基于高光谱成像的短波红外纳米探针在生物系统中的多重检测研究

摘要

利用外源发光体在短波红外光谱区（SWIR，约1000-1700 nm）发光进行光学生物成像是一个快速发展的领域，近期已报道多种SWIR光致发光纳米探针。高光谱成像（HSI）结合解混算法，是一种极具前景的工具，可根据光致发光（PL）光谱特征实现SWIR发光纳米制剂的高效多重成像。本文报道的SWIR HSI技术旨在实现两类纳米探针的多重检测：掺杂有机染料的聚合物纳米颗粒（PNPs）和稀土掺杂氟化物纳米颗粒（RENPs）。两类探针均在相同光谱范围（约900-1200 nm）展现PL，传统光学滤波器难以实现光谱分离，限制了其在生物组织中的多重成像应用。通过应用SWIR HSI，我们利用两者PL光谱轮廓的差异，实现了对每类纳米颗粒PL信号的光谱选择性和灵敏成像。对采集数据的解混使得光谱重叠的纳米探针能按其PL特征实现多重成像。从混合悬浮液中成功获取了每类纳米颗粒的定量分布和空间分布信息。最后，将SWIR HSI技术及解混协议应用于皮下注射PNPs和RENPs的小鼠体内成像，成功验证了高光谱技术在体内成像中实现SWIR PL纳米探针多重检测的可行性。

引言

生物医学成像技术近几十年快速发展，使得各类疾病的早期检测与评估成为可能。在各种成像模式中，光学成像凭借其高时空分辨率和相对低成本占据独特地位。基于光致发光（特别是荧光）的多种光学成像方法正在开发和临床转化中，如淋巴系统成像和术中荧光引导手术已显示出改善医疗的良好前景。同时，针对特定感兴趣区域（如肿瘤）的外源性光致发光探针也在积极开发用于体内和体外成像。除了对PL探针的常规要求（高吸收率、发射量子产率和光稳定性）外，PL发射的光谱位置和形状也是关键参数。众所周知，生物组织在近红外（NIR，约700-950 nm）光谱范围内的光衰减低于可见光范围，因此引入了生物组织的NIR透明窗口（约700-950 nm），大量研究致力于NIR发射探针的开发与应用。此外，近期进展导致第二和第三NIR窗口（NIR-II和NIR-III）在约1000-1700 nm光谱范围内被引入，通常称为短波红外（SWIR），特别是在红外成像快速发展的领域。尽管SWIR范围内水吸收高于传统NIR窗口，但生物组织较低的自发荧光和散射使得SWIR PL生物成像具有更优的成像分辨率和更大的成像深度。例如，利用新型SWIR荧光染料CH1055-PEG进行淋巴和脑血管SWIR PL成像时，其分辨率和信噪比优于使用NIR-I荧光染料吲哚菁绿的常规NIR PL成像。而且，戴课题组利用SWIR发射纳米探针（单壁碳纳米管）和SWIR成像相机，在无创（无需开颅）小鼠脑血管成像中实现了>2 mm深度下亚10 μm血管的可视化，这是可见光或NIR-I范围PL成像无法达到的。

具有第一NIR窗口强吸收和NIR-II窗口荧光的有机染料及染料复合物，可作为有前景的NIR-SWIR探针；它们已被证明是血管和淋巴结成像、肿瘤边界界定及图像引导手术的优异对比剂。值得注意的是，有机染料吲哚菁绿（ICG）目前是美国FDA批准用于人体的唯一NIR荧光对比剂。但分子成像探针（染料或染料复合物）存在局限性，需通过修饰分子结构来改变生物探针特性（如水溶性、细胞渗透性等）或赋予其他成像或靶向模式。相比之下，包含PL中心的纳米颗粒（NPs）可通过共价修饰表面基团实现水分散性和稳定性改善、表面电荷控制或靶向功能。此外，NIR-SWIR PL纳米平台的引入允许将PL成像与其他成像、诊断或治疗模式结合。近期研究报道了利用SWIR发射纳米制剂进行深层组织、全身、肿瘤或经颅成像，以监测体内各种过程。在各类报道的用于体内成像的NIR-SWIR发射纳米探针中，可区分两类：一类源于有机部分（如共轭聚合物）的NIR-SWIR荧光，另一类源于掺杂稀土离子的陶瓷（如氟化物）纳米晶体。聚合物基纳米颗粒（PNPs）因合成和化学修饰相对容易、生物相容性和可降解性优异，是临床转化最成功的纳米药物之一。当负载NIR-SWIR荧光团时，PNPs可作为有前景的成像探针或图像引导药物递送载体。另一方面，稀土离子掺杂纳米颗粒（RENPs）是一类知名纳米探针，具有通过上转换（反斯托克斯位移）和下转换（斯托克斯位移）过程可获得的独特光致发光特性。近期，RENPs已转化用于NIR-SWIR成像。与基于有机部分的NIR-SWIR探针相比，它们具有高量子产率、卓越光稳定性，且全NIR-SWIR光谱区窄发射带可通过掺杂不同离子调控。RENPs已应用于小动物血管和器官成像、肿瘤检测、多重和多光谱成像。

