用于新型隐球菌诊断和光热治疗的抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒：体外实验

背景

新型隐球菌 是一种封装酵母，1894 年由 Busse 首次描述 [1]。被包裹的酵母新型隐球菌感染 可导致气道无害定植，但也可导致脑膜炎或播散性疾病 [2]，尤其是在细胞介导免疫缺陷的人群中。隐球菌病是严重 HIV 感染患者的一种严重威胁生命的真菌感染，也可能使器官移植、网状内皮恶性肿瘤、皮质类固醇治疗或结节病复杂化 [3]。与 HIV 感染相关的隐球菌性脑膜炎每年导致全球超过 600,000 人死亡 [4]。隐球菌脑膜炎和播散性疾病总是致命的。 1995 年，Speed 和 Dunt 报告了接受两性霉素 B 加氟胞嘧啶治疗的隐球菌病患者的死亡率为 14% [5]。疑似隐球菌病患者的检查取决于真菌培养。然而，对于C的诊断或治疗，仍然缺乏快速有效的解决方案。隐球菌 在早期感染。此外，大多数隐球菌感染患者未能得到及时治疗，导致死亡率很高。

在所有成像技术中，就可用性、效率和成本而言，X 射线计算机断层扫描 (CT) 是医院中最有用的诊断工具之一 [6]。 CT 能够识别解剖模式并提供互补的解剖信息，包括肿瘤位置、大小和内源性造影剂的扩散 [7]。肺隐球菌病的一种常见表现是存在单发或多发肺结节或肿块、空洞或实质异常。这些表现可以通过计算机断层扫描 (CT) 成像清楚地检测到 [8]。使用放射成像，隐球菌性脑膜炎的以下特征 通常表现为：扩张的 Virchow-Robin 间隙、脑膜增强、显着的脉络膜裂和海马旁囊肿 [9]。然而，早期的隐球菌病不能通过放射成像检测到。也就是说，我们不能在早期进行及时治疗。最近，在控制金纳米材料的表面形状/形态方面取得的进展已经证明了设计其局部表面等离子体共振的强大能力 [10, 11]。在此，我们研究了一种称为金纳米棒 (GNR) 的纳米级金材料，它可以选择性地与真菌结合。在临床 CT 成像中，碘化化合物是最常用的造影剂。然而，金的原子序数和电子密度远高于碘。金可以引起强烈的 X 射线衰减，这使其成为 CT 造影剂的理想候选者 [7]。通过将 GNR 与特定抗体结合，科学家们有可能从特定组织和病原体中靶向并捕获图像 [12]。

两性霉素 B 是治疗隐球菌病的主要治疗剂，自 1960 年代后期开始使用 [13]。然而，两性霉素 B 的临床疗效有限，并且表现出显着的肾毒性 [14]。目前药物的疗效受到毒性、耐药性或活性范围不足的影响 [15, 16]。因此，需要设计新的隐球菌病选择性治疗方法。最近，光热疗法被广泛用于靶向和破坏癌细胞、病毒和细菌 [17,18,19]。与传统治疗方案相比，此类治疗剂的作用机制完全不同。近红外 (NIR) 激光是一种理想的光热治疗方法，可被组织或材料特异性吸收。光可以有效地穿透组织，同时对正常组织的损伤最小[20]。 GNR 在 NIR 区域（650-900 nm）吸收光，吸收的光能可以转化为热能。基于此原理，将NIR激光与GNRs结合进行治疗是一种理想的方法。与经典光敏剂相比，GNRs 具有几个优点：高吸收截面、高溶解度、优异的生物相容性、低毒性、良好的光稳定性和易于与目标分子结合[21]。一些报告描述了 GNR 如何用于光热处理 [22,23,24]。 Carpin 在乳腺癌细胞中进行了一项实验，该细胞过度表达了 HER2 基因，并与抗 HER2 偶联的二氧化硅-金纳米​​壳一起孵育。随后，复合物被 808-nm NIR 辐射照射。与对照组相比，细胞被破坏[17]。 Wang 报道抗体偶联的 GNR 可以选择靶标并破坏致病性沙门氏菌 暴露在近红外辐射下的细菌。 沙门氏菌显着减少 细胞活力[19]。

