生长用于形状选择性细胞摄取的金纳米结构

背景

金纳米结构 (NSs) 因其形状和尺寸依赖的光学和电子特性而被用于各种生物医学应用 [1]。 Au NSs 显示出可修改且对环境敏感的局部表面等离子体共振 (LSPR) [2]。可见光范围内的 Au LSPR 使它们成为生物传感器和计算机断层扫描 (CT) [3, 4] 以及光声成像 [5] 的良好造影剂的合适候选者。具有更高纵横比（AR，定义为纵向与横向尺寸的比率）的 NS 在纵向等离子体波长下更有效地散射光，因此在光学成像应用中比球形 NP 表现更好。较小的 NS 具有更高的吸收效率，从而提高了光热疗法的效率 [6,7,8,9]。此外，各向异性结构最近已被用于形成具有优异等离子体特性的自组装结构，这些特性源于高效淬火、极高的摩尔吸收率以及高度局部化和强电磁场的发展 [10,11,12,13]。能够调节Au NSs的纵横比和尺寸，可以合成不同的结构以满足多种应用，包括局部加热、传感、封装和释放目标分子等[14,15,16]。

Au NSs 通常使用电模板 [17]、光化学还原技术 [18] 或有或没有 Ag [19, 20] 的种子生长合成。近年来，通过使用有机添加剂或二元表面活性剂混合物来控制 NS 生长，对种子生长合成进行了进一步修改 [21,22,23,24,25]。所采用的合成条件允许通过调整 Au NSs 的尺寸和形状来调整它们的性质，从而改变 NSs 的散射和吸收截面。当 NSs 被引入生物环境时，这些 Au NSs 的理化特性（大小、形状和表面化学）在细胞摄取中起着至关重要的作用，即纳米颗粒 - 细胞相互作用。了解这种相互作用对于探索利用不同形状的 Au NS 的新生物医学应用至关重要 [26,27,28,29,30]。例如，金纳米棒可用于诱导癌细胞中的细胞过热，可能会干扰细胞功能，并在某些情况下通过棒的表面修饰来改变它们 [30,31,32,33,34]。陈等人。有报道称，Au 纳米笼可用于靶向光热破坏乳腺癌细胞 [35]。此外，最近的报告表明，纳米粒子的形状可能与大小相同或更多地决定细胞摄取 [36, 37]。这需要在对体外描述很重要的其他相同条件下筛选几种形状（即各种形状的 Au NSs 与细胞的相互作用）。 据我们所知，目前还没有关于除球体和纳米棒以外的不同形状的 Au NSs 与细胞相互作用的综合研究 [38, 39]。

在这里，我们研究了五种不同形状的 Au NSs 与胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞的相互作用及其细胞摄取。多形性胶质母细胞瘤 (GBM) 被归类为最具侵袭性的恶性人类脑肿瘤之一。患有 GBM 的患者预后不佳，化疗和标准治疗的平均生存时间不到 15 个月 [40, 41]。胶质母细胞瘤-星形细胞瘤不仅从医学角度而且因为它们的快速生长对于摄取研究特别有趣。胶质母细胞瘤-星形细胞瘤的细胞培养物的群体倍增时间为 32 小时，并且持续需要细胞外营养。因此，它们极有可能迅速吞噬异物，例如 Au NSs，这些异物会打开，例如用于肿瘤热消融 [42]、细胞标记或药物递送。

在目前的工作中，已经合成了五种不同形状的 Au NSs：四种各向异性 NSs（纳米棒––NRs，纳米makura–– NM、四六面体--THH、双锥体--BPs）通过种子介导的生长方法，使用二元表面活性剂混合物和球形（SP）颗粒，使用改进的 Turkevich 方法 [43]。 NSs 的形状可以通过改变两种不同表面活性剂的比例来定制。当遵循两步种子介导的生长方案时，Au nanomakura (小仓 枕头是日语 ) 合成。在将 Au NSs 与胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞共孵育之前，进行了两步表面改性以用 11-巯基十一烷酸 (MUA) 替换钝化配体。评估形状和浓度对胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞毒性和NSs摄取的影响。

