方法定量。

体外抗癌功效

使用人肝肝细胞癌 HepG2 细胞研究了三种 Cur-LP 的初步抗癌功效。简而言之，将 HepG2 细胞以每孔 10,000 个细胞的密度接种到 96 孔细胞培养板上，并在标准条件（37°C/5% CO2）下在补充了 10% FBS 的 PRIM-1640 培养基中培养 24 小时.随后，去除培养基并用PBS洗涤细胞。 Cur-LPs 在无血清培养基（4 μg/ml 姜黄素）中稀释并加入细胞中，然后在 37°C 下连续孵育 1 天和 3 天。 cck-8法测定活细胞的OD值。以空白培养基处理的细胞为对照，细胞活力(%)为标本相对于对照的OD值百分比。

统计数据

所有数据均表示为平均值 ± sd（标准偏差）。由学生的 t 分析的两组之间的差异 检验，当 p 值小于0.05。

结果与讨论

脂质体的表征

脂质体的微环境pH值是指脂质体内部水室中的酸度（图1），与外部环境的pH值不同。在这项工作中，除非另有说明，所有脂质体悬浮液的外部环境pH值为7.4。

粒径、zeta 电位和封装效率 (EE) 是脂质体质量控制的重要参数。三个 Cur-LP 的大小彼此相似（大约 300 nm，图 2a）。每种配方的 PDI 均低于 0.2，表明粒度分布较窄。有趣的是，Cur-LP-7.4 (-9 mV) 的负 zeta 电位明显低于其他两个 Cur-LP (~-18 mV)。通常，由于H ⁺ 的增加，负zeta电位会随着分散相pH值的降低而降低甚至转为正值。 专注。在 pH 为 2.5、5.0 和 7.4 的非缓冲 HCl/NaOH 溶液中制备 Cur-LP 时，我们确实观察到了这种现象（图 2b）。然而，在 PBS 的情况下，PO4 ³⁻ 的存在 , HPO4 ²⁻ , 和/或 H2PO4 ⁻ 他们与LP的互动可能会导致更复杂的情况和不同的结果。众所周知，zeta 电位在维持纳米级悬浮液的胶体稳定性方面起着关键作用。一般来说，zeta电位绝对值越高，胶体悬浮系统越稳定。

脂质体的物理化学表征。 一 分别在 pH 2.5、5.0 和 7.4 的 PBS 中制备的 Cur-LP 的流体动力学尺寸和 zeta 电位。 b 在 HCl/NaOH 溶液中制备的 Cur-LP 的 Zeta 电位分别为 2.5、5.0 和 7.4。 c 在 PBS 中制备的 Cur-LP 的封装效率。数据表示为平均值 ± sd (n =3)。组间统计显着性：***p <0.001

EE 在脂质体发育过程中受到关注。通常，增加 EE 对于降低成本和提高功效很重要。在这项工作中，Cur-LP-2.5 的 EE 为 74%（图 2c），在 Cur-LP-5.0（45%）和 Cur-LP-7.4（64%）中最高，表明 Cur-从 EE 的角度来看，LP-2.5 是提供姜黄素的最佳配方。不同pH值下EE的变化原因尚不十分清楚，可能与姜黄素在碱性或极酸性溶剂中的溶解度有关[33]。

SEM 检测的脂质体形态如图 3 所示。LP-2.5（图 3a）和 LP-5.0（图 3b）的颗粒呈球形，颗粒分布均匀。 LP-7.4 也呈球形，但可以清楚地观察到颗粒之间的粘附（图 3c），表明 SEM 样品制备过程中的干燥过程会导致 LP-7.4 聚集。这可能是由于 LP-7.4 的 zeta 电位绝对值相对较低（图 2a）。另外，SEM测得的粒径小于DLS测得的流体力学粒径，这是由于SEM干燥后脂质体水化壳损失所致。

a微环境pH的脂质体SEM图 2.5、b 5.0 和 c 7.4. 比例尺 , 1 μm

脂质体的物理稳定性

脂质体是一种胶体体系，其物理稳定性可以通过胶体稳定性来表现，这对脂质体的储存和进一步应用具有重大影响[34, 35]。粒子聚集（热力学不稳定性）和沉降（动力学不稳定性）是胶体不稳定性的两个基本方面。聚集导致更大的表观尺寸，沉降导致悬浮液透射率的变化。更重要的是，尺寸的增加可以直接影响纳米系统的功效，因为粒径已被证明对细胞摄取、细胞毒性、药代动力学特征和组织分布有很大影响 [36, 37]。