在此，我们使用抗体偶联的二氧化硅修饰的金纳米棒来特异性结合 C。隐球菌 细胞。此外，与复合物结合的细胞可以在 CT 图像中轻松区分。这些金纳米粒子与C相关联。隐球菌 细胞通过免疫结合和光热裂解导致细胞活力显着降低。我们的研究证实了C. 诊断和光热疗法的全新选择。隐球菌 为安全有效治疗隐球菌病提供了可能。

方法

材料

反C。隐球菌 抗体购自 Meridian Life Science (Memphis, TN, USA)。氯金酸 (HAuCl4·3H2O) 购自 Sigma (St. Louis, MO, USA)。硝酸银 (AgNO3)、原硅酸四乙酯 (TEOS)、3-氨基丙基三甲氧基硅烷 (APTS)、十六烷基三甲基溴化铵 (CTAB)、硼氢化钠 (NaBH4)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺 (EDC)、聚（4-苯乙烯磺酸钠）（PSS）和抗坏血酸购自 J &K Chemical Limited（中国）。所有上述化学品均未经任何进一步纯化而使用。所有制剂均使用电阻率为 18.2 MΩ cm 的去离子水（Millipore Milli-Q 级）。

抗体偶联二氧化硅修饰金纳米棒的合成

在一个典型的实验中，GNRs 是根据种子介导的模板辅助协议合成的 [25,26,27]。制备抗体偶联的二氧化硅修饰的金纳米棒 (GNR-SiO2-Ab) 的合成途径如图 1 所示。将 25 毫升 GNR 溶液以 12000 rpm 的速度离心 15 分钟。去除主要含有 CTAB 分子的上清液，并将沉淀物重新悬浮在 20 mL 无水乙醇中，用 20 μL 28% 氨水将 pH 值调至 10。系统经超声处理后，加入 5 mL (10 mM) TEOS，然后将整个系统剧烈搅拌 24 小时。通过以 4000 rpm 离心 30 分钟收集二氧化硅包覆的 GNR，并用水洗涤 3 次，乙醇洗涤 2 次。将获得的纯化 GNR-SiO2 样品重新分散到 10 mL 乙醇中以进行进一步实验 [28]。随后，加入 10 mL APTS 形成混合溶液，并使其在 60°C 下回流反应 1 小时。将所得物用去离子水洗涤五次并在真空烘箱中在60°C下干燥3小时以获得GNR-SiO2-NH2。通过逐层技术为溶剂提供可接近的胺基团，用聚合物 (PSS) 进一步涂覆所得物 [29]。在 EDC（一种促进羧酸和伯胺之间形成酰胺键的水溶性碳二亚胺）存在下，允许这些胺封端的纳米棒与纯化抗体的羧酸反应 12-16 小时 [30]。孵育后，纳米棒-抗体复合物通过离心纯化并重悬于PBS中[31]。

GNR-SiO2-Ab的合成工艺

GNR-SiO2-Ab 的表征

GNR 和 GNR-SiO2-Ab 的尺寸和形态使用透射电子显微镜（TEM；Tecnai G2 spirit Biotwin，FEI，USA）在 120 kV 的加速电压下工作 [20] 进行表征。紫外-可见光谱是在 20°C 下用紫外-可见分光光度计（Shimadzu UV-2450，Shimadzu，Japan）测量的，该分光光度计配备 10 毫米石英池，其中光路长度为 1 厘米。扫描了 200 到 1000 纳米的波长，因为它包括 GNR、抗 C 的吸收峰。隐球菌 抗体和 GNR-SiO2-Ab。 GNR-SiO2-Ab 在 4°C 下孵育 2 和 4 周。在两个时间点扫描200-1000-nm波长。