实验

材料

油酸（OA，90%）购自 Alfa Aesar。硝酸银 (AgNO3)、二癸基二甲基溴化铵 (DDAB, 98%)、氯金酸 (HAuCl4.3H2O, 99.999%)、D-(−)-异抗坏血酸 (AsA, 98%)、硼氢化钠 (NaBH4, ≥ 96%) 、分子量为 5000 Da 的 11-巯基十一烷酸（MUA，98%）和 O-[2-（3-巯基丙酰氨基）乙基]-O-乙基聚乙二醇（PEG-SH）购自 Sigma-Aldrich。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，99%+）购自 Acros Organics，柠檬酸钠二水合物（柠檬酸钠，ACS 级）购自 Merck。所有化学品均按原样使用，无需进一步纯化。所有溶液均使用由 Simplicity® Millipore 水纯化系统纯化的蒸馏去离子水（电阻率 ~ 18.2 μΩ-cm）制备。

各向异性金的合成

通过使用二元表面活性剂，使用银辅助种子生长方法合成各向异性 Au NSs（表 1）。图 1a 显示了用于 NRs、THH 和 BPs 生长的合成方法示意图。

Au NSs的合成示意图。 一 示意图显示了用于合成不同形状的 Au NSs 的 Ag 辅助种子生长机制。 b 示意图显示了 nanomakura 的双种子生长机制

简而言之，首先将 5 mL 0.5 mM HAuCl4.3H20 与 5 mL 0.2 M CTAB 溶液混合并搅拌。之后，将 1.6 mL 的 3.75 mM NaBH 4 加入到混合物中并在搅拌下反应 2 分钟，以使反应过程中形成的气体逸出。等待 30 分钟后，种子溶液用于进一步生长。

在典型的生长反应中，如表 1 所示，在 80°C 下制备 15 mL 不同比例的 CTAB 和辅助表面活性剂的水性混合物。将表面活性剂溶液冷却至室温后，750 μL 4 mM AgNO3 溶液加入并在 35°C 下搅拌 15 分钟。随后加入 15 mL 1 mM HAuCl4.3H2O 溶液，并在搅拌下再混合 15 分钟。之后，加入 135 μL 0.063 M AsA 和 96 μL Au 晶种，反应在 35 °C 下运行 24 小时。使用离心分离产物。重要的是要注意，在 OA 的情况下，生长溶液的初始黄色在 15 分钟内（在添加种子之前）释放，表明 Au ³⁺ 到 Au ⁺ .图 1b 显示了 NM 合成的示意图，它基于双种子生长方法。遵循的协议与上面报道的相似，除了将中间生长溶液 (300 μL)（在将 Au 种子添加到第一个生长溶液后几乎立即获得）而不是常规种子添加到新鲜的生长溶液中并允许反应在 35°C 下持续 24 小时。

球形 Au NSs 的合成

使用改进的Turkevich 方法合成球形Au NSs [44]。在典型的合成中，将 10 mL 的 10 mM 柠檬酸钠溶液添加到 25 mL 反应烧瓶中，并保持在 70 °C。滴加 10 毫升 1.5 mM 氯金酸 (HAuCl4. 3H2O)，并在 70°C 剧烈搅拌下反应 20 分钟。反应后大约 8 分钟，溶液变成紫红色。之后，将溶液冷却至室温，使用 14,500 rpm 离心 10 分钟将球形 Au NSs 与未反应的溶液分离。

Au NSs 的表面功能化

为了交换 Au NSs 表面的配体，Thierry 等人改编和修改了一个两步程序。 [45] 被遵循。合成后的 NSs 的浓度调整为 1 mg mL ^-1 在功能化步骤开始之前。第一步取决于引入 PEG-SH 层以部分替换结合的 CTAB 双层，因为硫醇对 Au 表面具有更大的亲和力 [46]。此外，PEG-SH 层为 NS 提供空间稳定性。第二步，置换残留的CTAB，PEG-SH层进一步与烷硫醇MUA交换。 MUA允许从空间位阻PEG-SH包被的Au表面完全去除CTAB。