随着PL生物成像的新兴发展，为不同目的（如靶向成像特定细胞或器官结合图像引导药物递送）可能需要同时追踪体内多个PL基团。为此开发了多重成像方法。多重成像指生物系统解剖和功能信息的互补性；其应用可结合成像生物标志物、对比度和模式，提高成像在研究和临床中的效用。多重PL成像可增强纳米医学的诊疗维度，提供引入多种PL成像对比度并结合治疗模式的能力。最常用的多重成像方法通过PL发射的光谱位置区分PL探针，使用适当光学滤波器。但这种方法要求纳米探针具有光谱窄、不重叠的PL光谱。在这方面，高光谱成像（HSI）结合光谱混合分析算法是PL多重成像的有前景工具。然而，PL HSI的生物医学应用主要局限于荧光显微镜，用于多重不同类型纳米探针及消除背景和自发荧光。关于体内HSI，最常用反射成像模式，通过采集和顺序分析组织反射光谱，尽管也有报道在可见光和NIR范围进行体内HSI成像（也称多光谱成像）用于PL。但文献中未见SWIR发射纳米探针HSI的报道。

近期，我们报道了基于带序贯采集的HSI系统结合光谱解混软件用于SWIR PL成像。带序贯HSI过程基于通过具有光谱可变透射率的元件（即液晶可调谐滤波器LCTF）连续采集二维图像。从RENPs悬浮液获得的SWIR PL数据呈现为包含两个空间维度和一个光谱维度的三维光谱数据立方体（超立方体）。进一步将光谱解混过程应用于采集超立方体的每个空间像素，可计算PL混合物中各组分的丰度。在此，我们应用HSI解决体内SWIR PL生物成像中纳米探针的多重检测问题。我们使用了两类SWIR发射纳米颗粒，其发射光谱重叠，尽管光谱轮廓不同，但常规PL成像配合光学滤波器难以区分。图1展示了这些纳米颗粒PL光谱混合的问题及利用带序贯解混HSI克服的方法。

HSI被应用于获取两类纳米颗粒的光谱选择性和灵敏PL成像。为解混SWIR PL光谱轮廓，我们开发了解混协议，从而获得混合物中各组分的定量和空间分布映射，包括强度分布和丰度的确定。SWIR HSI技术及开发的解混协议进一步应用于皮下注射纳米颗粒小鼠的体内成像，证明了HSI在体内成像中实现SWIR PL纳米探针多重检测的适用性。

