抗体功能化二氧化硅包覆金纳米棒用于隐球菌快速诊断与光热治疗

摘要

背景

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种有荚膜酵母菌。临床上仍缺乏快速有效的早期诊断或治疗C. neoformans感染的方案。抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒（GNR-SiO₂-Ab）可选择性结合C. neoformans，可能为隐球菌病提供安全有效的治疗可能性。

方法

金纳米棒（GNRs）按种子介导模板辅助方案合成。抗C. neoformans抗体经硅烷偶联剂共价锚定于GNRs表面。体外计算机断层成像（CT）探究GNR-SiO₂-Ab诊断效果。细胞活力评估确认GNR-SiO₂-Ab联合近红外（NIR）激光光热治疗效果。

结果

GNR-SiO₂-Ab作为阳性X射线/CT成像对比剂具有潜在应用。抗体结合C. neoformans细胞表面诱导GNRs更大程度聚集，产生更高衰减值。照射后，C. neoformans细胞遭受光热损伤，正常结构被破坏。细胞活力较未处理细胞显著降低。

结论

本工作证实抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒可增强C. neoformans细胞CT图像X射线衰减。抗体介导的免疫GNRs可增强NIR诱导光热治疗对C. neoformans细胞的效果。

背景

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种有荚膜酵母菌，1894年Busse首次描述[1]。感染可导致气道无害定植，也可引起脑膜炎或播散性疾病[2]，尤其发生在细胞介导免疫缺陷者。隐球菌病是重度HIV感染患者主要致命真菌感染，也可并发器官移植、网状内皮系统恶性肿瘤、皮质类固醇治疗或肉芽肿病[3]。HIV相关隐球菌脑膜炎每年全球致死超60万[4]。隐球菌脑膜炎和播散性疾病历来致死。1995年Speed和Dunt报告两性霉素B联合氟胞嘧啶治疗隐球菌病患者死亡率14%[5]。疑似隐球菌病患者诊断依赖真菌培养。然而临床上仍缺乏早期快速有效的C. neoformans感染诊断或治疗方案。此外，多数隐球菌感染患者未获及时治疗，导致高死亡率。

在所有成像技术中，X射线计算机断层扫描（CT）因可用性、效率和成本是医院最有用诊断工具之一[6]。CT能识别解剖模式，提供包括肿瘤位置、大小、扩散的互补解剖信息[7]。肺隐球菌病常见表现为孤立或多发肺结节/肿块、空洞、实质异常，CT成像可清晰检测[8]。放射成像典型呈现隐球菌脑膜炎特征：扩张Virchow-Robin间隙、脑膜强化、显著脉络膜裂、海马旁囊肿[9]。但早期隐球菌病无法用放射成像检测，即无法早期及时治疗。近年控制金纳米材料表面形状/形貌的进展展现出调控其局域表面等离子共振的巨大能力[10, 11]。本文研究一种纳米金材料——金纳米棒（GNRs），可选择性结合真菌。临床CT成像中碘化化合物是最常用对比剂。但金的原子序数和电子密度远高于碘。金能诱导强X射线衰减，成为理想CT对比剂候选[7]。将GNRs与特异性抗体偶联，科学家有望靶向捕获特定组织和病原体图像[12]。

两性霉素B是隐球菌病主要治疗药物，自1960年代末部署[13]。但其临床疗效有限，且表现显著肾毒性[14]。现有药物疗效受毒性、耐药性、活性范围不足影响[15, 16]。故需设计新型选择性隐球菌病治疗法。近年光热治疗广泛用于靶向破坏癌细胞、病毒、细菌[17–19]。此类治疗剂机制与传统方案完全不同。近红外（NIR）激光是理想光热治疗方法，可被特定组织或材料特异性吸收。光有效穿透组织且对正常组织损伤最小[20]。GNRs吸收NIR区（650–900 nm）光，吸收光能转化为热能。基于此原理，结合NIR激光与GNRs治疗是理想方法。相比经典光敏剂，GNRs有诸多优势：高吸收截面、高溶解性、优异生物相容性、低毒性、良好光稳定性、易与靶标分子偶联[21]。多项报道描述GNRs用于光热治疗[22–24]。Carpin在过表达HER2基因乳腺癌细胞实验中，孵育抗HER2偶联二氧化硅-金纳米壳，随后808 nm NIR辐照，对照组细胞被破坏[17]。Wang报道抗体偶联GNRs经NIR辐照可选择靶向破坏致病Salmonella，细胞活力显著降低[19]。