在典型的功能化程序中，1 mL 的 1 mg mL ⁻¹ Au NS 的溶液与 1 mL 的 1 mg mL ^-1 混合 PEG-SH 溶液。将混合溶液保持在剧烈搅拌下，允许用 PEG-SH 部分替换 CTAB 2 小时。之后，通过以 14,500 rpm 离心 20 分钟去除聚乙二醇化 NS，并重新分散在 1 mL MQ 水中。为了用羧酸基团对 Au NS 进行功能化，将 500 μL 聚乙二醇化 NS 溶液与 250 μL 10 mM MUA 在乙醇/水中制备的溶液混合，并使其在保持在 55°C 的声波浴中反应 1 小时.之后，使用 14,500 rpm 离心 20 分钟将 MUA 包覆的 Au NSs 与游离 MUA 分离。 MUA包覆的Au NSs在MQ水中容易再分散。

体外研究

胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞培养

人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞（U-87 MG，ECACC，Sigma-Aldrich，Salisbury，UK）在含有 1.25% 庆大霉素（Sigma）和 10% 胎牛血清（Autogen Bioclear，Wiltshire，英国）。培养物补充有 2 mM L-谷氨酰胺、1% 非必需氨基酸（NEAA，Sigma）和 1 mM 丙酮酸钠（NaP，Sigma）。

LIVE/DEAD® 检测

LIVE/DEAD 细胞活力测定（Invitrogen，Life Technologies）评估细胞膜的完整性，由两种不同的染料组成：钙黄绿素 AM（激发/发射 494/517 nm）和乙锭同源二聚体-1（激发/发射 517/617纳米）。在活细胞中，细胞内酯酶与钙黄绿素 AM 反应并产生细胞质绿色荧光。 Ethidium homodimer-1 (EthD-1) 在死细胞受损的细胞膜上扩散，在那里它与核酸结合并发出红色荧光。用 NSs 标记后，如制造商所述，对胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞进行 LIVE/DEAD®-细胞活力。简而言之，在 4.5 mL PBS 中制备 LIVE/DEAD® 溶液，其中含有 2.7 μL 钙黄绿素 (Invitrogen)，并以 1:1 (v /v ) 比率，并在显微镜检查前在 37°C 下反应 30 分钟。添加核染色剂（Hoechst 33258，激发/发射 356/465 nm，Sigma）（200 μg mL ^-1 ) 以可视化细胞核并阐明 Au NS 的任何核摄取。使用 AxioVision Rel 在 Axiovert 200 M 荧光显微镜（Zeiss，德国）上以 × 40 或 × 10 的放大倍率进行成像。 4.3 软件。图像后来使用 ImageJ 1.46 处理。

基于浓度评估细胞毒性

70% 汇合的细胞用 Au NS 标记，NS/培养基体积为 100 μg mL ^-1 , 200 μg mL ⁻¹ , 500 μg mL ⁻¹ , 和 2 mg mL ⁻¹ 并在 9 孔板 (Corning®) 中在 37°C 下孵育 24 小时。每个浓度准备三个平行（孔）。在汇合的同一阶段，未标记的胶质母细胞瘤-星形细胞瘤培养物被用作对照。通过人工计数计算死细胞的百分比。胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞的高度无序形态使得自动计数不太可靠。在每个孔中拍摄活细胞和死细胞的三个叠加图像，并计算每个形状的平均活细胞和死细胞。对空白样品进行同样的处理，通过减去空白的平均死/活来评估活力。

评估作为时间函数的 nanomakura Au NS

70% 汇合的细胞用 nanomakura 标记 2 mg mL ⁻¹ NS/培养基体积的 Au NS 并在使用核染色进行 LIVE/DEAD® 检测之前在 37°C 下孵育 2、6、12 和 24 小时。在汇合的同一阶段，未标记的胶质母细胞瘤-星形细胞瘤培养物被用作对照。在初级固定在多聚甲醛 (2% v /v ) 和戊二醛 (2.5% v /v ) 在 PBS (0.1 M, pH =7.4) 中过夜。对于二次固定，制备了两种不同的固定剂以对细胞内膜进行最佳染色。两者均在 0.1 M 甲胂酸盐缓冲液中制备，其中一种含有 1% 四氧化锇 (v /v ) 和另一个含有 1% 四氧化锇 (v /v ) 和 1.5% 亚铁氰化钾 (v /v ）。室温二次固定后1小时，酒精逐步脱水，环氧丙烷脱水，浸润，70 nm切片超薄切片。

