荧光SnO₂/SiO₂纳米吸附剂实现高效GST标签蛋白捕获

摘要

我们报道了一种简易水热合成的巯基功能化二氧化硅纳米球（SiO₂-SH）平台，随后装饰SnO₂量子点（QDs）。所得SnO₂/SiO₂复合纳米球（NSs）显示强可见光响应荧光，可实时追踪蛋白捕获。还原型谷胱甘肽（GSH）功能化将NSs转化为SnO₂/SiO₂-GSH，专一结合谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签蛋白。应用于大肠杆菌裂解液时，纳米吸附剂表现出可忽略的非特异性吸附，蛋白结合容量7.4 mg g⁻¹，保持分离谷胱甘肽过氧化物酶3（GPX3）的氧化还原状态和过氧化物酶活性。这些特性使SnO₂/SiO₂-GSH NSs成为GST标签蛋白快速高产纯化的有前景工具。

研究背景

高效蛋白纯化支撑药物代谢、结构生物学和疫苗开发进步。传统色谱和沉淀法繁琐且常损害蛋白完整性。利用GST与其配体天然相互作用的亲和纯化仍是重组GST标签蛋白的金标准。然而，常规GST亲和树脂（如谷胱甘肽Sepharose 4B）存在结合容量有限、成本高、缺乏内在可视报告等局限。

纳米材料凭借高比表面积、可调化学性质，经适当设计可具备光学特征，可克服这些局限。SnO₂ QDs因化学稳定、生物相容、缺陷诱导荧光可用于成像，在生物应用中具吸引力。将SnO₂ QDs锚定于二氧化硅纳米球上，我们创建了双功能平台，耦合亲和捕获与荧光监测。

实验部分

材料与通用程序

所有试剂分析纯，无需进一步纯化直接使用。关键试剂包括CTAB、SnCl₄·5H₂O、TEOS、MPS、GSH。SnO₂ QDs通过水热法制备，随后表面连接至SiO₂-SH NSs并进一步GSH偶联。

SnO₂量子点合成

SnCl₄·5H₂O（3.5 g）溶于50 mL水；加氨水（5 mL）沉淀Sn(OH)₄，洗涤后重分散于30 mL水。用2 M NH₄OH调pH至12，转入聚四氟乙烯内衬高压釜，150 °C水热24 h。收集产物，乙醇-异丙醇（1:1）洗涤，干燥得SnO₂ QDs（~5 nm直径）。

SnO₂/SiO₂-SH纳米球制备

SnO₂ QDs（0.2 g）和CTAB（0.09 g）分散于水-乙醇混合液（42.5 mL+7 mL）。加入TEA（2.7 mL），继而TEOS（3.5 mL）和MPS（0.35 mL），60 °C搅拌5 h。离心、HCl-乙醇和水洗涤，重分散制得SnO₂/SiO₂-SH NSs（~460 nm直径）。

GSH功能化

SnO₂/SiO₂-SH NSs（4 mL，0.12 g mL⁻¹）在PBS（pH 7.4）中与GSH（16.7 mg mL⁻¹）37 °C孵育24 h。离心洗涤后，SnO₂/SiO₂-GSH NSs贮存于25%乙醇，4 °C。

GST标签蛋白亲和捕获

GST标签GPX3、OST1、ABI2从pGEX-6p1构建体在大肠杆菌BL21(DE3)表达。细胞裂解液（pH 7.4，0.01 M）与SnO₂/SiO₂-GSH NSs（1 mL）混合，4 °C旋转孵育2 h。离心洗涤后，用0.5 M GSH洗脱结合蛋白，BCA法定量，SDS-PAGE分析。

GPX3活性测定

纯化GPX3经PreScission蛋白酶切除标签，在硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和H₂O₂存在下监测340 nm NADPH消耗测定过氧化物酶活性。

氧化还原状态分析

GPX3样品经H₂O₂和DTT处理，非还原15% SDS-PAGE分离氧化和还原形式。

表征

透射电镜（JEM-2010）和扫描电镜（JSM 5600LV）观察形貌组成。XRD谱用X'Pert Philips衍射仪记录。荧光光谱用FluoroSENS分光计测定（激发260 nm）。蛋白纯度经SDS-PAGE（Power PAC 300）评估。BCA测定用北京CoWin试剂盒。

结果与讨论

纳米吸附剂形貌、结晶度与荧光

SnO₂ QDs呈单分散~5 nm球形，晶格间距0.29 nm（110晶面），确认高结晶度（图1）。XRD匹配方铅矿相（JCPDS 41-1445）。复合SnO₂/SiO₂-GSH NSs保持球形（~430 nm），表面适度粗糙，见SEM和TEM图像（图2）。TEM（图2c,d）确认SnO₂ QDs存在于SiO₂上。

荧光分析显示368 nm强发射峰，归因于SnO₂氧空位缺陷（图3b）。蛋白捕获后NSs荧光成像（图3c）显示发光完好，可视化追踪结合复合物。

蛋白捕获效率

SnO₂/SiO₂-GSH NSs捕获GST-GPX3的SDS-PAGE显示目标蛋白显著富集（图4a）。增加洗脱GSH浓度（10-100 mM）渐进释放结合蛋白，确认GSH-GST相互作用特异性。纳米吸附剂对大肠杆菌裂解液整体表现可忽略非特异性结合。

重复使用测试显示NSs三次连续捕获循环保持结合容量（图4b），凸显稳健性。

扩展至其他GST标签蛋白（OST1、ABI2）得类似结果（图5）。结合容量分别为7.4 mg g⁻¹（GPX3）、7.1 mg g⁻¹（OST1）、6.8 mg g⁻¹（ABI2），超越商业谷胱甘肽Sepharose 4B（分别7.1、6.9、5.6 mg mL⁻¹）。

GPX3氧化还原状态与活性保持

去除GST标签后，GPX3保留氧化和还原两种形式，非还原SDS-PAGE显示迁移率差异（图6a）。过氧化物酶活性测定（图6b）显示经SnO₂/SiO₂-GSH NSs分离的GPX3活性与商业树脂分离者相当，确认纳米吸附剂保留酶功能。

结论

我们开发了一种荧光、二氧化硅保护的SnO₂量子点纳米吸附剂，高特异性和容量捕获GST标签蛋白，同时保持其天然氧化还原状态和酶活性。平台的稳健可重复使用性、优越结合性能和内在荧光使其成为替代常规亲和树脂进行快速蛋白纯化的有吸引力选择。