纳米粘土：针对COVID-19的潜在纳米免疫防御策略

摘要

尽管投入了大量努力，但开发有效的COVID-19疫苗可能仍需较长时间。人类已有使用经验的传统/天然药物可能成为更早的解决方案。基于研究团队利用纳米粘土作为高亲和力材料治疗癌症转移、黑色素瘤和骨再生的经验，我们提出利用这些纳米粘土用于COVID-19的预防/治疗。凭借高亲和力，纳米粘土可在病毒与人类hACE2结合前将其捕获。本研究通过分子级模拟建模，分析了冠状病毒刺突蛋白与hACE2蛋白在有无纳米粘土情况下的相互作用。结果显示，SARS-CoV-2刺突蛋白与纳米粘土之间表现出极高的亲和力/内聚力，远超其与hACE2的结合力。我们推测，这些已作为药物载体应用的纳米粘土，也可作为“单独粘土”药物注射给药。文中还为未来的体外和体内研究提供了建议。

背景

新型冠状病毒SARS-CoV-2的突然出现和快速传播，严重威胁人类健康与生命，并重创全球经济。SARS-CoV-2刺突蛋白S以高亲和力结合人血管紧张素转换酶2（hACE2），将其作为入侵靶细胞的受体（图1a、b）[1]。病毒表面刺突蛋白介导冠状病毒进入宿主细胞。SARS-CoV-2刺突蛋白含受体结合域（RBD），可特异性识别hACE2 [2, 3]。hACE2表面存在两个病毒结合热点，对SARS-CoV-2 S结合至关重要。SARS-CoV-2 RBD中多个天然选择的突变环绕这些热点，调控其感染性、致病性及跨物种和人际传播 [2, 4, 5]。

目前尚无专门针对SARS-CoV-2的获批疫苗或药物。按常规疫苗开发流程，可能需要很长时间才能获得有效疫苗。开发针对SARS-CoV-2的治疗性抗体备受关注，但尽管努力众多，此类抗体尚未被发现 [6]，仅有少数试验 [7]。一项试验显示，通过结合S糖蛋白的RBD可强效中和SARS-CoV-2 [8]。该试验推荐使用抗体鸡尾酒疗法（多种抗体混合物），因其对SARS-CoV-2的中和效果更强。然而，过往利用SARS-CoV康复者抗体治疗SARS-CoV感染曾出现抗体依赖性增强（ADE）等不良反应，导致病毒感染力增强及其他有害免疫反应 [7]。此外，基于SARS-CoV和MERS疫苗开发经验，针对SARS-CoV-2的研发成功率似乎较低。因此，具有安全食用/服用历史的天然/传统药物可作为SARS-CoV-2治疗选项之一。基于其天然材料属性及人类使用史，我们建议使用“高电荷纳米粘土”作为冠状病毒阻断剂和刺突蛋白介导的细胞进入抑制剂。

纳米粘土源自沉积岩矿物的纳米级天然材料，对细菌和病毒具有极高亲和力 [9]。因分子结构中的同质异形置换，纳米粘土表面呈电荷缺乏状态。这种电荷缺乏被水分子和溶解阳离子中和（图2）。带电结构和巨大比表面积赋予粘土纳米颗粒对带电实体（如细菌表面及毒素）的亲和力。其独特的生物医学性质包括高吸附性、吞噬微生物能力及无毒性。每种带电活性粘土矿物均有独特形态、特性和相互作用行为。纳米粘土研究最多的生物医学应用是作为抗癌药物（如5-氟尿嘧啶和曲妥珠单抗）的载体和复合物 [11-17]，因此成为多种疾病的潜力替代药物 [18-22]。粘土纳米颗粒因粘附性也被用作缓释药物载体 [15, 23]。纳米粘土还成功用于吸附治疗牛轮状病毒和牛冠状病毒 [24]。研究者 [25] 将抗癌药甲氨蝶呤（MTX）插层入阴离子粘土制成纳米杂化药物，采用共沉淀和后续水热法制备了化学、结构和形态明确的二维药物-粘土纳米杂化物。研究者 [26] 发现因生物相容性和高载药量，膨润土纳米粘土可用于制备药物递送载体，他们制备了多柔比星-膨润土纳米粘土复合物（DOX-Bent复合物），形成黑色素瘤肿瘤内化疗的缓释药物递送系统。蒙脱石粘土近期被研究作为添加剂和药物载体材料，这些纳米粘土复合物因可控释药而在各种给药形式中极具吸引力 [27]。研究者 [28] 还发现纳米粘土可用于新型双功能药物递送系统（DDSs），提高药物递送效率并降低治疗甲状腺癌的多柔比星（DOX）毒性。研究者 [29] 利用12种单-单型光裂两亲性Janus树枝分子库，开发了自组装光响应树枝脂质体囊泡平台。类似纳米粘土，表面修饰的生物活性病毒模拟有机纳米囊泡（源自糖基树枝脂质体）具有结构修饰，可表现SARS-CoV-2与宿主致病分子相互作用，帮助病毒逃避人类免疫系统 [30]。