表征技术

明场 (BF) STEM 图像是使用 Hitachi S-5500 电子显微镜在 30 kV 加速电压下操作获得的。使用在 200 kV 下运行的 JEOL 2100 获取高分辨率透射电子显微镜 (HRTEM) 图像。使用 Malvern Zetasizer Nano-ZS 仪器和制造商自己的软件测量 NS 的尺寸分布和 zeta 电位。动态光散射 (DLS) 测量基于球形粒子假设，不适用于测量各向异性 NS 的流体动力学尺寸，而无需多角度设置和对所得数据的严格拟合。然而，DLS 已在本研究中用作定性跟踪功能化过程引起的尺寸变化的一种手段。在所有情况下都使用MQ水作为溶剂。紫外-可见 (UV-Vis) 光谱是用 UV-2401PC (Shimadzu) 分光光度计获得的。在 200 到 800 nm 的光谱范围内收集光谱。 X 射线光电子能谱 (XPS) 分析是使用 Kratos Axis Ultra DLD 光谱仪（Kratos Analytical，UK）进行的，该光谱仪配备了单色化铝 X 射线源（Al，hν =1486.6 eV），在 10 mA 和 15 kV（ 150 瓦）。在 0-1100 eV 结合能范围内收集调查光谱，分析仪通过能量为 160 eV。采用混合透镜（静电和磁）模式，分析区域约为 300 μm × 700 μm。

结果与讨论

各向异性 Au NSs 的合成和表征

使用二元表面活性剂混合物通过种子介导的生长方法合成各向异性 Au NSs。当 CTAB 加帽的 Au 种子（~ 5 nm）被添加到二元表面活性剂混合物的生长溶液（OA CTAB 的摩尔比~ 20:1）时，形成了低纵横比的 Au NR（图 2a 和表 2）。 HRTEM 图像揭示了 NR 的单晶和狗骨形态（图 2a 中的插图）。 OA 是一种脂肪酸，也是一种弱还原剂，可促进 Au ³⁺ 的还原 到 Au ⁺ .生长溶液颜色从黄色变为透明（~ 15 分钟）证实了我们的观察。进一步向生长溶液中加入抗坏血酸可提高 Au ⁺ 的还原率 .结果，Au 原子在 NRs 的 {111} [16] 端面快速扩散，因为与 NRs [25] 的 {110} 侧和 {100} 端相比，混合胶束结构的堆积密度较低。因此，末端{111}面的NRs比侧{110}和{100}面的过度生长导致形成狗骨形态的NRs。我们的结果还表明，{110} 面不太可能被 Au 覆盖，因为与其他面相比，这些面与表面活性剂分子的相互作用很强。我们还证实了 OA 和抗坏血酸在形成狗骨形态的 Au NR 中的作用。当生长溶液中 OA 或抗坏血酸的浓度降低时，只能获得 Au NRs。这些结果表明金原子的还原速率和扩散速率降低，导致形成 Au NR（附加文件 1：图 S1，ESI†）。

不同形状的 Au NS 的 STEM 图像和 UV-Vis 光谱。 一 狗骨形态的 Au NRs 的 BF-STEM 图像和插图中的 HRTEM 图像显示了 NRs 的单晶性质。 b 细长四六面体 Au NSs 的 BF-STEM 图像（插图是 SEM 图像）。 c Au BPs 的 SEM 图像（插图是单个 BP 的 SEM 图像）。 d Au 球形颗粒的 TEM 图像（插图中的 HRTEM 图像显示了 Au 颗粒的多晶性质）。 e Au NMs 的 BF-STEM 图像。 f 不同形状Au NSs的紫外-可见光谱

