牛磺酸功能化氧化石墨烯载药系统：5-氟尿嘧啶递送的制备、表征与抗癌功效

摘要

本研究利用牛磺酸（Tau）功能化氧化石墨烯（GO）以改善其生物相容性。采用改进Hummers法和超声剥离制备纳米级GO，通过化学法合成牛磺酸修饰氧化石墨烯（Tau-GO），水中分散性稳定，ζ电位-38.8 mV，粒径242 nm。基于包封效率评价，确定Tau-GO与5-氟尿嘧啶（5-FU）非共价结合的最佳配方。5-FU-Tau-GO在中性环境比酸性环境更稳定，具pH响应性和缓释效应。体内药代动力学显示，口服或静脉注射5-FU-Tau-GO均能延长5-FU在体内作用时间、提高生物利用度。MTT实验证实：5-FU-Tau-GO对HepG2细胞IC₅₀为65.2±0.7 μg/mL，远低于游离5-FU的196±8.73 μg/mL，抑癌效果显著增强。AO/EB染色显示5-FU-Tau-GO不仅破坏细胞还显著诱导凋亡。分子动力学模拟验证Tau-GO与5-FU结合力更强，形成的体系更稳定，利于体内转运释放。

引言

化疗仍是癌症治疗主流手段，但多数化疗药物难以以有效浓度渗透肿瘤组织，或对正常组织产生副作用。因此开发可控药物释放的纳米载药系统至关重要。脂质体、聚合物、纳米颗粒、树枝状聚合物、胶束、氧化石墨烯等纳米材料已广泛用于药物递送。GO作为新型碳纳米材料，拥有丰富官能团、大比表面积、高载药量、良好水分散性，广泛应用于疾病诊断、癌细胞成像、光热治疗、组织工程、靶向给药及抗肿瘤药物载体。但高浓度GO通过氧化应激诱导细胞凋亡、炎症、肺水肿等毒性效应，限制了其生物医学应用。

共价或非共价功能化可降低GO与细胞的疏水相互作用，改善生物相容性。PEG-GO可逐渐随尿粪排出；DEX功能化GO显著降低毒性并一周内清除；普鲁酸F127非共价修饰赋予良好溶解度稳定性和低毒性。尽管已有多种聚合物/分子功能化GO，但开发简单构建良好生物相容性GO载药系统的方法仍具挑战。

牛磺酸（Tau）为半必需氨基酸，稳定性好、水溶性强，具心脑血管保护、维护视力、细胞保护、免疫调节等功能，且通过调节多种癌症相关因子表达展现抗肿瘤特性。本文首次利用共价Tau功能化GO构建纳米载体，评价其体外细胞毒性，并以5-FU为模型药物非共价负载构建给药系统。5-FU-Tau-GO可减轻正常组织副作用、提高药物生物利用度，开发出具有重要生物医学应用前景的新型GO基纳米材料。

实验材料与方法

材料

石墨粉、PBS、DMSO购自天津来博化工；EDC、NHS、HCl、H₂O₂(30%)购自山东玉王实业；牛磺酸、5-FU、HepG2细胞、青霉素-链霉素、胎牛血清购自大连美仑生物；H₂SO₄(98%)、KMnO₄购自南京化工；NaNO₃、SDS-Na购自上海金津乐实业；MTT购自Sigma-Aldrich；DMEM购自HyClone；大鼠购自本溪长生实验动物中心。其余试剂均为分析纯。

GO合成

改进Hummers法：三口瓶冰浴中加168 mL 98% H₂SO₄，5℃时加入5 g石墨、4 g NaNO₃，分批缓慢加入22.5 g KMnO₄（1小时，温度<5℃）。移至油浴35℃反应30分钟，升至65℃搅拌30分钟，再升至85℃反应1小时得紫褐色糊状物。室温放置1周，转入700 mL热水中，滴加30% H₂O₂至黄褐色。10000 rpm离心，热水洗涤重复至上清液pH=7.0，真空冻干得纳米级GO。

Tau-GO合成

50 mg GO溶于50 mL蒸馏水，加150 mg EDC、100 mg NHS冰浴超声20分钟活化。滴加10 mL Tau水溶液(0.1 g/mL)，HCl调节pH 6-7，避光室温搅拌24小时。5000 rpm离心10分钟，蒸馏水洗涤3次，冻干得Tau-GO。

