胶质母细胞瘤细胞中金纳米结构的形状依赖性摄取：从合成到细胞相互作用

摘要

具有可控尺寸和形状的金纳米结构（Au NSs）正成为纳米医学的多功能工具。然而，不同几何形态的细胞命运仍知之甚少，特别是在胶质母细胞瘤等侵袭性癌症中。本文利用种子介导生长法配合双表面活性剂和改进Turkevich法，合成了五种不同Au NSs——纳米棒（NRs）、四六面体（THH）、双锥（BPs）、球形颗粒（SPs）和一种新型形状纳米枕头（NM）。所有颗粒经PEG-SH和11-巯基十一烷酸（MUA）表面修饰，赋予负电荷和空间位阻稳定性。U-87 MG胶质母细胞瘤细胞细胞毒性实验（LIVE/DEAD）显示形状依赖效应：NM在2 mg/mL时诱导最高细胞死亡率（~20%），而SPs和BPs基本无毒。透射电镜显示NM在2小时内通过受体介导的内吞作用进入细胞，随后触发大胞饮作用，导致囊泡积累并最终使细胞脱落。研究表明，颗粒形态而非单纯尺寸决定细胞摄取途径和细胞毒性结果，定位NM为胶质母细胞瘤靶向光热治疗和药物递送的有前景候选者。

研究背景

金纳米结构因其形状和尺寸依赖的光学与电子性质备受青睐，应用范围从生物传感到光热治疗。可见-近红外（NIR）区的局域表面等离子体共振（LSPR）使各向异性颗粒（特别是高长径比纳米棒）成为计算机断层扫描和光声成像的优秀对比剂。较小纳米结构展现更优吸收，增强光热效率。此外，各向异性形状可自组装成超结构，产生强电磁场，有利于表面增强拉曼散射和靶向药物递送。

辅以银离子和表面活性剂混合物（如CTAB配合油酸或DDAB）的种子介导生长法，已成为定制Au NSs的首选方法，因其能精确控制长径比和晶面生长。尽管合成技术进步，但不同几何形态与细胞（特别是胶质母细胞瘤——一种高增殖、侵袭性脑肿瘤）相互作用的系统研究仍有限。理解这些相互作用对于设计选择性靶向癌细胞同时最小化脱靶效应的纳米药物至关重要。

胶质母细胞瘤（GBM）仍是最致命的原发性脑肿瘤，尽管积极治疗，中位生存期不足15个月。U-87 MG胶质母细胞瘤星形细胞瘤细胞增殖迅速（倍增时间~32小时）且易内化外来颗粒，适合摄取研究。本文全面比较五种Au NS形状，聚焦合成、表面修饰、细胞毒性及U-87 MG细胞摄取机制。

实验部分

材料

所有试剂（油酸、硝酸银、CTAB、HAuCl₄·3H₂O、抗坏血酸、NaBH₄、PEG-SH、MUA等）购自Sigma-Aldrich或Merck，未经进一步纯化直接使用。溶液用超纯水（18.2 MΩ·cm）配制。

各向异性Au NSs合成

种子颗粒（~5 nm）通过CTAB中NaBH₄还原HAuCl₄制备。纳米棒、四六面体和双锥的生长液含CTAB、助表面活性剂（油酸或DDAB）、AgNO₃和抗坏血酸，加热至80°C。冷却后加入种子液和HAuCl₄，35°C搅拌24小时。调节油酸/CTAB比例获得所需形态：低比例产生哑铃状纳米棒，较高比例给出细长四六面体，CTAB/DDAB组合产生双锥。新型纳米枕头形状采用两步生长：初始种子介导反应后，利用中间产物进行第二生长阶段，形成类似枕头的三维不规则颗粒（枕头=日语makura）。

球形Au NSs合成

SPs采用改进Turkevich法：10 mM柠檬酸钠溶液（10 mL）加热至70°C，滴加1.5 mM HAuCl₄（10 mL）。混合物约8分钟变紫红色，冷却至室温后离心（14500 rpm，10分钟）。

表面功能化

颗粒先与PEG-SH（1 mg/mL）孵育2小时置换CTAB并提供空间位阻稳定。离心后，PEG化NSs用MUA（250 μL 10 mM于EtOH/H₂O）55°C处理1小时，实现CTAB完全去除并赋予负表面电荷。动态光散射（DLS）监测尺寸和Zeta电位；XPS确认表面溴元素去除。

细胞培养与活力检测

U-87 MG细胞在补充10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1% NEAA、1 mM丙酮酸钠、1.25%庆大霉素的EMEM中培养。细胞毒性实验中，70%融合度细胞与Au NSs在100、200、500 μg/mL和2 mg/mL孵育24小时。LIVE/DEAD实验（钙黄绿素AM和乙锭同素-1）和Hoechst核染色量化细胞死亡，蔡司Axiovert 200 M显微镜成像。每浓度三个独立孔分析。