当生长溶液中 OA 相对于 CTAB 的浓度增加时（表 1），获得拉长 THH 形状的 Au NSs（图 2b 和表 2）。 Au NSs形状的变化可以基于OA对混合胶束结构的修饰来解释。棒状混合胶束结构是在低浓度的 OA 下形成的。混合胶束结构中 OA 量的增加将其结构修改为凸面并促进拉长的 THH Au NSs 的形成。我们之前的研究还表明，助表面活性剂浓度的增加会使混合胶束结构更加凸出 [25]。 Au NSs 的形状也可以通过用 DDAB 代替 OA 来改变。我们通过使用 CTAB 和 DDAB（图 2c 和表 2）获得了双锥（BP）形状的 Au NSs（图 2c 和表 2），如我们之前的工作 [25] 所报道的。此外，通过改进的Turkevich方法合成了球形Au颗粒（图2d）。

我们还研究了种子溶液对 Au NSs 形状的影响。反应 1 分钟后，从 CTAB 和 OA (OA:CTAB ~ 20:1) 的生长溶液中取出种子溶液，并添加到含有 OA:CTAB ~ 20:1 的新鲜生长溶液中。 nanomakura的Au NSs （NM）形态在生长反应完成后获得（图 2e）。 NM 的形态看起来类似于狗骨。然而，由于 NS 在各个方向上生长，如以不同角度拍摄的 TEM 图像（图 3a 和表 2）所示，因此，我们将这些 NS 称为 NM。为了说明 Au NMs 的生长机制，在不同的时间间隔从生长溶液中取出少量体积，并使用 STEM 成像分析中间反应（图 3b）。当 CTAB 包被的种子颗粒加入到第一个生长溶液中时，生长溶液的颜色迅速变成深紫色，表明形成了各向异性的 Au NSs。将 300 μL 来自第一次生长溶液的溶液加入到第二次生长溶液中，然后立即将几滴溶液加入 TEM 网格中。

Au NM (nanomakura ）。 一 从不同角度拍摄的 NM 的 TEM 图像。 b BF-STEM 图像显示了 NM 型 Au NSs 形成过程中的生长步骤。从不同时间点的生长液中取出的溶液直接加入TEM网格中，无需纯化

代表性 STEM 图像显示，Au NM 在纵向上的生长速度比横向 (0 s) 的生长速度要快。 30 秒后，看到类似于领结结构的 NS。在反应大约 3 分钟时已经观察到具有最终尺寸的 NM。在 30 分钟和 8 小时后，我们没有看到 NS 的形状和大小有任何进一步的变化。根据我们的分析，可以假设 Au NMs 的整体生长遵循随机的“爆米花”式自催化生长机制，其中单个种子休眠一段时间后突然快速生长为最终形状，如Cortie 等人对 NR 进行了观察。 [47]。 NMs 具有三维结构，由在不同旋转角度下获得的 NMs 的 HRTEM 图像显示（图 3a），与之前报道的狗骨状 NSs [48, 49] 不同。

测量了不同形状的 Au NSs 的光学特性，结果如图 2f 所示。 Au NSs 在紫外-可见光-可见光-近红外 (IR) 范围内显示出可调的 LSPR 特性。由于沿不同轴的共振，等离子体带分裂成各向异性结构的多重峰——纵向和横向带。 NR 显示至少三个不同的波段——516 纳米、679 纳米和 796 纳米，最强的是中间的波段。第三条带的出现可能与由于油酸的蚀刻作用引起的 NR 的多分散性有关。这导致形成具有粗糙边缘的纳米棒。对于 NM，观察到横向和纵向共振峰（分别为 557 和 760 nm），其比纳米棒具有更多的锯齿状表面。然而，对于较大的结构（THH 和 BP），分别在 568 nm 和 593 nm 处观察到单个和宽的 LSPR 峰。虽然 THH 的紫外-可见光谱与之前的研究 [50] 相似，但 BP 的两种模式似乎融合成一个宽峰，不像其他观察到的 [51]。这可能是由于 BP 形状的产量低或应用于 Au NS 的非形状选择性离心或导致溶液中形状各向异性的不均匀涂层。

