不同粒径阿维菌素纳米递送系统的制造、表征和生物活性

背景

农药对防治病虫害、保障国家粮食安全具有重要意义。大多数常规农药制剂是开放系统，存在分散性差、活性成分降解和液滴漂移等问题。农药中的活性成分损失率高达 70-90%。这是由于生物降解、化学降解、光解、蒸发、地表径流和地下水渗漏导致的田间喷洒的结果，所有这些都引起了对食品安全和环境的关注 [1, 2]。因此，改善农药的施用和释放成为一个重要的研究课题[3,4,5]。

近年来，纳米技术和纳米材料的发展为提高农药施用效率提供了新途径[6,7,8,9,10,11,12,13,14,15]。由于纳米颗粒尺寸小、表面积大，因此农药的纳米颗粒制剂可以在叶片表面产生更好的农药空间分布，从而提供更好的效率 [16,17,18,19]。杀虫剂的纳米递送系统涉及将杀虫剂的活性成分包裹在聚合物纳米材料中，以允许活性成分缓慢和受控地释放到目标作物上 [20,21,22]。在不同的聚合物中，聚乳酸（PLA）由于其无毒、良好的生物利用度和生物相容性，已被广泛用作许多生物活性分子的控释纳米递送系统中的纳米颗粒载体，并被美国食品药品监督管理局批准用于人用[23, 24]。 PLA作为载体材料在农药领域的研究还很有限。 PLA具有环境友好、成本低、易于放大等优点，是一种非常有前景的农药包覆材料。

农药纳米输送系统还扩大了目标害虫与农药颗粒之间的接触面积[25, 26]。

阿维菌素（Av）是一种高效、广谱、安全的生物农药，可防治多种农业害虫。由于光氧化，Av 很容易降解。 Av 在水中的半衰期也很短，这会影响田间应用中的害虫控制。 Av 的有机碳吸附系数高。这意味着 Av 不容易在土壤中迁移，因为它与有机物质紧密结合，这会影响其在土壤中的害虫控制。许多努力集中在通过微囊化技术保护 Av 的生物活性 [27, 28]。然而，含 Av 的微胶囊的大小很难控制。它们通常很大，大小约为 1-5 微米，并且具有广泛的大小分布 [29, 30]。分散性和均匀性差，粒径过大，不利于提高农药在叶片表面的附着力或增加对害虫的渗透性。对不同尺寸 Av 的农药纳米递送系统的合成和生物活性进行了有限的研究 [31,32,33,34]。通过纳米材料包封构建Av的纳米释放系统，可以显着提高其光稳定性，减少其土壤吸附或其他不利因素，提高农药的防治效果。此外，与传统微胶囊相比，Av 纳米递送系统还具有更好的渗透性，可以更慢、更可控地在目标作物上释放活性成分。

本研究旨在通过乳液聚合使用 PLA 制备各种粒径的 Av 纳米递送系统，并表征其作为安全和可生物降解载体的性能。我们研究了粒径对 Av 纳米递送系统的释放特性和生物活性的影响 [35,36,37,38,39]。活性物质及其前体的浓度以及乳液系统的特性是确定最终 Av 纳米递送系统尺寸分布的主要因素。 Av纳米递送系统表现出良好的颗粒分散性，粒径可控，Av负载量高，有效的尺寸控制和缓释性能，以及良好的紫外线（UV）屏蔽和稳定性。

实验

材料

PLA 和 Av 分别由 Nature Works 和齐鲁制药有限公司（中国内蒙古）提供。聚乙烯醇 (PVA)，87-90% 水解，平均 Mw 为 30,000-70,000，购自 Sigma-Aldrich Shanghai Trading Co., Ltd.（中华人民共和国上海）。明胶购自国药集团化学试剂有限公司（中华人民共和国北京）。透析膜购自北京天安科技有限公司（中华人民共和国）。其他化学试剂为分析纯，购自北京化工厂（中华人民共和国北京）。所有实验中使用的水均为 Milli-Q 级（18.2 MΩ cm，TOC ≤ 4 ppb），来自 Milli-Q Advantage A10 系统（Millipore，Milford，MA，USA）。