本文利用抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒特异性结合C. neoformans细胞。结合复合物细胞在CT图像易区分。这些金纳米颗粒经免疫偶联与C. neoformans细胞结合，光热裂解显著降低细胞活力。研究确认C. neoformans体外诊断和光热治疗新选项，为隐球菌病安全有效治疗提供可能性。

方法

材料

抗C. neoformans抗体购自Meridian Life Science（美国孟菲斯）。氯金酸（HAuCl₄·3H₂O）购自Sigma（美国圣路易斯）。硝酸银（AgNO₃）、四乙基正硅酸酯（TEOS）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、硼氢化钠（NaBH₄）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）、聚(苯乙烯磺酸钠)（PSS）、抗坏血酸购自J&K Chemical Limited（中国）。上述化学品无需进一步纯化直接使用。全程用去离子水（Millipore Milli-Q级，电阻率18.2 MΩ·cm）。

抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒合成

典型实验中，GNRs按种子介导模板辅助方案合成[25–27]。抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒（GNR-SiO₂-Ab）合成路径见图1。25 mL GNR溶液12000 rpm离心15 min。上清液（含大部分CTAB）移除，沉淀重悬于20 mL无水乙醇，20 μL 28%氨水调pH至10。超声后加入5 mL TEOS (10 mM)，剧烈搅拌24 h。4000 rpm离心30 min收集二氧化硅包覆GNRs，水洗三次、乙醇洗两次。纯化GNR-SiO₂样品重分散于10 mL乙醇备用[28]。随后加入10 mL APTS形成混合液，60°C回流反应1 h。所得产物去离子水洗五次，真空烘箱60°C干燥3 h得GNR-SiO₂-NH₂。再经层层技术用聚合物（PSS）进一步包覆，提供溶剂可及氨基[29]。这些氨基末端纳米棒与纯化抗体羧基在EDC存在下反应12–16 h，EDC为水溶性碳二亚胺促进羧基与伯氨基酰胺键形成[30]。孵育后，纳米棒-抗体复合物离心纯化并重悬于PBS[31]。

图1. GNR-SiO₂-Ab合成程序示意图。

GNR-SiO₂-Ab表征

用透射电镜（TEM；Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA）表征GNR和GNR-SiO₂-Ab尺寸形貌，加速电压120 kV[20]。UV-vis光谱在20°C用UV-visible分光光度计（Shimadzu UV-2450, 日本）配10 mm石英比色皿，光程1 cm，扫描200–1000 nm波长（含GNRs、抗C. neoformans抗体、GNR-SiO₂-Ab吸收峰）。GNR-SiO₂-Ab在4°C孵育2周和4周，两时间点扫描200–1000 nm波长。

GNR-SiO₂-Ab豪斯菲尔德单位测量

0.04–4 mg/mL不同浓度GNR-SiO₂-Ab水溶液直接用Philips Brilliance 64 CT扫描仪（Philips Healthcare, 荷兰）检测。从CT成像软件获取衰减值。

C. neoformans与GNR-SiO₂-Ab结合

C. neoformans A型H99株自上海分子医学真菌重点实验室（上海长征医院，第二军医大学）获取。真菌与GNRs及抗体-纳米棒复合物孵育1 h后制备TEM分析。TEM仪器（Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA）加速电压120 kV收集图像。