Au NSs 的表面功能化

使用两步法对不同形状的 Au NSs 进行功能化——用 O-[2-(3-巯基丙酰氨基) 乙基]-O-甲基聚乙二醇 (PEG-SH) 替换双层 CTAB，随后用 MUA 替换。图 4a 显示了功能化每个阶段的 NS 的流体动力学直径。与 CTAB 涂层的 NS 相比，每个 NS（BP 除外）的尺寸连续增加，表明功能化成功。由于DLS测量基于球形粒子假设，因此各向异性NSs的尺寸确定分析必须近似于具有与各向异性NSs相同扩散系数的球形NSs。

Au NSs 的大小和 zeta 电位。 一 每个功能化阶段后 Au NSs 的 DLS 大小的变化。 b Au NSs zeta 电位随功能化的每个阶段的变化。 X -轴代表不同形状的金纳米结构（NR纳米棒、THH四六面体、NM纳米makura , BP 双锥体, SP 球形)

这澄清了 PEG-SH 涂层 BP 的尺寸略有减小，并且还支持上述 UV-vis 数据。由于功能化，NS 的表面电荷大量减少，如图 4b 所示。阳离子表面活性剂很容易被 PEG-SH 取代，由于对 Au 表面的亲和力更高，PEG-SH 进一步被 MUA 取代。由于 MUA 的小尺寸，即使在聚乙二醇化后，它也具有更高的灵活性来取代残留在 NSs 上的 CTAB。 MUA 涂层 NSs 的最终 zeta 电位值反映了除 NRs 之外的所有 NSs 的带负电荷的表面。这种差异可能与小 NR 的不均匀涂层或其多分散性以及所应用的测量原理有关。对于球形 NS，初始负表面电荷是由于柠檬酸盐涂层。然而，所有 NSs 的高 zeta 电位确保了 NSs 在水溶液中的稳定性。在每个功能化阶段之后对 Au NSs 进行 XPS 测量，即使用 PEG-SH 和 MUA 显示表面上的溴含量非常低，证实从 NSs 表面大量去除结合的 CTAB。 （表 1，ESI）。

此外，用 PEG-SH 和 MUA 涂覆 NSs 不会显着改变它们的光学特性。然而，在各向异性 NSs 功能化后获得连续峰展宽（附加文件 1：图 S3，ESI†）。这可能是由于各向异性、非均匀涂层、尺寸扩大（DLS 数据）、样品的多分散性或上述因素的组合导致 NS 的不同旋转轴。由于 Au NSs 的光学特性取决于形状、表面、大小和聚集状态，因此它们与细胞的相互作用也是如此。细胞相互作用研究可以揭示 Au NSs 的吸收程度及其细胞毒性作用，并可以为未来的治疗和诊断应用指明方向。

不同形状的Au NSs的细胞相互作用

通常，Au NSs 通过内吞作用进入细胞，内吞作用可以是受体介导的或受体非依赖性的，通过肌动蛋白依赖性吞噬作用，或通过其他目前未知的内吞途径 [52]。描述 NS 采用哪条路线至关重要，因为它最终决定了 NS 细胞内的命运 [53]。研究表明，细胞内摄取的机制取决于 NS 的理化性质、AR 和表面特征，以及细胞类型 [54,55,56,57,58]。表面稳定分子的电荷将有效地成为 NS [59] 的电荷。带正电的 NSs 在生物介质中具有很强的蛋白质吸附能力，可以严重破坏细胞膜。因此，优选中性或负电荷以避免在细胞膜上的强吸附和/或蛋白质吸附 [26, 60]。此外，NSs的形状将决定稳定分子的表面覆盖在多大程度上是均匀的[61]。

在这里，除了球形 NSs 外，所有 Au NSs 都是用表面活性剂 CTAB 合成的。在细胞相互作用研究之前，Au NSs 用 MUA 功能化以获得带负电荷的表面。随后将稳定的 MUA 包覆的 Au NS 与人胶质母细胞瘤-星形细胞瘤细胞共孵育 24 小时，并通过 LIVE/DEAD® 测定评估形状和浓度对细胞毒性的影响，并辅以核染色以突出细胞内 Au NS .