时间依赖性摄取研究（NM）

细胞暴露于2 mg/mL NM 2、6、12、24小时。孵育后用2%多聚甲醛和2.5%戊二醛固定，偏铁酸钾（±亚铁氰化钾）后固定，脱水、包埋，制备超薄（70 nm）TEM切片。TEM图像追踪NM在细胞区室内的定位和形态。

表征手段

明场STEM和高分辨TEM（JEOL 2100，200 kV）评估形貌和结晶度。UV-Vis光谱（200-800 nm）在Shimadzu UV-2401PC记录。动态光散射和Zeta电位在Malvern Zetasizer Nano-ZS测量。XPS用Kratos Axis Ultra DLD光谱仪（Al Kα，1486.6 eV）进行。

结果与讨论

各向异性Au NSs合成与表征

双表面活性剂种子介导生长高产率制得纳米棒（~20 nm × 50 nm）、四六面体（~50 nm棱长）和双锥（~200 nm）。纳米枕头颗粒展现独特三维不规则形貌，多取向TEM确认。高分辨TEM显示NRs单晶核心且平滑晶面，而NM表面锯齿状、LSPR带较宽，反映其多分散性。UV-Vis光谱显示明显纵横向等离子体峰：NRs（516、679、796 nm）、THH（≈568 nm）、BPs（≈593 nm）、NM（≈557和760 nm）。SPs单峰520 nm。

表面功能化结果

DLS测量显示PEG-SH和MUA包覆后尺寸递增，除BPs因更紧密堆积略微减小。Zeta电位从正（CTAB包覆）转为负（MUA包覆），确认配体交换成功。XPS谱溴信号可忽略，表明CTAB近乎完全去除。光谱基本不变，各向异性形状仅轻微峰展宽，归因于尺寸增大和表面粗糙度增加。

形状依赖性细胞毒性

LIVE/DEAD实验显示NM诱导最高细胞死亡率（~20%，2 mg/mL），而SPs和BPs所有浓度下细胞毒性<5%。NRs尽管高长径比和正表面电荷，未增加细胞死亡，提示Zeta电位测量的表面电荷可能不准确反映各向异性颗粒的真实局部电荷。总体而言，尺寸作用次要；15 nm SPs和650 nm BPs展现可比摄取和毒性。

纳米枕头摄取机制

时间分辨TEM显示NM 2小时后与质膜结合，随后通过受体介导内吞作用内化。12小时出现含NM囊泡，指示转为大胞饮作用，可能因聚集和蛋白吸附。NM优先定位于内体周边，与囊泡膜对齐，向核周区域转运。24小时大量囊泡积累伴随形态改变：细胞失去丝状伪足、变圆、从基底脱落，指示细胞骨架破坏和凋亡。

讨论

结果突显颗粒形态对细胞摄取途径的关键影响。虽然各向异性形状增强光学和光热性质，但其不规则几何可能增加蛋白冠形成，促进大胞饮作用和细胞毒性。纳米枕头颗粒凭借枕头状结构实现高效内化和显著细胞死亡，成为胶质母细胞瘤治疗的有吸引力候选者。未来研究应探索体内生物分布和治疗功效，以及靶向配体修饰以提高选择性。

结论

我们合成了五种不同形状和尺寸的金纳米结构，统一用PEG-SH和MUA功能化得稳定负电荷颗粒。形状而非单纯尺寸决定U-87 MG胶质母细胞瘤细胞的摄取和细胞毒性。新型纳米枕头形状展现卓越内化能力，通过受体介导内吞和后续大胞饮作用导致显著细胞死亡。这些发现确立纳米枕头作为侵袭性脑肿瘤联合光热治疗和药物递送的有前景平台。

缩写

AgNO₃

硝酸银

Au

金

BF

明场

BPs

双锥

CTAB

十六烷基三甲基溴化铵

DDAB

二癸基二甲基溴化铵

DLS

动态光散射

EMEM

Eagle最小必需培养基

EthD-1

乙锭同素-1

GBM

胶质母细胞瘤

HAuCl₄

氯金酸

HRTEM

高分辨透射电镜

IR

红外

LSPR

局域表面等离子体共振

MUA

11-巯基十一烷酸

Na-citrate

柠檬酸钠二水合物

NM

纳米枕头

NRs

纳米棒

Ns

纳米结构

OA

油酸

PEG-SH

O-[2-(3-巯基丙酰氨基)乙基]-O-乙基聚乙二醇

STEM

扫描透射电镜

TEM

透射电镜

THH

四六面体

UV-Vis

紫外-可见光谱

XPS

X射线光电子能谱