真菌-抗体-纳米棒复合物体外CT扫描

材料和真菌分三组：真菌组(N)、GPR-SiO₂-Ab组(G)、GPR-SiO₂-Ab结合C. neoformans组(G+N)。GNR-SiO₂-Ab水溶液浓度4 mg/mL。体外CT成像用1.5 mL无菌EP管制备三组溶液。所有CT扫描用上述CT系统。

体外光热治疗效果

孵育有无GNR-SiO₂-Ab的C. neoformans细胞经NIR激光（LWIRL 808, Laserwave Ltd., 中国）辐照5 min，波长808 nm，强度30 mW (4 W/cm²)。TEM仪器（Tecnai G2 spirit Biotwin, FEI, USA）120 kV收集图像。辐照后细胞37°C黑暗孵育2 h。有无GNR-SiO₂-Ab孵育C. neoformans细胞设为对照组。按说明书用CellTiter-Glo®发光细胞活力测定（Promega Corporation, 美国威斯康星）测定细胞活力[28]。该均相法可测定活细胞数。荧光素酶催化荧光素与ATP反应合成代谢活性细胞指标。所有实验重复6次取均值。

统计分析

所有分析用SPSS 13.0（SPSS Inc., 美国芝加哥）进行。数据表达为均值±SD。P<0.05为统计学显著。文中所有图来自3次以上重复实验并得相似结果。

结果

GNR-SiO₂-Ab合成与表征

以TEOS为硅源、APTS为偶联剂的二氧化硅包覆GNRs方法已有报道[30]。GNRs偶联抗C. neoformans抗体时形状尺寸不变。图2显示GNR-SiO₂-Ab TEM图像。纳米颗粒宽度18.48±2.39 nm，长度57.56±4.57 nm。

图2. (a)、(b) GNR-SiO₂-Ab TEM图像。纳米棒呈棒状外观。偶联抗C. neoformans抗体时GPRs形状尺寸不变。

GNR-SiO₂-Ab光谱性质与稳定性

关于GNR-SiO₂-Ab光物理性质，图3显示GNR-SiO₂、GNR-SiO₂-Ab、抗C. neoformans抗体吸收光谱。GNR-SiO₂谱显示两吸收带：弱横向表面等离子共振波长(TSPRW)约520 nm，强纵向表面等离子共振波长(LSPRW)约808 nm。偶联抗体后，GNR-SiO₂-Ab TSPRW和LSPRW分别为540和835 nm。对比抗体与GNR-SiO₂-Ab光谱，两者均有280 nm左右特征峰，证明抗C. neoformans抗体成功偶联GNR-SiO₂。4°C孵育2周后GNR-SiO₂-Ab TSPRW和LSPRW仍为540和835 nm，4周相同数据。GNR-SiO₂-Ab TSPRW和LSPRW 4周未变，确认稳定性。

图3. 吸收光谱：GNR+SiO₂+Ab (A)、GNR+SiO₂ (B)、抗C. neoformans抗体 (C)。GNR-SiO₂有两吸收带：弱TSPRW约520 nm，强LSPRW约808 nm。偶联抗体后GNR-SiO₂-Ab TSPRW和LSPRW分别为540和835 nm。

GNR-SiO₂-Ab豪斯菲尔德单位测量

临床CT评估GNR-SiO₂-Ab豪斯菲尔德单位(Hu)。图4显示0.04–4 mg/mL GNR-SiO₂-Ab CT图像。随浓度增加，CT信号强度持续增强。图3显示Hu随GNR-SiO₂-Ab浓度呈良好线性相关（R²=0.9903），典型方程：y=12.52x+11.971。结果提示GNR-SiO₂-Ab作为阳性X射线/CT成像对比剂具有潜在应用。

图4. GNR-SiO₂-Ab豪斯菲尔德单位。(a) 悬浮PBS中GNR-SiO₂-Ab体外CT图像，各样品浓度(mg/mL)标于图顶。(b) 0.04–4 mg/mL范围内GNR-SiO₂-Ab CT衰减图。