材料与方法

纳米制剂制备与表征

掺杂有机荧光NIR-SWIR染料的聚合物核壳纳米颗粒合成

聚苯乙烯（PS）-聚N-异丙基丙烯酰胺（PNIPAM）核壳纳米颗粒通过微乳液聚合合成，并对先前方法进行了改良。首先制备PS-co-PNIPAM（10 wt.% PNIPAM）核纳米颗粒。将NIPAM（0.1 g）、十二烷基硫酸钠SDS（0.1 g）和0.005 g NaH₂PO₄·H₂O溶于45 ml水中。升温至60°C剧烈搅拌下滴加苯乙烯（1 g）。随后通入Ar气30 min，升温至70°C，注入0.08 g K₂S₂O₈（溶于1 ml水）引发聚合。第二步在PS-co-PNIPAM核上层聚PNIPAM壳。向反应器注入单体NIPAM（1.8 g）和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（BIS，0.18 g）的水溶液（4 ml水）。反应在70°C继续4 h。冷却至室温后，使用MWCO 3500 Da的纤维素膜透析74 h。结果制得PS-PNIPAM纳米颗粒悬浮液；透射电镜（TEM）图像清晰显示核壳结构（图3a）。为获得NIR-SWIR荧光PNPs，将2-丁基-6-[5-(2-丁基-1,3-二甲基环庚[c]咯啉-6(2H)-亚基)戊二烯-1-基]-1,3-二甲基环庚[c]咯啉四氟硼酸盐（标记为JB9-08）荧光染料后负载到PS-PNIPAM纳米颗粒中。向2 ml 0.25 wt% PNPs水悬浮液加入8 μl 1 mM JB9-08 DMF溶液，静置24 h后使用。

核壳RENPs合成

RENPs按文献改良方案合成。首先通过金属三氟乙酸酯高温分解制备α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺核纳米颗粒。典型过程：将0.05 mmol Yb₂O₃、0.15 mmol Nd₂O₃和0.25 mmol Y₂O₃装入含5 ml去离子水和5 ml TFA的250 ml烧瓶，90°C加热1 h得澄清溶液。在Ar吹扫下该温度蒸发得泥状RE(TFA)₃粉末。随后加入8 ml OA、8 ml OM、12 ml ODE和2 mmol NaTFA，升温至120°C保持30 min，再升至300°C保持30 min后自然冷却。全程Ar气氛保护。所得纳米颗粒用20 ml乙醇沉淀，离心洗涤乙醇三次，收集白色粉末分散于10 ml正己烷备用。

第二步通过种子介导外延生长制备α-NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺@CaF₂核壳RENPs。制备壳前驱体：2 mmol CaO与5 ml去离子水和5 ml TFA在250 ml烧瓶中90°C加热1 h得澄清溶液，蒸发得壳前驱体钙三氟乙酸酯Ca(TFA)₂。随后加入0.5 mmol NaYF₄: 10%Yb³⁺, 30%Nd³⁺核纳米颗粒、7 ml OA和7 ml ODE，120°C保持30 min，升至300°C保持60 min后自然冷却。全程Ar气氛。所得核壳纳米颗粒用20 ml乙醇沉淀，离心洗涤乙醇三次，收集分散于10 ml正己烷。为制备水分散液，将5 ml正己烷分散液与5 ml 0.1 M硝基铵四氟硼酸盐（NOBF₄）DMF溶液混合，轻摇至观察到RENPs沉淀。加入甲苯和正己烷（1:1体积比），10000 rpm离心10 min。收集沉淀分散于5 ml DMF。其次，向5 ml NOBF₄处理RENPs的DMF溶液加入250 mg聚丙烯酸（PAA，MW=18,000），80°C剧烈搅拌30 min。用丙酮沉淀NPs，乙醇洗涤，最终分散于蒸馏水。

透射电子显微镜

利用透射电镜（TEM）评估PNPs和RENPs形貌。取10 μl纳米颗粒悬浮液滴加在福尔马稳定的碳载膜上。为观察PNPs核壳结构，滴加前用1%磷钨酸水溶液负染。碳载膜自然干燥并用5 μl纯水洗涤。在JEM-1230（JEOL）透射电镜上以100 kV加速电压成像。

光致发光光谱

使用配备iHR320光谱仪（Horiba）的Fluorolog-3分光荧光计测量两类纳米颗粒在NIR和SWIR范围的PL光谱；用808 nm光纤耦合激光二极管（QSP-808-4，QPhotonics）激发PNPs和RENPs的PL。

高光谱成像系统

自制SWIR HSI系统采用带序贯采集法（图2），包含NIR相机（Xeva-1.7-320，Xenics，比利时）、聚焦光学器件（TEC-M55MPW，Computar，美国）和液晶可调谐滤波器（Varispec LNIR 20-HC-20，PerkinElmer，美国）作为色散元件。系统分辨率340×258像素，工作光谱范围900-1700 nm。光源包括白炽灯（用于图像对齐、聚焦和明场成像）和808 nm光纤耦合激光二极管（QSP-808-4，QPhotonics，美国），配合激光电源（Laser Source 4308，Arroyo Instruments，美国）用于PL成像激发。光谱数据立方体采集通过LCTF在900-1200 nm范围内以20 nm光谱宽度、10 nm步长顺序调谐透射率并捕获对应图像完成。NIR相机曝光时间设为200 ms。样品上激光功率密度固定约100 mW/cm²。为采集全NIR-SWIR范围PL图像，LCTF替换为850 nm长通滤波器（Edmund Optics，美国）。