GNR-SiO2-Ab 测量的亨斯菲尔德单位

使用飞利浦 Brilliance 64 CT 扫描仪（Philips Healthcare，Best，荷兰）直接检测 0.04–4 mg/mL 范围内不同浓度的 GNR-SiO2-Ab 水溶液。衰减值来自CT成像软件。

C 的附件。隐球菌 GNR-SiO2-Ab

新型隐球菌 A型H99菌株获自上海市分子医学真菌学重点实验室（第二军医大学上海长征医院，中国上海）。在准备进行 TEM 分析之前，让真菌与 GNR 和抗体-纳米棒复合物一起孵育 1 小时。在加速电压为 120 kV 的 TEM 仪器（Tecnai G2 spirit Biotwin，FEI，USA）上收集图像。

真菌-抗体-纳米棒复合物的体外 CT 扫描

材料和真菌分为三组，包括真菌组(N)、GPR-SiO2-Ab组(G)和GPR-SiO2-Ab-附着的C。隐球菌 组 (G+N)。上述 GNR-SiO2-Ab 水溶液的浓度为 4mg/mL。对于体外 CT 成像，三组溶液均在 1.5 mL 无菌 Ep 管中制备。所有CT扫描均使用上述CT系统进行。

体外光热疗法效果

C.隐球菌 用和不用 GNR-SiO2-Ab 孵育的细胞暴露于 NIR 激光（LWIRL 808，Laserwave Ltd.，中国）照射 5 分钟，波长为 808 nm，强度为 30 mW（4 W/cm ² ）。在加速电压为 120 kV 的 TEM 仪器（Tecnai G2 spirit Biotwin，FEI，USA）上收集图像。照射后，将细胞在 37°C 下避光孵育 2 小时。 C.隐球菌 设计有和没有 GNR-SiO2-Ab 孵育的细胞作为对照组。根据制造商的说明，通过执行 CellTiter-Glo® 发光细胞活力测定（Promega Corporation，Madison，WI，USA）来确定细胞活力 [28]。这种特殊的细胞活力测定是一种均相方法，可以确定活细胞的数量。荧光素酶催化的荧光素和 ATP 反应用于合成代谢活性细胞。所有实验重复6次，取平均值。

统计分析

所有分析均使用 SPSS 13.0 版（SPSS, Inc., Chicago, IL, USA）进行。数据表示为平均值 ± SD。 P 取小于 0.05 的值表示有统计学意义。本文中显示的所有数据均来自三个以上具有相似结果的独立实验。

结果

GNR-SiO2-Ab 的合成与表征

先前已经报道了一种使用 TEOS 作为二氧化硅源和 APTS 作为偶联剂的二氧化硅涂层 GNR 的方法 [30]。当 GPR 与抗 C 缀合时，它们的形状或大小没有改变。隐球菌 .图 2 显示了 GNR-SiO2-Ab 的 TEM 图像。这些纳米粒子的宽度为 18.48 ± 2.39 nm，长度为 57.56 ± 4.57 nm。

一 , b GNR-SiO2-Ab 的 TEM 图像。纳米棒呈现棒状外观。当 GPR 与抗 C 缀合时，它们的形状或大小没有改变。隐球菌

GNR-SiO2-Ab 的光谱性质和稳定性

关于 GNR-SiO2-Ab 的光物理性质，图 3 显示了 GNR-SiO2、GNR-SiO2-Ab 和 anti-C 的吸收光谱。隐球菌 抗体。 GNR-SiO2 的光谱显示 GNR-SiO2 有两个吸收带，一个弱的横向表面等离子体共振波长 (TSPRW) 在 520 nm 附近，一个强的纵向表面等离子体共振波长 (LSPRW) 在 808 nm 附近。与抗体偶联后，GNR-SiO2-Ab 的 TSPRW 和 LSPRW 分别为 540 和 835 nm。比较抗体和 GNR-SiO2-Ab 的光谱，两者在 280 nm 附近具有相同的特殊峰。该结果证明抗C.隐球菌 抗体与 GNR-SiO2 成功偶联。在 4°C 下孵育 2 周后，GNR-SiO2-Ab 的 TSPRW 和 LSPRW 分别为 540 和 835 nm。在第 4 周观察到相同的数据。 GNR-SiO2-Ab 的 TSPRW 和 LSPRW 在孵育 4 周后没有变化。证实了GNR-SiO2-Ab的稳定性。