C. neoformans细胞与GNR-SiO₂-Ab结合

TEM图像显示C. neoformans细胞与真菌-抗体-纳米棒复合物形貌特征。细胞直径2–20 μm。图5a显示C. neoformans细胞TEM图，被多糖荚膜包裹。未结合结构时直径4–6 μm。图5b显示孵育抗体-纳米棒复合物后，C. neoformans细胞被大量聚集GNR-SiO₂-Ab覆盖。我们孵育真菌细胞与GNR-SiO₂探究GNR-SiO₂是否结合C. neoformans。结果显示GNR-SiO₂分散分布（图5c）。研究表明C. neoformans细胞可选择性结合GNR-SiO₂-Ab。

图5. TEM图像展示GNR-SiO₂-Ab与C. neoformans细胞相互作用。(a) C. neoformans细胞。(b) 真菌-抗体-纳米棒复合物。(c) 孵育GNR-SiO₂的C. neoformans细胞。

真菌-抗体-纳米棒复合物体外CT扫描

用制造商标准显示程序（Philips portal, Philips Healthcare, 荷兰）定量分析CT信号强度。图6描绘三组X射线衰减值。G+N组值显著高于G和N组。此外，G组值显著高于N组。结果与前人文献一致[31]。

图6. (a)、(b) 不同组体外CT扫描。G+N组值显著高于G和N组。此外，G组值显著高于N组。

体外光热治疗效果

用CellTiter-Glo®发光仪器细胞活力测定评估细胞活力。未辐照细胞活力大于NIR辐照细胞(P<0.05)。此外，NIR辐照后结合GNR-SiO₂-Ab真菌活力低于未结合真菌(P<0.05)。而且，未结合细胞活力高于真菌-抗体-纳米棒复合物(P<0.05)。图7清晰展示不同处理下C. neoformans细胞活力变化。辐照后，C. neoformans细胞遭受光热损伤，正常结构被破坏。图8显示细胞呈萎缩、不规则、塌陷外观，特征性多糖荚膜受损。

图7. 不同处理细胞活力。未辐照细胞活力大于NIR辐照细胞(P<0.05)。此外，NIR辐照后结合GNR-SiO₂-Ab真菌活力低于未结合真菌(P<0.05)。而且，未结合细胞活力高于真菌-抗体-纳米棒复合物(P<0.05)。

图8. (a)、(b) TEM图像展示结合GNR-SiO₂-Ab的C. neoformans细胞光热损伤。细胞呈萎缩、不规则、塌陷外观。特征性多糖荚膜受损。

讨论

二氧化硅相较聚合物有诸多优势[32]。制备工艺简易，二氧化硅壳厚度可调控至所需尺寸和孔隙率。此外，二氧化硅极稳定且生物相容，pH变化无膨胀或孔隙率变化，不易受微生物攻击。另外，利用硅烷化学和商业有机硅试剂易于用多种官能团进行表面修饰以实现生物靶向。二氧化硅包覆GNRs保留GNRs优异光学性质，改善高能辐照下热稳定性。本研究中，包覆二氧化硅并偶联抗C. neoformans抗体后，GNRs表面等离子共振峰红移，因周围介质折射率增加[32, 33]。结果也显示样品尺寸随修饰偶联逐渐增大。这些数据表明成功将金纳米颗粒与抗C. neoformans抗体偶联。但不能排除GNR-SiO₂结合抗体后具有特殊结合细胞能力，未来将进一步研究。本研究通过简单抗原-抗体反应成功将GNR-SiO₂-Ab结合细胞荚膜。此外，成功确保复合物靶向细胞荚膜抗原。