光谱解混软件

使用MATLAB环境开发光谱解混算法分析获取的光谱数据立方体。每个像素的光谱视为已知端元的线性混合：F(λ)=ΣaᵢGᵢ(λ)，其中F(λ)为像素光谱，Gᵢ为端元光谱，aᵢ为端元丰度。解混软件旨在通过求解每个像素的线性光谱混合分析（LSMA）问题估算已知端元丰度。设L为光谱波段数，p为混合物中端元数。LSMA问题表述为F = Ga + n，其中F为L×1像素强度向量，G为L×p包含所有端元向量的矩阵，a为p×1未知丰度向量，n为L×1误差向量。基于最小二乘误差（LSE）的求解方法形成优化任务：minₐ{(F-Ga)ᵀ(F-Ga)}，经典解为a(r)=(GᵀG)⁻¹GᵀF。但该解可能包含无物理意义的负丰度值。为解决此问题，需修改LSE优化任务：minₐ{(F-Ga)ᵀ(F-Ga)}，约束条件a≥0。我们利用基于非负约束线性光谱混合分析（NC-LSMA）的迭代算法求解，详见文献[49,50]。计算每个组分丰度后，将其映射为二维颜色图。最终解混软件基于获得的丰度输出对应组分的强度图像：Iᵢ(x,y)=aᵢ(x,y)ΣλGᵢ(λ)，其中Iᵢ(x,y)为第i个端元在该像素的积分强度，aᵢ(x,y)为第i个丰度。

动物实验

BALB/c裸鼠（来源：Jackson实验室，美国）在黑暗无菌条件下饲养。所有动物实验符合中国国家实验动物饲养使用管理条例。成像前，6周龄雄性裸鼠（20±2 g）经腹腔注射5%氯醛（0.06 ml/g体重）麻醉。体内SWIR PL成像时，纳米颗粒悬浮于10×磷酸盐缓冲液（PBS），每只小鼠皮下注射100 μl PNPs、RENPs或其混合物PBS悬浮液。

结果与讨论

为HSI制备两类SWIR光致发光NPs：(1)后负载JB9-08染料的PNPs，该染料在水溶液中几乎无荧光，但经我们证实通过后负载进入PNPs聚合物基质可恢复水中荧光（图3a、b）；(2)PAA包覆的NaYF₄:10%Yb³⁺,30%Nd³⁺@CaF₂核壳稀土离子掺杂纳米颗粒（RENPs，图3c、d）。RENPs核中Nd³⁺离子可用~808 nm光激发（⁴I₉/₂→⁴F₅/₂跃迁），将能量转移给Yb³⁺离子，后者在950-1100 nm范围发射，峰值约975 nm（²F₅/₂→²F₇/₂跃迁）。RENPs核包覆惰性CaF₂壳以减少表面缺陷和环境相互作用导致的非辐射损耗。两种纳米制剂在808 nm激发下均在900-1200 nm范围展现光致发光（图3e）。