通过大量前期研究，我们建立了带电粘土矿物的基本表征和行为建模 [31-33]，及其在癌症转移控制 [10]、黑色素瘤体外体内治疗 [34]、钙沉积/骨再生 [35] 中的应用。作者先前研究 [35] 表明纳米粘土对带电表面有高亲和力。纳米粘土的高吸引亲和力和癌细胞增加的非特异性粘附引力，使其成为控制癌症转移的理想候选者。该研究展示了两种带电粘土矿物控制癌细胞转移的潜力：Na-蒙脱石（SWy-3）和帕利哥石（PFl-l）。进一步基于作者前期研究 [35] 关于纳米粘土控制癌症转移的发现，我们通过体外体内研究证实这些纳米粘土对黑色素瘤癌细胞有抑制作用，主要体现在细胞增殖和活力上 [34]。这些前期研究除实验室实验外，还进行了纳米粘土与细胞相互作用的分子级模拟，为有无粘土纳米颗粒时的相互作用亲和力/内聚力水平提供评估。

基于作者对纳米粘土高亲和力潜力的所有经验，我们提出纳米粘土可模拟抗体，从而在病毒与人类hACE2结合前吸引并吞噬冠状病毒。本文通过分子级模拟建模方法，迈出验证这一认知的第一步。基于分子级模拟结果，也为下一阶段体外体内研究提供了建议大纲。因这些纳米粘土已成功用作药物载体，我们推测其也可作为“单独粘土”药物注射/口服，因此提出了用于此目的的纳米粘土给药方法学初步方案。

材料——分子

SARS-CoV-2与hACE2的选择与构建

从蛋白质数据库网站RCSB获取SARS-CoV-2刺突S和hACE2分子 [36-38]。使用Materials Studio软件 [39] 构建的SARS-CoV-2刺突S和hACE2分子模型分别如图3a、b所示。模拟前，这些分子经软件的电荷平衡法（QEq）进行电荷处理。

纳米粘土结晶体的选择与构建

选用蒙脱石族中最活跃的成员之一Na-蒙脱石进行研究。Na-蒙脱石是层状叶硅酸盐粘土蒙脱石（图2）。胶体形式下，相邻层间可含自由钠、钙或镁阳离子，静电吸附于外部负电表面 [40]。干粉状态下，Na-蒙脱石呈等维薄片/片层，尺寸约0.5×0.5×0.001微米（图2a）。这些层间表面负电荷由阳离子平衡。作为胶体时，层间阳离子从粘土颗粒解离并与其他负电表面结合。这些颗粒因末端断键存在而带正电边缘。这些纳米粘土的形态及进一步特性见表1，其结晶体在Materials Studio软件中的构建方法如下所述。

软件中基于阳离子交换量（CEC）、可交换阳离子、层间电荷等基本性质构建Na-蒙脱石结晶体（表1）。分子/结晶体尺寸基于动态光散射（DLS）技术的粒度分析结果选定 [10]。软件中创建的最终粘土结晶体形式如图3c所示。利用固有属性在软件设计模式制备这些结晶体后，再经软件的QEq法进行电荷处理。

方法——分子级模拟

本部分包含SARS-CoV-2刺突S与粘土结晶体及hACE2相互作用的模拟与评估。尽管这些模型可能非实际体外条件的完全复制，但已包含所有必要相互作用，非常适合预期的相对比较研究。

软件中利用蒙特卡洛（MC）和分子力学（MM）技术，进行SARS-CoV-2 S、Na-蒙脱石结晶体、hACE2构型的吸附模拟。所有模拟构型的亲和力增强通过计算内聚能密度（CED）评估——CED被视为分子体系内聚性的度量。因涉及大规模计算，这些计算在KFUPM、KSA的高性能计算设施（HPC）上进行。总体方法论、特定方法选择和模拟参数基于作者前期研究 [41-47]，详见后续章节。