在高浓度的 NM 中观察到最高的细胞死亡（图 5a），空白校正后细胞死亡接近 20%。其他 NSs 在细胞毒性方面没有表现出相同的趋势，这可能表明 NMs 以比其他形状更高的速率/体积被吸收 [62]。空白校正后，这些形状的细胞计数显示细胞毒性低于 5%（对于所有形状的图像，请参阅附加文件 1：图 S4，ESI†）。

Effect of Au NSs on glioblastoma-astrocytoma cells. 一 Percentage cell death of glioblastoma-astrocytoma cells as a function of concentration of AuNSs. Incubation time was 24 h. Images b –m are acquired after incubation of makura -shaped AuNSs in glioblastoma-astrocytoma cells taken at several time points up to 24 h. b TEM shows an invagination of the cellular membrane (m membrane, scale bar = 1 μm), and c halogen and d fluorescence images show association of makura-shaped AuNSs at the cellular membrane. e Uptake of makura-shaped AuNSs were observed after 6 h (scale bar = 500 nm), f with uptake in intracellular vesicles (v vesicle, scale bar = 2 μm). g Staining of the nucleus (n ) suggests that makura-shaped Au NSs were excluded from the nucleus. h TEM images taken after 12 h suggest uptake via macropinocytosis (scale bar = 500 nm), with i intravesicular location of makura-shaped AuNSs (vm vesicular membrane, scale bar = 500 nm). j Intracellular compartmentalization was also visible from the microscopy. Uptake of makura-shaped AuNSs continued at 24 h as seen in TEM images k (scale bar = 2 μm) and l (scale bar = 5 μm). m Detachment of glioblastoma-astrocytoma cells from the surface was observed, which most likely is an indication of cell death

The data presented here suggest that size plays a minor role in cytotoxicity in glioblastoma-astrocytoma cells. For instance, the small spherical NSs (15 nm) showed the same uptake/cytotoxicity as the large BPs (650/270 nm). Based on previous studies, we expected the NRs to give the highest cytotoxicity, due to their AR and surface charge. Positively charged NSs are considered to be particularly toxic as they can induce apoptosis [63] and cause the production of reactive oxygen species [64]. However, in the data presented here, the positively charged NRs did not show increased cell death compared to any other shape (Fig. 5a). This might be explained as follows:the surface charge of NS was determined with zeta potential measurements, an approach based on spherical particle assumption (Table 2). Thus, the reported charge of the NRs most likely misrepresents their actual charge. Although the AR of the rods synthesized here is large (2.8), their overall size falls in a size range that shows good uptake in cells (20–50 nm). [30, 65] A previous study has suggested that the size of NS does not only seem to govern endocytosis but also exocytosis. For instance, the removal half-life of 14 nm AuNS was much faster than removal half-life of 74 nm AuNS [26]. Here, the smaller Au rods and spheres, may, therefore, have been removed via exocytosis, which may explain their low cytotoxicity.

The main feature of the NM is not their size, but their irregular structure, and it appears from the image in Fig. 5a that shape has been the determining factor for the high uptake. However, an irregular morphology may have undermined the surface coverage of MUA and as such decreased the solution stability of the NM. Also, we cannot exclude that as two-dimensional cell studies are affected by gravity, a low stability in the cell medium increases the likelihood of sedimentation which can propel the endocytosis.

To get further insight into the uptake mechanism and interactions, we followed uptake of NM at high concentration (2 mg mL ⁻¹ ) with light microscopy and TEM for 24 h. The images show that after 2 h of co-incubation, the NM associate with the cellular membrane (Fig. 5c, d) and are engulfed by the cells (Fig. 5b, e). The mechanism of endocytosis seems to be initially receptor-mediated (Fig. 5b) and at later stages through macropinocytosis (Fig. 5h). The latter is believed to occur when large objects enter a cell, and the aggregation of NSs may have induced macropinocytosis. This might mean that the initial solution stability of the Au NM is sufficient, but that with time they aggregate and are taken up as larger species, most likely due to protein adsorption. Uptake of any extracellular NS in an intracellular vesicle involves wrapping of the cell membrane. If many such wrapping events occur, this alters the global elasticity of the cell membrane, which in turn affects the membrane integrity. If many macropinocytosis events occur, the membrane integrity may be severely impaired. This is believed to be one of the effects for the cytotoxicity observed for the NM.