吸收光谱：GNR+SiO2+Ab(A)、GNR+SiO2(B)和抗-C。隐球菌 抗体（C）。 GNR-SiO2 有两个吸收带，在 520 nm 附近的弱横向表面等离子体共振波长 (TSPRW) 和在 808 nm 附近的强纵向表面等离子体共振波长 (LSPRW)。与抗体偶联后，GNR-SiO2-Ab的TSPRW和LSPRW分别为540和835 nm

GNR-SiO2-Ab 测量的亨斯菲尔德单位

临床 CT 评估的 GNR-SiO2-Ab 的 Hounsfield 单位 (Hu)。图 4 显示了 0.04–4 mg/mL GNR-SiO2-Ab 范围内的 CT 图像。随着 GNR-SiO2-Ab 浓度的增加，CT 信号强度不断增加。如图 3 所示，作为 GNR-SiO2-Ab 浓度函数的 Hu 显示出良好相关的线性关系 (R ² =0.9903)，由以下典型方程描述：y =12.52x + 11.971。这些结果表明GNR-SiO2-Ab具有作为X射线/CT正成像造影剂的潜在应用。

GNR-SiO2-Ab 的 Hounsfield 单位。 一 悬浮在 PBS 中的 GNR-SiO2-Ab 的体外 CT 图像。每个样品中的浓度 (mg/mL) 提供在相应图像的顶部。 b GNR-SiO2-Ab 在 0.04 至 4 mg/mL 范围内不同浓度的 CT 衰减图

C 的附件。隐球菌 细胞到 GNR-SiO2-Ab

TEM 图像显示了 C 的形态特征。隐球菌 细胞和真菌-抗体-纳米棒复合物。这些细胞的直径范围为 2 到 20 微米。图 5a 显示了 C 的 TEM 图像。隐球菌 细胞被多糖胶囊包围。这些细胞的直径为 4-6 μm，没有结合任何结构。如图 5b 所示，C.隐球菌 与抗体-纳米棒复合物孵育后，细胞被大量聚集的 GNR-SiO2-Ab 覆盖。我们将真菌细胞与 GNR-SiO2 一起温育，以探索 GNR-SiO2 是否附着在 C 上。新隐球菌。 我们的结果表明 GNR-SiO2 是分散的，如图 5c 所示。我们的研究表明，C.隐球菌 细胞可以选择性地与GNR-SiO2-Ab结合。

TEM 图像说明了 GNR-SiO2-Ab 和 C 之间的相互作用。隐球菌 细胞。 一 C 的 TEM 图像。隐球菌 细胞。 b 真菌-抗体-纳米棒复合物的 TEM 图像。 c C 的 TEM 图像。隐球菌 GNR-SiO2培养细胞

真菌-抗体-纳米棒复合物的体外 CT 扫描

我们通过制造商的标准显示程序（飞利浦门户，飞利浦医疗保健，荷兰最佳）对 CT 信号强度进行了定量分析。图 6 描绘了三组的 X 射线衰减值。 G+N组的值显着高于G和N组。此外，G组的X射线衰减值明显高于N组。该结果与以往文献[31]的研究结果一致。

一 , b 不同组的体外CT扫描。 G+N组的值显着高于G和N组。此外，G组的X线衰减值明显高于N组

光热疗法的体外效果

我们通过在 CellTiter-Glo®luminescent 仪器中进行细胞活力测定来评估细胞活力。未照射的细胞比 NIR 照射的细胞具有更高的活力 (P <0.05)。此外，在 NIR 照射后，真菌的活力高于与 GNR-SiO2-Ab 结合的细胞（P <0.05)。此外，细胞比真菌-抗体-纳米棒复合物具有更高的活力（P <0.05)。图 7 清楚地说明了 C 生存力的变化。隐球菌 不同处理的细胞。辐照后，C.隐球菌 细胞遭受光热损伤，细胞的正常结构被破坏。如图 8 所示，细胞呈现萎缩、不规则和塌陷的外观。特征性多糖荚膜受损。