GNRs近十年获广泛关注。Hainfeld等[34]首报GNRs可作X射线对比剂。GNRs相较有条件对比剂碘化分子有诸多优势。因高原子序数和电子密度，GNRs表现相对高X射线衰减系数。金原子序数和电子密度(79和19.32 g/cm³)高于碘(53和4.9 g/cm³)[7]。碘作X射线对比剂有严重副作用，如肾毒性、严重过敏反应。但GNRs在体内持留时间远超碘对比剂，留足观察时间。且GNRs可通过肽或抗体等多种分子表面功能化靶向癌细胞、病毒、细菌。Reuveni等[31]显示多种分子类型可连接GNRs表面。本研究中，CT信号强度随GNR-SiO₂-Ab浓度增加持续增强，图像更亮。GNR-SiO₂-Ab作为X射线/CT成像对比剂展现显著阳性潜力，GNRs亦然。金纳米棒X射线吸收未受表面修饰影响。数据表明GNR-SiO₂-Ab X射线衰减性质未因表面修饰显著改变。这与前人文献一致[35–37]。表面功能化是强大工具，使GNRs被动或主动靶向特定目标部位。本研究成功将GNR-SiO₂-Ab结合C. neoformans荚膜。此外，确定抗体偶联颗粒能否作为纳米探针进行C. neoformans细胞靶向CT成像。观察到分散PBS中C. neoformans细胞CT图像与分散水中相似。但难以将真菌图像与软组织区分。抗体结合C. neoformans细胞表面诱导GNRs更大程度聚集，产生前所未有的高衰减值。从而成功实现真菌可区分X射线衰减。基于结果，CT成像检测C. neoformans可行，为诊断带来新机遇。

GNRs广泛用于肿瘤光热治疗[22, 38, 39]。本研究指示GNR-SiO₂-Ab可作为选择性破坏C. neoformans细胞工具。结果证实C. neoformans细胞膜经NIR辐照遭受不可逆严重破坏。此外，细胞活力较未处理细胞显著降低。结果表明单独NIR辐射致C. neoformans细胞死亡。但孵育GNR-SiO₂-Ab细胞活力也受抑制。孵育GNR-SiO₂-Ab并经NIR辐照细胞活力较其他组显著降低。我们确信GNR-SiO₂-Ab选择性结合真菌并改善NIR辐射效果。GNR-SiO₂-Ab具有C. neoformans细胞选择性光热治疗能力。作用机制未曾报道。我们推测细胞膜破坏可能由辐照诱导细胞死亡引起。Norman等[18]报告铜绿假单胞菌经辐照并结合共价偶联特异性抗体金纳米棒后活力显著降低。这些细胞亦显示严重破坏细胞膜区域，由NIR辐照引起不可逆损伤。纳米颗粒经NIR辐射，细胞膜因纳米颗粒爆炸、冲击波、气泡形成、热解解等因素受损[40]。

本研究中，C. neoformans细胞死亡或活性降低源于细胞膜被热能解体破坏。但需进一步研究证实此假设。C. neoformans细胞受以下因素损伤：局部温度升高、纳米颗粒爆炸、冲击波、气泡形成、NIR辐射热解解。特别是C. neoformans细胞单独暴露NIR辐射即受显著损伤。有两种可能解释靶向GNR-SiO₂-Ab如何激发NIR辐射诱导C. neoformans细胞光热破坏：一是C. neoformans荚膜中靶向GNR-SiO₂-Ab诱导局部温度升高；二是GNR-SiO₂-Ab与C. neoformans荚膜抗原-抗体反应导致细胞壁荚膜结构变化，使细胞对光热治疗更敏感[41]。前人研究确认金纳米棒低毒性[22, 42, 43]，需进一步研究光热治疗体内效果。本研究最大遗憾未讨论GNR-SiO₂-Ab载药量。未来研究将集中于GNR-SiO₂-Ab载药量与光热效应关系。

结论

我们成功制备靶向C. neoformans细胞的GNR-SiO₂-Ab。这些特异性抗体偶联金纳米棒增强了C. neoformans细胞CT图像X射线衰减。结果表明抗体介导的免疫GNRs增强NIR诱导光热治疗对C. neoformans细胞效果。此外，GNR-SiO₂-Ab使C. neoformans感染诊断和治疗易于操作且微创，聚焦此方法潜在临床应用。