阿维菌素纳米给药系统的制备

通过水包油（O/W）乳化法结合超声波和剪切物理乳化工艺制备了Av纳米递送系统。简而言之，将PLA和Av溶解在作为油相的二氯甲烷中。对于水相，将明胶溶解在 40°C 的水中，然后将其与 PVA 水溶液混合。然后，在高剪切乳化（FA25，FLUKO，Ruhr-gebiet，德国）下将油相缓慢滴入大量的水相中，制备粗乳液。然后通过超声乳化（JY 92-IIN，SCIENTZ，宁波，中华人民共和国）将粗乳液均匀分散。然后将均匀的乳液在磁力搅拌下固化过夜（RW20，IKA，Staufen，Germany）。通过离心收集硬化的Av纳米递送系统并用去离子水洗涤3次。通过离心收集产品，然后冷冻干燥（FD-81，EYELA，东京，日本）以产生自由流动的粉末。干燥的粉末在 4°C 下储存直至使用。

纳米输送系统的特征

通过扫描电子显微镜（SEM，JSM-6700 F，JEOL Ltd.，Akishima-shi，Japan）以 5 kV 的加速电压研究每个 Av 纳米输送系统的形态。 SEM 样品逐滴沉积在硅片的表面上。让液滴在室温下干燥，然后使用溅射镀膜机（EM ACE600，Leica，Vienna，Austria）涂上一层薄薄的铂，以防止在 SEM 观察过程中带电。在 25°C 下，使用 zetasizer（Zetasizer NanoZS90；Malvern，Worcestershire，UK）通过激光散射测量 Av 纳米输送系统中的颗粒尺寸。

纳米递送系统中阿维菌素负载的测定

使用紫外-可见（UV-vis）分光光度计（TU901，Shimadzu Corporation，Kyoto，Japan）在 245 nm 波长下测量纳米递送系统中 Av 的量。具体来说，称量载有 Av 的样品并在氯仿中溶解过夜，然后通过减压蒸馏将溶液干燥。然后加入甲醇以从干燥的沉淀物中溶解Av。最后，将混合物过滤，得到澄清溶液，用紫外-可见分光光度法分析。

纳米递送系统中阿维菌素的受控释放

如下研究了来自不同尺寸的纳米递送系统的 Av 的释放曲线。将各种尺寸的 Av 纳米递送样品悬浮在 10 mL 乙醇/水混合物 (1:1, v /v ）。然后将悬浮液转移到透析袋中，将其密封在装有 90 mL 乙醇/水混合物 (1:1, v /v ) 作为发布媒介。将烧瓶在室温下以 300 rpm 的速度在孵化器振荡器中温育。在规定的时间间隔后，取出 5.0 mL 溶液并替换为 5.0 mL 新鲜溶剂。通过测量不同时间间隔内溶解在释放介质中的 Av 浓度计算出 Av 从纳米递送样品中的释放速率，并用于评估缓释性能。 Av 的浓度是使用紫外-可见分光光度计在 245 nm 波长下测量的。工业阿维菌素（TC，工业级活性成分）用作对照。

阿维菌素在纳米递送系统中的光解行为

Av 在纳米递送系统中的光解行为以商用 Av WDG 作为对照进行评估。将样品溶解在甲醇/水 (1:1, v /v ) 并均分到培养皿中，所得样品在 25°C 下在紫外线灯 (500 W) 下照射所需的持续时间，紫外线灯在 365 nm 波长处具有最大强度。在指定的时间间隔（12、24、36、48、60和72小时），将培养皿从反应器中取出并分析样品的Av浓度。

稳定性测试

根据 CIPAC MT 46 和 GB/T 19136-2003 测试了 Av 纳米输送系统的稳定性。将样品装在玻璃管中并在 0 ± 2°C 下储存 7 天，在 54 ± 2°C 下储存 14 天。然后研究了纳米递送系统中Av含量的变化。

生物测定

使用浸叶法对不同尺寸的 Av 纳米递送系统进行了生物测定。样品用不同 Av 浓度的 Triton X-100 水溶液稀释。卷心菜 (Brassica oleracea L.) 叶子浸入稀释的 Av 悬浮液中，然后在室温下干燥，并附着在培养皿上。将蚜虫幼虫引入每个培养皿中，并将处理过的蚜虫在 25°C 和 75% 相对湿度的培养箱中培养。进行四次重复以与对照试验进行比较。在治疗后 48 小时评估死亡率。使用 DPS v12.01 统计软件分析浓度-死亡率数据。计算了半数致死浓度 (LC50) 及其 95% 置信限。商业WDG用作对照。