SARS-CoV-2刺突（S）与hACE2及粘土结晶体的相互作用

为模拟SARS-CoV-2 S与粘土结晶体相互作用，将不同数量的Na-蒙脱石粘土结晶体吸附于SARS-CoV-2 S模型。吸附模拟选用Metropolis蒙特卡洛法（软件吸附模块）。每步吸附中，粘土结晶体占据刺突S模型周围空间以降低复合物总能量。在最多25,000步内吸附所需结晶体数量，随后用软件Forcite模块基于分子动力学（MD）原理最小化体系能量。对SARS-CoV-2刺突分子与hACE2的相互作用建模重复类似吸附过程。此过程将hACE2分子吸附于SARS-CoV-2刺突S的RBD周围。吸附完成后，用软件基于MD的模块最小化构型能量。

软件Forcite模块结合NPT（恒定粒子数、压力、温度）系综用于MD模拟，采用修正通用力场 [41]。模拟运行5-30 ps，间隔0.5 fs或至体积恒定。用衰减常数0.1 ps的Berendsen温控器控制模拟温度。MD模拟中假设温度恒定310 K（37°C），压力为大气压（100 kPa）。用衰减常数0.1 ps的Berendsen压力控制器控制体系压力。经多次尝试软件中其他温控器和压力控制器后，Berendsen方法被认为最适合单一结晶体。蒙特卡洛法中，交换、构象、旋转、平移、再生长的比率参数分别选为0.39、0.2、0.2、0.2、0.2，对应概率相同。旋转和平移振幅分别为5°和1 Å。

内聚能密度（CED）测量

本研究通过CED变化测量SARS-CoV-2-粘土结晶体和SARS-CoV-2-hACE2复合物的亲和力/结合水平。粘土结晶体吸附及后续各构型分子动力学完成后，用Forcite模块的内聚能密度选项确定CED。作者经验表明，包含总计、范德华和静电CED的CED概念，能相当贴切地解释各种分子级过程和相互作用，模拟模拟复合物间亲和力/结合程度 [41-47]。定量上，CED定义为1摩尔物质从液相向气相转变所需能量。也是分子间相互亲和/吸引力的度量，以静电和范德华力在NPT系综平均值表示。

Forcite模块中，范德华能用基于原子的截断法评估。此法将非键相互作用简单计算至截断距离，忽略此距离外相互作用。为避免直接截断造成的不连续性，多数模拟用切换函数在一定距离范围内平滑关闭非键相互作用。通过实际势乘以平滑函数创建有效势。中间范围函数选择至关重要，应在该区域连续可微以便计算力。本研究使用三次样条平滑函数，样条宽度1 Å，截断距离12.5 Å。

结果与讨论

SARS-CoV-2 S-hACE2复合物最终构型如图4a所示，SARS-CoV-2刺突蛋白与不同数量Na-蒙脱石粘土结晶体的复合物分别如图4b、c所示。为比较，不同比例/数量粘土结晶体在SARS-CoV-2刺突蛋白上的总CED，及其与hACE2相互作用的CED绘制于图5。

基于经验，我们假设纳米粘土凭借高粘附性也可作为SARS-CoV-2抑制剂。其可通过强力结合SARS-CoV-2表面的刺突S发挥作用。分子级模拟结果显示，SARS-CoV-2与纳米粘土间极高CED远超其与hACE2间CED（图5），故可抑制SARS-CoV-2与hACE2结合。此外，图5显示纳米粘土的抑制程度随数量（剂量）依赖性增加。

纳米粘土与SARS-CoV-2刺突S的相互作用

作者早期研究已证实纳米粘土促进癌细胞与微环境粘附以控制转移 [10]。75/25比例Na-蒙脱石和帕利哥石混合物的粘附测量显示，癌细胞与细胞外基质蛋白间粘附增加100%（图6a）。图6b显示纳米粘土结合Raji细胞和纤连蛋白的SEM图像。样品成像在Miller医学院、迈阿密大学佛罗里达分校的FEI ESEM-FEG XL-30 SEM模式下进行。作者前期研究还发现静电、范德华和ZP吸引力主导粘附过程 [10]。我们推断相同机制也促进纳米粘土粘附表面与SARS-CoV-2刺突蛋白结合（图7）。ZP衡量胶体形式下分散或絮凝倾向，包括与悬浮介质中其他成分相互作用。通常ZP大于30 mV（正或负）指示分散倾向，小于5 mV通常导致团聚。研究中用的粘土纳米颗粒较高分散倾向ZP（-24至-32 mV）导致更高分散倾向，从而产生更大比表面积放大与SARS-CoV-2刺突蛋白的相互作用。虽基于ZP Na-蒙脱石纳米颗粒具亲水性，但在盐存在下也促进疏水和亲水表面间二级粘附机制 [10]。还应注意这些粘土纳米颗粒因亲水性和相对较高排斥酸碱（AB）相互作用而有高分散倾向（表1）。高分散产生高比表面积增加吸引相互作用。较大比表面积因范德华吸引力和相反电荷表面间静电力促进更大吸引力。此外，虽程度较低，Na-蒙脱石颗粒带正电边缘也被刺突S静电吸引。