在这里，我们检查了三种脂质体系统的聚集和沉降特性，以分别表明它们的热力学和动力学稳定性。如图 4a 所示，三个 LP 在 72 小时内没有表现出流体力学尺寸的实质性变化，表明所有这些 LP 都具有非常高的热力学稳定性。同时，所有三个LP的透射率变化都小于10％（图4b），表明颗粒沉降很小，因此具有很高的动力学稳定性。这些结果表明三种LPs在72 h内具有良好的胶体稳定性，微环境pH值对脂质体的物理稳定性没有影响。

具有不同微环境 pH 值（pH 2.5、5.0 和 7.4）的脂质体的物理稳定性。 一 表明颗粒聚集的热力学稳定性。 b 表明颗粒沉降的动力学稳定性。数据表示为平均值 ± sd (n =3)

体外发布

通常检查脂质体的药物释放曲线以评估制剂质量，为给药方案提供参考，并预测体内有效性。一般来说，几乎所有的脂质体系统都具有持续的药物释放特性。在这里，我们检查了三种 Cur-LP 在 PBS（pH 7.4）中的体外释放行为。同时，还检测了姜黄素溶液的释放情况，以确认透析膜是否会影响姜黄素的扩散。如图 5a 所示，姜黄素从其溶液中释放得非常快（6 小时时>80%），表明透析袋对姜黄素扩散没有影响。与姜黄素溶液的快速释放相反，所有的Cur-LPs都表现出明显的缓释特性（图5b），并且释放曲线彼此非常相似，表明微环境pH对姜黄素没有显着影响释放速度。详细地说，姜黄素在前 8 小时的释放速度略快，这可能是由于最初的爆发性释放（累积释放百分比约为 5%）。 8 小时后，姜黄素的释放速度稍慢，72 小时内的累积释放百分比约为 30%。推测在体内或在血清存在下的释放速度会显着加快，部分原因是脂质代谢。

不同姜黄素制剂在 PBS (pH 7.4) 中的体外释放曲线。 一 姜黄素溶液，其中姜黄素溶解在含有 0.1% Tween 80 (pH 7.4) 的 PBS 中。 b Cur-LP 的微环境 pH 值分别为 2.5、5.0 和 7.4。数据表示为平均值 ± sd (n =3)

有趣的是，所有三个 Cur-LP 的释放曲线都接近于直线。因此，对三种释放曲线进行了线性拟合。如表 1 所示，所有这些曲线都显示出非常好的线性，拟合度高于 0.99（还显示了回归方程），表明 Cur-LPs 的释放符合零级动力学。在其他类似的研究中，发现姜黄素从脂质体中的释放是非线性的 [38, 39]。从药物研发的角度来看，零级释放动力学是最理想的释放曲线，因为它提供了恒定的药物释放速率，从而能够长时间保持治疗效果，减少给药次数，减少副作用.因此，本工作制备的LPs可能是一种有前景的药物控制载体。

微环境 pH 值对 Cur-LP 化学稳定性的影响

脂质体姜黄素在 FBS 中的化学稳定性如图 6 所示。孵育 2 小时后，Cur-LP-2.5 的姜黄素含量为 89%，显着高于 Cur-LP-5.0 的 74% 和 Cur-LP 的 61% -7.4 (p <0.001)。孵育 4 小时后，Cur-LP-2.5 的姜黄素含量仍为 69%，显着高于 Cur-LP-5.0 的 53% 和 Cur-LP-7.4 的 40% (p <0.01)。孵育后 6 小时，Cur-LP-2.5 仍有 55% 的姜黄素，仍显着高于 Cur-LP-5.0 的 43% 和 Cur-LP-7.4 的 34% (p <0.05）。很明显，Cur-LPs 的化学稳定性取决于微环境 pH 值：Cur-LP-2.5> Cur-LP-5.0> Cur-LP-7.4。 Cur-LP 的这种 pH 依赖性化学稳定性与另一项工作一致，该工作表明游离姜黄素的 pH 依赖性稳定性 [26]。体外释放在无血清培养基中进行，72小时累积释放可达30%。然而，化学稳定性研究是在含血清的溶液中进行的，其中血清酶可以降解释放的姜黄素，也可以破坏脂质体，从而降解未释放的姜黄素。这就是为什么在体外释放研究中 72 小时释放 30% 姜黄素，而在血清稳定性研究中 Cur-LP-2.5 仅 55% 保持在 6 小时。

脂质体姜黄素 (Cur-LP) 在不同微环境 pH 值（pH 2.5、5.0 和 7.4）下的化学稳定性。在用 50% FBS 孵育 Cur-LP 后，通过量化剩余的姜黄素来检查稳定性。数据表示为平均值 ± sd (n =3)。组间统计显着性：***p <0.001, **p <0.01，*p <0.05