结果与讨论

阿维菌素纳米递送系统的构建和表征

Av纳米输送系统按照图1所示的程序构建，在此过程中，水相和油相按照上述方法制备。通过高剪切乳化将油相乳化在水相（水包油乳液）中，制备粗乳液。然后通过超声乳化将粗乳液均匀分散。随后搅拌、蒸发和离心所得纳米颗粒。给药系统的粒径是影响农药释放特性和生物活性的最重要因素之一。如图 2 所示，通过控制合成参数构建了粒径范围为 344 至 827 nm 的 Av 纳米递送系统。粒度是农药控释特性的重要参数。 Av 纳米输送系统的粒径可以通过改变 PVA/明胶浓度比来控制。制备了各种 Av 纳米输送系统，尺寸范围为 344 至 827 nm，Av 含量范围为 33.4 至 57.5%（33.4、44.9、45.2 和 57.5%），如图 3 所示。所有 Av 产品都具有光滑表面和球形颗粒形态。

Av纳米递送系统制备示意图

SEM 图像 (a –d ) 和大小分布 (e ) 不同粒径的 Av 纳米输送系统

不同粒径的Av纳米输送系统中的Av含量

纳米给药系统体外释放阿维菌素

近年来，与早期的缓释和定性释放系统相比，农药释放系统的发展已转向准确和定量释放。为了实现可控释放，系统研究了具有各种粒径的 Av 纳米递送系统的释放曲线。图 4 显示了在相同时间间隔后，不同粒径的纳米递送系统中 Av 的释放百分比。技术 Av 的释放速度很快，25 小时后几乎完全释放。农药的持久有效期需要农药的缓释才能长期保持药效。与技术性阿维菌素的突释相比，所有制备的纳米递送系统均以相对较慢的速度释放 Av 并保持更长的持续释放时间。来自纳米递送系统的 Av 释放曲线包括在 240 小时的实验时间范围内突然释放，然后逐渐释放。随着递送系统尺寸从 827 纳米减小到 344 纳米，240 小时后累积释放量从 53.2% 增加到 79.4%。结果表明，随着粒径的减小，纳米递送系统的Av释放速率逐渐增加。这是由于更高的表面积暴露在周围环境中，有助于位于纳米输送系统外壳中的杀虫剂的渗透和渗出。结果表明，通过改变粒径可以有效控制纳米给药系统的Av释放速率。

不同粒径的 Av 纳米递送系统在乙醇/水中的释放行为 (50:50, v /v ) 超过 200 小时

生物活动

不同粒径纳米给药系统释放的Av对蚜虫的生物活性如图5所示。随着粒径的减小，Av纳米给药系统的LC50逐渐降低。据报道，纳米乳剂的生物利用度高于传统乳剂，因为它们的粒径更小，表面积与体积比更高。因此，具有较小粒径的 Av 纳米递送系统的较高生物活性归因于由小尺度效应引起的增加的分散性、润湿性和滞留性。与商用 Av WDG 相比，所有 Av 纳米递送系统都具有更低的 LC50 值和更高的活性。高效是由于纳米颗粒增强了Av农药在作物表面的附着力和渗透性，减少了农药在喷洒过程中的泄漏损失。

不同粒径Av纳米递送系统的生物测定结果

纳米递送系统中阿维菌素的紫外线屏蔽特性

为了验证纳米递送系统中 Av 的紫外线屏蔽性能，通过人工照射估算了 Av 的光解率。 Av 光解率随辐照时间的分析如图 6 所示。48 小时后，纳米递送系统的阿维菌素光解百分比为 18.7%，商用 Av WDG 的光解百分比为 46.7%。 72 小时后，纳米递送系统的阿维菌素光解百分比为 25.6%，商业 Av WDG 的光解百分比为 51.5%。这些结果表明，由于壁载体的保护作用，纳米递送系统对Av的光解具有抑制作用。

紫外光照射下Av光解率与商用WDG和纳米输送系统的比较

存储稳定性

通过在 0、25 和 54°C 的温度下测量它们的负载含量来评估具有不同粒径的 Av 纳米输送系统的稳定性。图 7 显示纳米递送系统在室温和低温储存期间保持稳定，Av 负载没有重大变化。由于 Av 在高温下降解，在 54°C 下 14 天后观察到少量 Av 损失。这些结果表明Av纳米递送系统具有良好的储存稳定性。

不同储存温度下Av纳米递送系统的稳定性

结论

为了提高Av的控释、化学稳定性和生物活性，采用乳液聚合法合成了不同平均粒径的Av纳米给药系统。 Av 纳米递送系统显示出一致的释放行为。由于更高的表面积，纳米递送系统的 Av 释放速率随着粒径的减小而逐渐增加。由于粘附和渗透增强，Av 纳米递送系统的生物活性随着粒径的减小而逐渐增加。 Av纳米递送系统表现出良好的抗光解性能和稳定性。该递送系统克服了当前生物农药的缺点，例如它们的环境敏感性、不良的土壤吸附和短的活性持续时间。这将提高农药效力并减少所需的喷洒频率。