5-FU负载

20 mL Tau-GO溶液超声2小时。称量5-FU溶于适量水中，滴加至Tau-GO溶液中室温搅拌，30℃避光超声1.5小时。5000 rpm、4℃离心10分钟，沉淀用20 mL水洗涤离心重复3次。沉淀冻干，上清液用HPLC（Agilent 1200，C18柱，0.1% KH₂PO₄ pH 5.5流动相，1.0 mL/min，265 nm）测定游离5-FU浓度。包封率EE% = (M₁-C₁L₁)/M₁×100%；载药量LE% = (M₁-C₁L₁)/(20C₀+M₁-C₁L₁)×100%。

表征手段

FT-IR（IRAffinity-1, 4000-400 cm⁻¹）、UV-Vis（UV-3600）、粒径/ζ电位/PDI（Nano-ZS 90）、TEM（JEM-2100）、TGA（NETZSCH, 10℃/min, N₂, 0-800℃）、XRD（Bruker, CuKα, λ=1.5406 Å）、XPS（Omicron ESCA Probe, Al Kα）。

体外药物释放

pH 1.2（模拟胃液）、6.5（模拟肝癌细胞微环境）、7.4（生理环境），37℃。15 mg 5-FU-Tau-GO置于透析袋浸入50 mL含0.1% SDS-Na缓冲液，100 rpm振荡。设定时间点取1 mL释放液补充等体积新鲜缓冲液，离心后HPLC分析。

体外细胞毒性研究

MTT实验

HepG2细胞培养（DMEM+10% FBS+1%抗生素，37℃，5% CO₂），96孔板种植5×10³ cells/well，24小时后更换含不同浓度（5-100 μg/mL）5-FU、Tau-GO、5-FU-Tau-GO的培养基，再孵育24小时。加20 μL MTT继续4小时，弃液加150 μL DMSO溶解甲臜，37℃振荡15分钟，酶标仪570 nm测OD值。抑制率 = (OD_control-OD_treated)/OD_control×100%。三重复孔。

AO/EB染色

6孔板种植10⁴ cells/well，24小时后用固定浓度药物处理24小时。PBS洗涤两次，加1 mL PBS含40 μL荧光染料（AO:EB=1:1, 1 mg/mL），避光孵育10分钟，荧光显微镜观察拍照。

药代动力学研究

24只雄性SD大鼠（230-270 g）禁食12小时随机分4组。A、B组尾静脉注射5-FU和5-FU-Tau-GO；C、D组灌胃给予5-FU和5-FU-Tau-GO。剂量均20 mg/kg。给药后设定时间点（15 min, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 24, 48 h）取血0.5 mL抗凝管，7500 rpm、4℃离心10分钟分离血浆。血浆样品经(NH₄)₂SO₄沉淀、乙酸乙酯/异丙醇(85:15)萃取、氮吹干燥、流动相重溶后HPLC测定。双室模型分析药代参数。

分子动力学模拟

ChemDraw绘制5-FU结构，Materials Studio 7.0构建Tau-GO和GO模型。COMPASS II力场几何优化选取最低能构象。10 ps NVT平衡，100 ps MD模拟（298 K, 101.325 kPa, 1 fs步长）。计算均方位移(MSD)和内聚能密度(CED)，扩散系数D = 1/(2d) lim_τ→∞ d/dτ [r(t)-r(0)]²。

结果与讨论

表征分析

FT-IR（图1）证实Tau-GO共价结合：GO特征峰-OH(3405 cm⁻¹)、C=O(1723)、C=C(1628)、C-OH(1391)；Tau-GO新增酰胺峰1638、3427 cm⁻¹及-SO峰1164、1085 cm⁻¹。图2显示5-FU负载后-SO₃峰因氢键作用被淹没，证实5-FU成功负载。

UV-Vis（图3）：GO在234 nm（π-π*跃迁）和300 nm（n-π*跃迁）有特征吸收峰。粒径/ζ电位/PDI（图4、5）：GO粒径~221 nm，PDI~0.188，ζ~-33.3 mV（氧官能团负电荷）；Tau-GO粒径~242 nm，PDI~0.190，ζ~-38.8 mV（氨基取代羧基及-SO₃强电离）；5-FU-Tau-GO粒径~264 nm，PDI~0.182，ζ~-26.7 mV（绝对值>20 mV，静电排斥防聚集）。Tau-GO显著提高5-FU水溶性，5-FU-Tau-GO水溶液稳定分散。