脂质体在结构上由两部分组成：一是疏水的脂质双层，另一部分是亲水的内水室。容易理解，pH敏感的亲水性药物位于内水室，其稳定性受水室内微环境pH的影响很大，缓冲体积和缓冲容量会高很多比在脂双层中。相比之下，姜黄素是一种疏水性分子，位于脂质双层中。因此，发现脂质体姜黄素的微环境 pH 依赖性化学稳定性非常有趣。假设脂双层中的空间虽然是疏水的，但不会绝对无水。众所周知，活细胞膜的脂双层并不是绝对无水的。相反，它包含一定体积的水溶液，用于运输水溶性分子和离子。同样，在成功制备脂质体后，疏水性脂双层中也会存在一定体积的与内腔相同成分的缓冲溶液。因此，位于脂双层中的疏水性药物可以直接受到脂质体微环境pH值的影响。此外，酸性微环境可能会降低某些酶的活性，这些酶在正常生理条件下表现出最佳活性。这也有助于脂质体姜黄素在较低的微环境 pH 值下具有更高的化学稳定性。据报道，由卵磷脂（EPC）组成的脂质体在缓冲液（pH 7.4）中迅速失去其内部pH梯度，通过替代EPC（相变温度（T 米 ) ≈ -5 °C) 具有高 T 米 (41°C) 脂质 DPPC（二棕榈酰磷脂酰胆碱）并添加胆固醇 [40]。在目前的工作中，脂质体由大豆卵磷脂 (T 米 约为 238.2°C [41]) 和胆固醇。因此，本工作制备的脂质体的微环境 pH 梯度有望长期保持。这是对上述结果和假设的有力支持。

体外抗癌功效

我们已经证明了上述脂质体姜黄素的微环境 pH 依赖性化学稳定性。在这里，我们进行了一项初步的体外研究，以研究这些脂质体姜黄素的抗癌功效。有趣的是，与对照组相比，空白 LPs 可以在第 1 天增强细胞生长，并在一定程度上保持这种功能直到第 3 天（图 7）。这表明空白 LP 可能为细胞提供营养，这与我们之前的报告一致 [27]。游离姜黄素由于其非常有限的溶解度而几乎没有显示出抗癌功效。相比之下，Cur-LPs 以微环境 pH 依赖性方式显示出显着的抗癌功效。处理 1 天后，Cur-LP-2.5 和 Cur-LP-5.0 显示出比 Cur-LP-7.4 显着更强的抑制 HepG2 细胞生长的能力（Cur-LP-2.5 和 Cur-LP 的细胞活力为 80% -5.0，Cur-LP-7.4 为 90%）。治疗后第 3 天，细胞活力显着下降，Cur-LP-2.5 和 Cur-LP-5.0 显示出相当的抗癌功效，明显高于 Cur-LP-7.4。 Cur-LP-2.5 的细胞活力为 24% (p <0.05 vs Cur-LP-7.4)，Cur-LP-5.0 为 21% (p <0.01 vs Cur-LP-7.4)，Cur-LP-7.4 为 39%。这些结果表明脂质体姜黄素的抗癌功效是微环境 pH 值和时间依赖性的。考虑到Cur-LP-2.5比Cur-LP-5.0具有更高的EE和化学稳定性，微环境pH为2.5的脂质体将具有最大的实际应用潜力。

脂质体姜黄素在不同微环境 pH 值（2.5、5.0 和 7.4）下的抗癌功效。在用空白 LP、游离姜黄素和 Cur-LP 处理后第 1 天和第 3 天，通过 cck-8 测定检查 HepG2 细胞的活力。用含血清空白培养基处理的细胞作为对照。数据表示为平均值 ± sd (n =3)。组间统计显着性：**p <0.01，*p <0.05

结论

脂质体作为一种广泛使用的药物递送系统，能够提高水不溶性药物的溶解度，保护药物有效载荷免受恶劣生理环境的影响，并将有效载荷递送至靶组织。然而，pH 敏感药物的递送仍然受限于它们在生理条件（中性环境）中的自然不稳定性。在目前的工作中，我们提出了一种通过调节脂质体的微环境酸度来增强 pH 敏感药物有效载荷化学稳定性的新方法。研究结果表明，通过酸化脂质体的微环境，模型 pH 敏感药物姜黄素的化学稳定性和体外功效显着增强。综上所述，调节脂质体微环境pH值对于增强pH敏感药物有效载荷的化学稳定性是可行的，即使对于位于脂双层中的疏水性药物也是如此。