需注意：用分光荧光计测得的纳米颗粒PL发射光谱不能直接作为解混软件的端元，原因有二。第一，HSI系统灵敏度未经光谱校正，不同于常规分光荧光计，两种采集方法得到的发射光谱轮廓不同。第二，HSI帧以10 nm步长采集，而LCTF光谱带宽为20 nm，导致相邻帧信号重叠，使得获取的光谱轮廓与分光荧光计测得的相比失真。为克服这些障碍，端元（PNPs和RENPs样品的光谱轮廓）直接用HSI系统采集。为此，将两类纳米探针悬浮于PBS并置于微量离心管中（图4a）。常规PL成像难以区分两个样品，因其PL发射光谱重叠（图4b和图3e）。使用HSI系统，在900-1200 nm光谱范围以10 nm步长采集31幅PL图像（图4c）。通过超立方体光谱维度平均红、蓝、绿方框标记区域的信号，计算PNPs、RENPs和背景（BG）的光谱轮廓（图4b）。获得的PNPs和RENPs光谱轮廓（图4d）与分光荧光计测得相似，后用作光谱解混的端元。此后，以PNPs、RENPs和BG光谱轮廓为端元，计算并映射对应组分丰度为二维颜色图（图4e）。每个超立方体空间像素的丰度计算值在0-1之间，0和1分别表示该组分完全缺失和完全丰富。每个像素所有组分丰度之和为1。解混软件利用光谱维度最大强度阈值消除低强度像素误差：若像素沿光谱维度最大强度小于整个超立方体最大值的5%，则视为完全富含噪声组分。进一步结合对应丰度并消除背景组分，计算PNPs和RENPs的积分强度图像（图4f）。符合预期，丰度映射和积分强度图像均显示右管PNPs完全丰富、左管RENPs完全丰富，仅有PL发射散射和解混算法不完美导致的轻微误差。

光谱解混还能区分PNPs和RENPs的混合物。为此，三个微量离心管分别装入PNPs、RENPs及其混合物溶液。超立方体采集和光谱解混后，丰度映射显示第一管PNPs完全存在、第二管RENPs完全存在、第三管两者混合（图5a）。进一步重建强度图像以揭示样品中PNPs和RENPs PL信号的强度分布（图5b）。

我们进一步演示了HIS方法在体内SWIR PL成像中多重光谱重叠纳米探针的适用性。裸鼠麻醉后皮下注射PNPs、RENPs及其混合物。使用850 nm长通滤波器的NIR成像显示三个无法区分的发光斑点（图6a）。HSI采集和分析后，丰度映射显示顶部注射部位PNPs完全丰富、底部注射部位RENPs完全丰富、左侧注射部位识别为两者混合（图6b）。此外，执行强度重建以获取PL强度分布（图6c）。将解混软件阈值调整至15%（经验估计），可去除发射斑点相邻区域的噪声（图6d）。结果表明，与使用长通或带通光学滤波器的常规PL成像模式不同，HSI不仅能绘制样品强度分布，还能通过识别每个图像像素的光谱强度轮廓来多重检测混合物中的组分。

因此，HSI采集结合光谱解混处理成功实现了光谱重叠SWIR PL纳米探针的多重成像。关于HSI模式适用性仍需考虑几个问题。第一，因光谱窄带采集，每帧HSI信号强度相对较低（特别是有机基团宽谱PL发射时）。此外，生物成像中增加PL激发激光功率受限于组织损伤（光毒性）风险。这导致对PL探针亮度和光稳定性要求更高，因HSI采集时间可能比常规PL成像长一个数量级。还应注意，线性混合分析和光谱解混算法在组织透射率变化不大的光谱范围内可满意工作。反之，若HSI光谱范围内组织透射率有显著特征（特别是深层组织），线性光谱混合模型可能难以适用，需考虑非线性模型。

结论

总之，我们开发了一种高光谱SWIR生物成像技术，并将其应用于SWIR光谱范围发射纳米颗粒的多重检测。两类PL光谱重叠、常规成像无法区分的纳米颗粒，通过高光谱采集结合线性光谱混合分析算法，按其PL光谱轮廓成功实现多重成像。该方法在样品悬浮液和小动物注射体内均成功实现SWIR PL纳米颗粒的多重成像。鉴于SWIR生物成像具有更高分辨率和更大成像深度，SWIR HSI方法在需要利用NIR-SWIR PL纳米探针进行多重成像的各类应用中具有巨大潜力。此外，SWIR生物成像处于早期阶段，PL探针结合HSI的生物医学应用开发空间广阔。

数据与材料可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在已发表文章中。

缩略语

BG:

背景

HSI:

高光谱成像

LCTF:

液晶可调谐滤波器

NIR:

近红外

NPs:

纳米颗粒

PL:

光致发光

PNIPAM:

聚N-异丙基丙烯酰胺

PNPs:

聚合物纳米颗粒

PS:

聚苯乙烯

RENPs:

稀土掺杂氟化物纳米颗粒

SWIR:

短波红外

TEM:

透射电子显微镜