TEM（图6）：GO平皱层状结构；Tau-GO层状结构保持，尺寸略增大；5-FU-Tau-GO未聚集，GO初始层状结构完整，稳定性好。TGA（图7）：800℃残余质量GO 39.73%，Tau-GO 34.22%，推算Tau含量~13%。XRD（图8）：GO特征峰10.7°（2θ），Tau-GO峰位微移至8.2°，证实功能化成功。XPS C1s谱（图9）：Tau-GO新增C-N键成分峰（氨基/酰胺），进一步确认功能化。

药物负载与释放行为

5-FU通过非共价作用吸附于Tau-GO。标准曲线y=62.135x+21.873 (r=0.9999, 6.5-250 μg/mL)。EE随药物浓度增加而升高，最高83.2%；LE为33.7%（即1 mg Tau-GO吸附508.52 μg 5-FU）。高载药机制：①Tau引入-SO₃基团，强电离减少GO团聚利于负载；②ζ电位变化12.1 mV证实5-FU表面吸附，静电作用关键；③5-FU与Tau-GO间存在多种氢键（-COOH/-NH-、-COOH/C=O、-OH/-NH-、-OH/C=O、-COOH/-F等），稳定体系。

体外累积释放（图10）：pH 7.4缓慢持续释放，72小时累计释放~70.84%；pH 1.2和6.5分别达~90.29%和~85.75%。低pH下氢键质子化程度高，氢键强度随pH调控导致5-FU释放。该pH敏感系统利于抗肿瘤药物在肿瘤微环境释放。

体外细胞毒性研究

MTT实验（图11）：Tau-GO各浓度无显著细胞毒性；5-FU-Tau-GO呈剂量依赖性抑制，证实载药能力。IC₅₀：5-FU-Tau-GO 65.2±0.7 μg/mL < 游离5-FU 196±8.73 μg/mL。原因可能：Tau诱导肿瘤细胞凋亡间接增强5-FU抑制；缓释延长药物有效作用时间。

AO/EB染色（图12）：对照组梭形细胞绿色核；Tau-GO组小部分核凹陷深绿/橙红；5-FU组显著橙/红凋亡核（染色质碎片、凋亡小体）；5-FU-Tau-GO组几乎所有细胞形态改变，大量细胞碎片和凋亡小体，不仅破坏细胞更显著诱导凋亡，杀伤效果最好。

药代动力学研究

图13a口服给药：5-FU-Tau-GO血浆浓度各时间点均高于游离5-FU。图13b静脉注射：5-FU-Tau-GO实现24小时缓释，前几小时浓度逐渐下降。

表1药代参数：口服给药5-FU-Tau-GO T_1/2β为游离5-FU的2.3倍，AUC_0-t约2.1倍；静脉注射T_1/2β为3.0倍，AUC_0-t约2.8倍。结论：5-FU-Tau-GO显著延长体内保留时间、提高生物利用度。口服T_1/2β(1.67±1.15 h) > 静脉(1.33±0.64 h)，但口服AUC(36.02±1.83 mg/L·h) < 静脉(96.50±8.70 mg/L·h)。原因：静脉给药直接进入血液循环避开胃肠屏障；5-FU损伤胃肠道可能影响药物有效利用。

分子动力学模拟

分子对接（图14）：5-FU与GO、Tau-GO键长分别3.66 Å和2.602 Å；结合能分别47.69和25.04 kcal/mol，Tau-GO结合力更强，归因于Tau极性原子(S、N)与5-FU形成更强非共价键。分子动力学（图15、16）：CED分别2.67×10⁸和2.83×10⁸，MSD斜率得扩散系数分别0.094和0.058 m²/s，均证实Tau-GO与5-FU相互作用更强，体系更稳定。

结论

成功通过简单化学法制备Tau-GO纳米复合材料。Tau功能化赋予GO良好稳定性和生物相容性。Tau-GO独特结构与优异性能为5-FU负载递送提供绝佳平台。5-FU-Tau-GO具潜在抗肿瘤能力和优异药物循环时间。以Tau为载体修饰GO负载5-FU，是构建纳米给药系统用于抗癌药物递送和抗肿瘤治疗的有效实用工具。