Once inside the cell, it appears that the Au NM align at the periphery of the vesicles, adhering to the vesicular membrane (Fig. 5i). The endosome seems to be trafficked towards the nucleus (Fig. 5f, g, and l), which is consistent with previous studies that show that Au NSs taken up via receptor-mediated endocytosis may eventually end up in the Golgi apparatus [53, 66]. The uptake appears to continue upto 24 h (Fig. 5k), owing to the high concentration gradient of Au NS in the cell culture media [59].

At 24 h with co-incubation, the morphology of the cells changes (Fig. 5m), going from star-shaped to a more rounded shape with less visible filopodia [67], followed by detachment from the surface. Although this study does not go further in the molecular events following uptake of NS, a detachment of filopodia may suggest that NM can interact with the cytoskeleton and cause detachment and apoptosis.

We extended the cytotoxicity assay beyond 24 h and investigated the result of co-incubation at 48 and 72 h, the reason being that few cell studies are performed at these time points [68, 69], and the main argument being that cellular uptake reaches a plateau at 24 h [70]. Our results show (Additional file 1:Figure S5, ESI†) that beyond 24 h, the cells continued to detach from the flask surface, i.e., cell death and uptake continue beyond 24 h. As we cannot exclude that starvation of the cells would have increased the cytotoxicity and detachment, a cytotoxic response is a dynamic process likely to evolve over time differentially.

Conclusions

In summary, we have synthesized five different shapes of Au NSs using a seed-mediated growth approach (nanorods, nanomakura , tetrahexahedral, bipyramidal) and the Turkevich method (spherical). These NSs have different sizes:the smallest being the NRs and the largest being the BPs, ranging from 22 to 156 nm. Their optical properties measured using UV-vis spectroscopy show LSPR span from UV, visible, to near IR. High values of zeta potential render good stability in aqueous solution. With an aim to exchange the cationic surfactant on the surface, a two-step functionalization protocol was employed to replace the CTAB with PEG thiol and MUA.

After coating, the NSs showed a decrease in surface charge, coupled with an increase in size, proving successful functionalization. In vitro studies were performed for all the synthesized NSs involving co-incubation with glioblastoma-astrocytoma cells for 24 h. The greatest cytotoxic response (~ 20%) was observed with NM at high concentration, which is consistent with higher uptake. An in––depth study with TEM revealed a time-dependent internalization in cancer cells via endocytosis and macropinocytosis. This successful internalization of the Au NM in cancer cells, coupled with their unique physicochemical properties, render them suitable for hyperthermia and drug delivery to cancer cells while being simultaneously imaged.

缩写

AgNO3 :

Silver nitrate

Au:

Gold

BF:

Bright filed

BPs:

Bipyramids

CTAB:

Cetyltrimethylammonium bromide

DDAB:

Didecyldimethylammonium bromide

DLS:

Dynamic light scattering

EMEM:

Eagle’s Minimal Essential Medium

EthD-1:

Ethidium homodimer-1

GBM:

Glioblastoma multiforme

HAuCl4:

Cholorauric aicd

HRTEM:

高分辨透射电子显微镜

IR：

红外线

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

MUA:

11-Mercaptoundecanoic acid

Na-citrate:

Sodium citrate dihydrate

NM:

Nanomakura

NRs:

Nanorods

Ns:

Nanostructure

OA:

Oleic acid

PEG-SH:

O-[2-(3-Mercaptopropionylamino) ethyl]-O-ethylpolyethylene glycol

STEM:

Scanning transmission electron microscopy

TEM：

透射电子显微镜

THH:

Tetrahexahedra

UV-Vis:

Ultraviolet-visible

XPS：

X射线光电子能谱