SARS-CoV-2刺突S与粘土结晶体相互作用的分子级模拟结果（图5）也证实上述相互作用行为。观察到粘土纳米颗粒吸附形成紧密相互作用的强范德华吸引场。这些范德华吸引场产生粘土/SARS-CoV-2构型的更高CED。加入粘土结晶体后总CED大幅增加（图5）也证明SARS-CoV-2与这些颗粒亲和力极高，远超其与hACE2亲和力。

纳米粘土作为拟抗体

基于作者所有前期研究确立的纳米粘土高亲和力潜力，我们推测纳米粘土可模拟抗体，从而在病毒与人类hACE2结合前吸引并吞噬冠状病毒。抗体是浆细胞合成的糖蛋白，作为适应性免疫反应一部分协助清除体内感染。抗体通过多种方式协助清除感染，如调理作用促进吞噬、激活补体系统、凝集微生物、中和病毒和毒素。当结合病毒表面蛋白时，抗体通过阻止病毒附着于细胞靶受体来阻断病毒入胞。抗体结合可发生在表面蛋白不同位点，导致不同机制但产生相同效果。针对SARS-CoV-2，观察到两种抗体病毒中和机制 [1, 48]（图1c、d）。一种机制涉及抗体直接结合SARS-CoV-2-RBD结合位点，导致抗体与靶受体hACE2竞争。另一种机制涉及抗体结合RBD非受体结合位点，不与靶受体竞争。后者被发现参与研究中最强效单克隆抗体（mAb）的中和作用 [1, 48]。类似抗体与SARS-CoV-2 RBD相互作用抑制其与hACE2结合，我们为纳米粘土建立类似分子级模型，导致冠状病毒类似抑制（图8）。凭借极高亲和力，纳米粘土会被SARS-CoV-2刺突吸引，从而限制这些刺突RBD与hACE2结合。

拟议纳米粘土给药方法学

粘土作为药物载体已多次测试，显示对人体细胞几乎无细胞毒性的良好结果。高岭石粘土矿物测试用于潜在药物递送系统，显示高生物相容性和极低细胞毒性 [11]。聚（d,l-内酯-共-乙醇酸）/蒙脱石纳米颗粒体外细胞毒性也被证明可忽略 [14]。帕利哥石-聚乙烯亚胺-荧光素异硫氰酸酯纳米复合物体外也表现几乎无细胞毒性 [13]。作者在体内研究中也有皮下注射纳米粘土治疗黑色素瘤经验 [34]。基于粘土作为癌症药物载体及其他缓释药物应用 [25-28]，我们提出纳米粘土经体内和临床试验验证后，可作为“单独粘土”药物注射给药。

尽管纳米粘土不可生物降解，但研究 [49] 对类似无机纳米颗粒设计及其在体内代谢性能的综合理解，也可将这些纳米粘土归类为人体可清除的无机制剂。

结论与建议

基于作者所有前期研究确立的纳米粘土高亲和力潜力，这些纳米粘土可模拟抗体，从而在病毒与人类hACE2结合前吸引并吞噬冠状病毒。

SARS-CoV-2刺突S与粘土结晶体相互作用的分子级模拟结果形成紧密相互作用的强范德华吸引场。这些范德华吸引场产生粘土/SARS-CoV-2构型的更高CED。加入粘土结晶体后总CED大幅增加，证明SARS-CoV-2与这些颗粒亲和力极高，远超其与hACE2亲和力。

我们建议继续研究，开展SARS-CoV-2与不同百分比纳米粘土的体外相互作用研究。基于体外阶段确定的纳米粘土最佳剂量，建议在动物身上进行体内研究。动物研究应同时设置有无纳米粘土组，以最终确定纳米粘土剂量，为临床试验奠定基础。

数据与材料可用性

本研究期间生成或分析的所有数据均包含在已发表文章中。