不同处理的细胞的活力。未照射的细胞比 NIR 照射的细胞具有更高的活力 (P <0.05)。此外，在 NIR 照射后，真菌的活力高于与 GNR-SiO2-Ab 结合的细胞（P <0.05)。此外，细胞比真菌-抗体-纳米棒复合物具有更高的活力（P <0.05)

一 , b TEM 图像显示了 C 的光热损伤。隐球菌 与 GNR-SiO2-Ab 结合的细胞。细胞呈现萎缩、不规则和塌陷的外观。特征性多糖荚膜受损

讨论

二氧化硅与聚合物相比有很多优点[32]。所涉及的制备过程非常容易，二氧化硅壳的厚度可以变成所需的尺寸和孔隙率。此外，二氧化硅极其稳定且具有生物相容性，不会随 pH 值变化而发生膨胀或孔隙率变化，并且不易受到微生物的攻击。此外，使用硅烷化学和市售有机硅试剂进行生物靶向，二氧化硅易于使用各种官能团进行表面改性。二氧化硅涂层的 GNRs 保留了 GNRs 的优越光学性能，并可以提高其在高能照射下的热稳定性。在我们的研究中，在被二氧化硅包覆并与抗-C结合后。隐球菌 由于周围介质的折射率增加，GNR 在表面等离子共振峰中均表现出红移 [32, 33]。结果还表明，经过修饰和缀合后，样本的大小变得越来越大。这些数据表明我们成功地将金纳米颗粒与抗-C结合。隐球菌 抗体。但是，我们不能排除 GNR-SiO2 伤口在与抗体结合后具有某种特殊的偶联细胞能力的可能性，我们将在未来进行进一步的研究。在这项研究中，我们通过简单的抗原抗体反应成功地将 GNR-SiO2-Ab 附着到细胞囊上。此外，我们成功地确保我们的复合物靶向细胞囊上的抗原。

GNR 在过去十年中得到了广泛关注。海恩菲尔德等人。 [34] 首次报道 GNR 可用作 X 射线造影剂。与碘化分子（一种条件造影剂）相比，GNR 具有多种优势。由于高原子序数和电子密度，GNR 表现出相对较高的 X 射线衰减系数。金的原子序数和电子密度（79 和 19.32 g/cm ³ ，分别）高于碘（53 和 4.9 g/cm ³ ) [7]。碘作为X射线造影剂有很多严重的副作用，如肾毒性和严重的过敏反应。然而，GNR 在体内的持续时间比碘造影剂长得多，这意味着有足够的时间来观察图像。此外，GNR 可以通过各种分子（例如肽或抗体）的表面功能化来靶向癌细胞、病毒和细菌。鲁维尼等人。 [31] 已经表明几种不同类型的分子可以连接到 GNR 的表面。在这项研究中，CT 信号强度不断增加，同时 GNR-SiO2-Ab 浓度增加，导致图像更亮。 GNR-SiO2-Ab 作为 X 射线/CT 成像造影剂以及 GNR 表现出显着的正潜力。即使进行了表面改性，金纳米棒的 X 射线吸收也不受影响。这些数据表明，由于表面改性，GNR-SiO2-Ab 的 X 射线衰减特性没有显着变化。这与先前文献 [35,36,37] 中报道的结果一致。表面功能化是一种强大的工具，可以将 GNR 被动或主动靶向特定的感兴趣位点。在我们的研究中，我们成功地将 GNR-SiO2-Ab 连接到 C 的胶囊上。隐球菌 .此外，我们还确定了这些抗体偶联颗粒是否可以用作纳米探针，同时进行 C 的靶向 CT 成像。隐球菌 体外细胞。我们观察到 C 的 CT 图像。隐球菌 分散在 PBS 中的细胞看起来与来自 C 的图像非常相似。隐球菌 细胞分散在水中。然而，很难区分真菌和软组织的图像。抗体可以通过与 C 表面结合来诱导更大的 GNR 聚集。隐球菌 导致比以往更高的衰减值。因此，我们可以成功地实现真菌的可区分 X 射线衰减。根据我们的结果，C 的检测。隐球菌 CT成像可以实现，并为诊断带来新的机遇。

GNR 已被广泛用于肿瘤光热治疗 [22, 38, 39]。我们的研究表明 GNR-SiO2-Ab 可能是破坏 C 的选择性工具。隐球菌 细胞。我们的结果证实 C 的细胞膜。隐球菌 细胞在受到近红外辐射后遭受不可修复的严重破坏。此外，与未处理的细胞相比，细胞的活力显着降低。这些结果表明仅 NIR 辐射会导致 C 死亡。隐球菌 细胞。然而，与 GNR-SiO2-Ab 孵育的细胞的活力也受到抑制。在与 GNR-SiO2-Ab 孵育并进行 NIR 照射的细胞中，与其他组相比，细胞的活力显着降低。我们确保 GNR-SiO2-Ab 选择性地与真菌结合并改善了 NIR 辐射的效果。 GNR-SiO2-Ab 具有对 C 的选择性光热治疗效果的能力。隐球菌 细胞。其作用机制此前未见报道。我们推测细胞膜的破坏可能是由辐射诱导的细胞死亡引起的。诺曼等人。 [18] 报道了铜绿假单胞菌的生存能力 当该物种暴露于辐射并与金纳米棒结合时，其显着降低，金纳米棒与特定抗体共价结合。这些细胞还显示出严重破坏的细胞膜区域，具有不可修复的损伤，这是由于暴露于近红外辐射引起的。当纳米粒子暴露在近红外辐射下时，由于纳米粒子爆炸、冲击波、气泡形成和热分解等多种因素，细胞膜受到损伤[40]。

在这项研究中，C 的死亡或活性降低。隐球菌 当细胞膜被热能分解和破坏时，细胞就会发生。但是，还需要进一步的研究来证实这一假设。 C.隐球菌 细胞受到以下因素的损害：局部温度升高、纳米粒子爆炸、冲击波、气泡形成和由 NIR 辐射引起的热分解。特别是，C.隐球菌 当仅暴露于 NIR 辐射时，细胞会受到严重损害。有两个可能的原因可以解释靶向 GNR-SiO2-Ab 如何通过引起 C 的光热破坏来刺激 NIR 辐射。隐球菌 细胞。一种可能性是在 C 的胶囊中。隐球菌 细胞，靶向 GNR-SiO2-Ab 诱导局部温度升高。第二种可能性是由于 GNR-SiO2-Ab 和 C 的胶囊之间的抗原-抗体反应。隐球菌 细胞，细胞壁和荚膜发生结构变化。由于这些变化，细胞对光热处理更敏感[41]。之前的研究已经证实了金纳米棒的低毒性 [22, 42, 43]，还需要进一步的研究来研究光热疗法在体内的效果。我们研究中最遗憾的是我们没有讨论 GNR-SiO2-Ab 的负载能力。进一步的研究将集中在GNR-SiO2-Ab的负载能力与光热效应之间的关系上。

结论

我们成功制造了针对C的GNR-SiO2-Ab。隐球菌 细胞。这些特异性抗体偶联的金纳米棒增强了 C 的 X 射线衰减。隐球菌 CT 图像中的细胞。我们的结果表明，由抗体介导的免疫 GNR 增加了 NIR 诱导的光热疗法在 C 中的作用。隐球菌 细胞。此外，GNR-SiO2-Ab 允许在C 的诊断和治疗中进行简单的操作和微创程序。隐球菌 感染，重点关注该方法的潜在临床应用。